白藜蘆醇對大鼠腦缺血性損傷中TNF-α和IL-6水平的影響

郭 勇，楊 茜，張 杰 ，郭 唯，李 婧

(1.河北省石家莊市第一醫院醫務處，河北 石家莊 050011；2. 河北省石家莊市第一醫院神經內科，河北 石家莊 050011；3.河北省石家莊市第一醫院檢驗科，河北 石家莊 050011；4.河北省深州市醫院檢驗科，河北 深州 053800)

·論著·

白藜蘆醇對大鼠腦缺血性損傷中TNF-α和IL-6水平的影響

郭 勇1，楊 茜2*，張 杰3，郭 唯4，李 婧2

(1.河北省石家莊市第一醫院醫務處，河北 石家莊 050011；2. 河北省石家莊市第一醫院神經內科，河北 石家莊 050011；3.河北省石家莊市第一醫院檢驗科，河北 石家莊 050011；4.河北省深州市醫院檢驗科，河北 深州 053800)

目的探討白藜蘆醇對大鼠腦缺血損傷中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和白細胞介素6(inter leukin 6,IL-6)水平的影響。方法36只大鼠制作成腦組織缺血模型，分為A組、B組、C組，每組12只，A組為對照組未治療，B組和C組給予白藜蘆醇25 mg/kg和白藜蘆醇50 mg/kg，應用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定法檢測腦組織勻漿中TNF-α和IL-6水平，檢測白藜蘆醇對細胞增殖的抑制作用。結果B組和C組大鼠腦組織中TNF-α和IL-6水平明顯低于A組，C組大鼠腦組織中TNF-α和IL-6水平又低于B組，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論白藜蘆醇通過抑制腦部TNF-α、IL-6表達水平，減輕腦部炎癥程度，改善腦缺血，值得臨床應用。

腦缺血；白藜蘆醇；細胞因子類；大鼠

缺血性腦損傷過程中存在氧化應激引起的腦微血管內皮細胞的損傷[1]。腦缺血時，細胞興奮毒性增強和能量衰竭，可觸發腦實質內的炎癥反應，腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactoralpha,TNF-α)和白細胞介素6(interleukin6,IL-6)等細胞因子參與機體的炎癥反應，在腦缺血損傷狀態下TNF-α和IL-6的表達增加，加重了組織細胞損傷。為了重建或恢復細胞功能，應在腦缺血后盡快啟動干預措施[2]。而白藜蘆醇具有抗氧化、抗炎等重要作用，研究表明白藜蘆醇對正常細胞無毒性[3]，在腦缺血時可通過多種機制發揮神經保護作用。本研究以大鼠為研究對象，探討白藜蘆醇在腦缺血損傷中對TNF-α和IL-6的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 成年雄性SD大鼠48只，體貭量250～300g，由河北省實驗動物中心提供，標準飼料喂養。白藜蘆醇購自美國Sigma公司，TNF-α和IL-6 一抗、二抗及相關試劑盒均購自信帆生物工程有限公司。

1.2 模型制備 參照文獻，采用線栓法阻斷大鼠頸外動脈(externalcarotidartery,ECA)及其分支，阻斷翼腭動脈(pterygopalatineartery,PPA)，以切斷顱外來源的側支循環血流。從ECA插入尼龍線，經頸內動脈(internalcarotidartery,ICA)到大腦前動脈(anteriorcerebralartery，ACA)，機械性阻斷大腦中動脈(middlecerebralartery,MCA)發出處的血供，制作大鼠右側大腦半球腦缺血模型。48只大鼠用10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔注射麻醉。仰臥位固定，頸正中線切口，沿胸鎖乳突肌內緣分離肌肉和筋膜，分離左側頸頸總動脈(commoncarotidartery,CCA)、ECA和ICA，在CCA遠心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動脈夾暫時夾閉ICA，然后近心端結扎CCA、ECA。在距CCA分叉部4mm處剪一小口，將拴線插入到ICA，這時用繞在CCA遠心端的細線輕輕系牢拴線。用眼科鑷輕推拴線，從血管分叉處開始算距離，當插入深度在18mm時，緊緊系牢CCA遠心端的細線(血管外的栓線不要留得過長，更不要縫在皮外，否則大鼠醒來后會自己拔出)。縫合傷口，單籠飼養觀察。以出現左上肢屈曲，行走時向左側偏斜或左側肢體癱瘓為成模標準，共篩選出符合條件的大鼠36只。排除標準：①無明顯神經功能缺損表現或癥狀很輕的大鼠；②蛛網膜下腔出血的大鼠；③手術時出血較多，癥狀很重甚至死亡的大鼠。

1.3 實驗動物分組及給藥方法 按隨機化原則分為A、B、C組，A組(未治療)、B組(白藜蘆醇25mg/kg)、C組(白藜蘆醇50mg/kg)，每組12只。各組處理方法：B、C組在造模后分別給予白藜蘆醇25mg/kg、50mg/kg置于0.85%的NaCl溶液，A組大鼠給予同體積0.85%的NaCl溶液，各組大鼠均按10mL/kg給藥，連用5d。觀察3組大鼠精神狀態、肢體偏癱情況，實驗完畢在麻醉狀態下處死大鼠，取腦組織50～80mg置于勻漿器中。

1.4IL-6和TNF-α檢測 將所取的脊髓組織制成勻漿，低溫(4 ℃)條件以下4 000r/min離心10min，取上清液，分裝，置于-86 ℃冰箱保存至檢測；TNF-α和IL-6測定采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附測定法，操作嚴格按照說明書。

1.5 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件包處理數據，計量資料比較分別采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

B組和C組大鼠腦組織中TNF-α和IL-6水平均明顯低于A組，差異有統計學意義(P<0.05)；C組大鼠腦組織中TNF-α和IL-6水平又均低于B組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

組別TNF-αIL-6A組110.56±20.32176.42±21.55B組86.68±13.15*121.37±20.84*C組59.45±9.26*#85.07±12.25*#F58.754161.340P0.0000.000

*P<0.05與A組比較 #P<0.05與B組比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

腦卒中是指急性起病，由于腦局部血液循環障礙所導致的神經功能缺損綜合征，按照腦的病理改變可分為缺血性卒中和出血性卒中。缺血性腦損傷是危害人類健康和生命安全的常見的難治性疾病，因為其高發病率、高致殘率及高致死率，給患者及其家庭帶來極大的負擔，嚴重降低了存活患者的生活質量。因此，積極治療和預防腦血管病，對降低缺血性腦損傷的發病率和病死率有重要意義，缺血性腦損傷的治療與預防水平急需提高。目前對缺血性腦損傷的早期治療主要是通過2個途徑實現的，即溶栓治療和腦保護治療，但溶栓治療有嚴格的時間窗及適應證，故仍有很大一部分患者需要采用包括神經保護劑在內的其他方法進行治療。

TNF-α在中樞神經系統中，由神經元、星形細胞和膠質細胞產生，它在神經-內分泌-免疫調節系統中發揮很重要的作用。神經功能缺損與TNF-α有關，腦組織的病變越嚴重，相應的炎癥反應也就越嚴重，同時TNF-α也隨之升高，提示TNF-α與疾病的嚴重程度可能有關。IL-6主要由血管內皮細胞、單核巨噬細胞等產生，在中樞神經系統的腦缺血損傷時其迅速表達，缺血缺氧后24 h可迅速升高。腦缺血缺氧損傷的病理機制是炎癥反應和血腦屏障通透性增高，腦缺血損傷后小膠質細胞被激活并分泌大量促炎因子，其中TNF-α和IL-6等細胞因子作為重要的炎癥介質參與機體的炎癥反應，在病理狀態下TNF-α和IL-6的表達增加加重了組織細胞損傷，二者表達水平的高低與疾病的嚴重程度以及預后密切相關，同時與多種腫瘤的發生、發展及轉移密切相關[4-5]，可以作為藥物治療的靶點。

白藜蘆醇是存在于葡萄科、蓼科等植物中的抗毒素，首次從毛葉藜蘆的根部提取得到，其中以虎杖、葡萄、花生中含量最高[6]，具有廣泛的生物學活性，如具有抗炎、抑制血小板聚集、免疫調節以及抗氧化、抗凋亡等作用，已被證實在多種組織或器官的缺血損傷過程中發揮對抗作用[7]，同時具有保護心腦血管、抗腫瘤、抗感染等多種藥理作用[8-10]。此外，白藜蘆醇還具有抗肝纖維化、治療休克、抗衰老、減肥、美容等多種功效，白藜蘆醇目前已經被美國、日本、加拿大等國列為保健品。研究表明，白藜蘆醇可顯著性降低缺血腦組織中TNF-α和IL-6水平，縮小梗死體積[11]。

腦缺血時可觸發腦實質內的炎癥反應并進一步加重組織損傷。腦缺血后數小時，血管內皮細胞即表達多種黏附分子，并介導與白細胞的相互作用，白細胞與內皮細胞黏附并從血液中遷移至腦實質[12]。腦缺血后的細胞分泌大量促炎因子，這些促炎因子的蓄積會導致細胞損傷[13]。腦缺血后數分鐘，部分轉錄因子表達一過性上調；腦缺血后1～2 h，熱休克蛋白表達增加；腦缺血后12～24 h，趨化因子和細胞因子，如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等表達上調[12]。研究顯示白藜蘆醇可抑制腦缺血后的炎癥反應。白藜蘆醇在治療心腦血管疾病方面具有明顯的抗心率失常、抗血栓形成、抗缺血-再灌注損傷后的內皮細胞損傷、抗動脈粥樣硬化治療作用，還有對抗阿爾茨海默病、亨廷頓病等老年病的治療作用，故在患者發生上述疾病時，白藜蘆醇可以作為安全的首選藥[14-16]。本研究主要探討白藜蘆醇對腦缺血性損傷的干預和減輕作用。

神經細胞在完全缺血、缺氧后十幾秒即出現電位變化，20～30 s后大腦皮質的生物電活動消失，腦動脈血流中斷持續5 min，神經細胞就會發生不可逆性損害，出現腦梗死，嚴重缺血的腦組織能量很快耗竭，能量依賴性神經細胞膜的泵功能衰竭，腦缺血引起膜去極化和突觸前興奮性遞質的大量釋放，細胞外液中的Ca2+通過電壓門控通道和N-甲基-D-天冬氨酸受體門控通道進入細胞內，細胞內還由于三磷酸腺苷供應不足和乳酸中毒，使細胞內的結合Ca2+大量釋放，細胞內Ca2+穩態失調在神經細胞缺血損害中起重要作用，受Ca2+調節的多種酶類被激活，導致膜磷脂分解和細胞骨架破壞，大量自由基生成，細胞產生不可逆性損傷，在這個過程中還包括轉錄因子的合成及炎性介質的產生等參與，白藜蘆醇對腦缺血后的神經保護作用與其本身的抗炎功效及調節多種神經遞質的作用有關[17]。本研究在造模后5 d，根據生物化學指標及未治療組大鼠病程發展過程中生命體征的變化，進一步驗證了模型的真實性與可靠性，白藜蘆醇治療組TNF-α和IL-6表達水平明顯下降，隨著白藜蘆醇濃度加大，TNF-α和IL-6的表達水平下降，白藜蘆醇50 mg/kg組大鼠腦組織中TNF-α和IL-6水平低于白藜蘆醇25 mg/kg組，而未治療組大鼠腦組織中TNF-α和IL-6水平遠遠高于治療組。表明白藜蘆醇能通過抑制TNF-α和IL-6的表達水平，減輕腦缺血后的炎癥反應，且這種作用具有一定的濃度依賴性。

腦缺血后，多條信號級聯反應被激活，一部分對缺血腦組織發揮保護作用，而另一部分則產生有害作用，這些信號級聯反應互相重疊且相互影響。腦缺血后數分鐘即可引發炎癥反應和氧化應激。白藜蘆醇可靶向缺血性腦損傷的多條信號通路和環節，從而發揮神經保護作用[18]。本研究通過建立大鼠腦缺血模型，證實白藜蘆醇具有減輕腦缺血組織神經功能損傷的積極作用。對于腦組織缺血性損傷的研究，人們一直不斷探索其發病原因及發病機制，現有的發病機制和藥物治療只針對腦組織缺血性損傷的某一階段發揮特定的作用，無法在缺血性損傷的每個階段發揮作用，故探討一種阻斷腦組織缺血性損傷發展的多靶點藥物有更重要的臨床意義。在腦缺血損傷的早期，腦組織改變不明顯，肉眼可見的變化要在數小時后才能辨認。缺血中心區發生腫脹、軟化，灰白質分界不清，大面積腦梗死時，腦組織高度腫脹，可向對側移位，導致腦疝形成。鏡下可見神經元出現急性缺血性改變，如皺縮、深染及炎細胞浸潤等，膠質細胞破壞，神經軸突和隧橋崩解，小血管壞死，周圍有紅細胞滲出及組織間液的積聚。在發病的4～5 d腦水腫達高峰；7～14 d腦梗死區液化成蜂窩狀囊腔；3～4周后小的梗死灶可被肉芽組織區取代，形成膠質瘢痕，大的梗死灶中央液化成囊腔，周圍由增生的膠質纖維包裹，變成中風囊。而白藜蘆醇是一種非常有希望的神經保護藥，可用于缺血性卒中的預防和治療，加上白藜蘆醇本身來源于各種植物及食物，有必要將其作為神經保護藥在臨床試驗中加以驗證。

綜上所述，白藜蘆醇通過抑制腦部TNF-α、IL-6表達水平，可減輕腦部炎癥程度、改善腦缺血，值得臨床推廣應用。

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(本文編輯：許卓文)

Effect of the resveratrol on TNF-α and IL-6 levels in rats with ischemic injury

GUO Yong1， YANG Qian2*， ZHANG Jie3， GUO Wei4， LI Jing2

(1.DepartmentofMedical,theFirstHospitalofShijiazhuang，HebeiProvinceShijiazhuang050011,China； 2.DepartmentofNeurology，theFirstHospitalofShijiazhuang，HebeiProvince，Shijiazhuang050011,China； 3.DepartmentofClinicalLaboratory，theFirstHospitalofShijiazhuang，HebeiProvince,Shijiazhuang050011,China； 4.DepartmentofClinicalLaboratory，theShenzhouHospital,HebeiProvince,Shenzhou053800,China)

ObjectiveToexploretheeffectoftheResveratrolontumornecrosisfactoralpha(TNF-α)andinterleukin6(IL-6)levelsinratswithischemicinjury.MethodsThirty-sixratsweredividedintogroupA,groupBandgroupC,with12ratsineachgroup.ThegroupAwasthecontrolgroupwithouttreatment,andthegroupBandthegroupCweregivenresveratrol25mg/kgandresveratrol50mg/kg.Thedouble-antibodysandwichenzymelinkedimmunosorbentassaymethodwasusedtodetermineTNF-αandIL-6levelsinthebraintissuehomogenate，andtodetectthecellproliferationinhibitionofresveratrol.ResultsTheTNF-αandIL-6levelsingroupBandgroupCweresignificantlylowerthanthoseingroupA,theTNF-αandIL-6levelsingroupCwerelowerthanthoseingroupB,thedifferencesweresignificant(P<0.05).ConclusionResveratrolinhibitsbraininflammationandimprovescerebralischemiabyinhibitingthelevelsofTNF-αandIL-6inthebrain,whichisworthyofclinicalapplication.

brainischemia；resveratrol；cytokines;rats

2017-03-30；

2017-04-25

河北省醫學科學研究重點課題(20170978)

郭勇(1976-)，男，河北石家莊人，河北省石家莊市第一醫院副主任醫師，從事臨床外科及醫務管理工作。

*通訊作者。E-mail:549147601@qq.com

R743.31

A

1007-3205(2017)09-0997-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.09.002