p38MAPK/MMP-9信號通路對新生大鼠腦缺氧缺血損傷的影響

于沛霞，薄立軍，黃立寧，李 欣，徐貫杰*

((1.河北醫科大學第三醫院麻醉科，河北 石家莊 050051；2.河北醫科大學第二醫院麻醉科，河北 石家莊 050000)

·論著·

p38MAPK/MMP-9信號通路對新生大鼠腦缺氧缺血損傷的影響

于沛霞1，薄立軍2，黃立寧2，李 欣1，徐貫杰1*

((1.河北醫科大學第三醫院麻醉科，河北 石家莊 050051；2.河北醫科大學第二醫院麻醉科，河北 石家莊 050000)

目的觀察依達拉奉對新生大鼠腦缺氧缺血損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)的影響，探討依達拉奉可能通過p38MAPK/基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)信號通路發揮腦保護作用。方法Rice方法建立新生大鼠(7 d)HIBD模型，隨機分為假手術組、HIBD組、依達拉奉組、吡啶咪唑類衍生物(SB203580)組，每組16只。采用五點量表法評估神經功能，并測定腦水含量。檢測超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)濃度。采用酶聯免疫法檢測MMP-9濃度。采用Western blot法檢測細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase 1/2，JNK1/2)、p38MAPK濃度以及p-ERK1/2、p-JNK1/2和p-p38MAPK濃度。結果HIBD組、依達拉奉組、SB203580組神經功能評分和腦含水量明顯高于假手術組，SOD活性低于假手術組，MDA含量和MMP-9濃度高于假手術組，依達拉奉組和SB203580組神經功能評分和腦含水量明顯低于HIBD組，SOD活性高于HIBD組，MDA含量和MMP-9濃度低于HIBD組(P<0.05)。 HIBD組JNK1/2、p-JNK1/2、p38MAPK、p-p38MAPK含量明顯高于假手術組、依達拉奉組、SB203580組，ERK1/2、p-ERK1/2含量明顯高于假手術組(P<0.05)。結論依達拉奉對新生大鼠(7 d)HIBD的神經保護作用與其抑制促炎介體的產生和下調JNK1/2和p38MAPK活化相關聯。其可能與下調P38MAPK/MMP-9通路活性有關。

缺氧缺血，腦；依達拉奉；大鼠

目前我國高齡產婦呈上升趨勢，產婦并發癥增多，導致新生兒發生腦缺氧缺血損傷(hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD)不斷增加。故有效治療新生兒HIBD成為熱點話題。有研究表明在HIBD炎性和凋亡過程中絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信號傳導途徑發揮重要作用。因此，MAPK信號通路成為一個有效的治療靶點。許多疾病或病理狀況的特征是活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)短時間內生產過多或聚集過度導致了HIBD病理過程中細胞內信號分子的改變。ROS可引起p38MAPK的活化，而p38MAPK的激活升高了線粒體ROS水平，從而促進了蛋白酶和自由基的大量產生和釋放，引起了腦損傷和功能障礙。蛋白酶和自由基的大量產生和釋放激活腦組織基質金屬蛋白酶9(matrixmetalloprotein-9,MMP-9)，是導致HIBD的主要因素。本研究觀察自由基清除劑依達拉奉對新生大鼠HIBD的影響，旨在為進一步了解新生大鼠HIBD的分子機制以及為新生兒HIBD的臨床治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗設計 新生7d的健康SD大鼠64只(河北省實驗動物中心提供)，隨機分為假手術組、HIBD組、依達拉奉組、吡啶咪唑類衍生物(SB203580)組，每組16只。假手術組僅進行手術而不造成缺氧狀態,其余3組均采用Rice[1]方法建立新生大鼠HIBD模型。新生大鼠行左側頸總動脈永久性結扎,2h后置于玻璃缺氧箱中，37 ℃恒溫,輸入氧濃度為(8±0.1)%的氮氧混合氣體持續缺氧2h。假手術組和HIBD組給予生理鹽水2mg/kg,依達拉奉組于持續缺氧2h即刻腹腔注射依達拉奉3mg/kg，SB203580組腹腔注射SB203580 3mg/kg。

1.2 神經功能評價 神經功能缺損評價由不知道動物分組的研究者進行，采用五點量表法。正常(無神經功能缺損)0分：大鼠表現正常，完全可以伸開前肢和抬起尾巴；輕度神經功能缺損1分：大鼠不能完全伸展其左前肢，抬起尾巴困難；中度神經功能缺損2分：大鼠已經減少抗側推，并有輕度神經行為；嚴重神經功能缺損3分：只轉身成一個圓圈，并有輕度和中度神經行為；嚴重神經功能缺損4分：走路不自然，并出現意識低迷。

1.3 腦水含量測定 同側和對側半球稱質量(濕質量)并在干燥劑烘箱中干燥(105 ℃)過夜，將干燥的大腦半球再次稱質量(干質量)，總腦水含量=[(濕質量-干質量)/濕質量]×100%。

1.4 超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測 在冰盤上迅速取出右側大腦半球，置于-20 ℃冰箱保存備用。采用黃嘌呤氧化酶法測定腦組織勻漿SOD活性。采用硫代巴比妥酸法測定腦組織勻漿MDA濃度。

1.5 大鼠腦MMP-9表達檢測 新生大鼠于缺氧后24h，每組隨機取8只，斷頭處死，取腦組織，右側大腦除去額葉皮質，其余腦組織制成勻漿，以3 500r/min離心10min。采用酶聯免疫法檢測MMP-9濃度。

1.6Westernblot檢測Westernblot法檢測各組MAPK通路中細胞外信號調節激酶(extracellularsignal-regulatedkinase1/2，ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase1/2，JNK1/2)、p38激酶以及p-JNK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK的活化及活性。各組用胰酶消化收集細胞，蛋白裂解液處理并制備蛋白樣品，應用BCA蛋白質定量試劑盒對蛋白質進行定量后，每組取40μg總蛋白上樣。15%SDS-PAGE分離蛋白質，濕轉恒流390mA45min將蛋白轉至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2h。轉膜結束后與濃度為1∶200的一抗反應，室溫搖1h后，4 ℃過夜，封閉液洗3次后與二抗反應2h后，充分洗滌后發光、顯影、定影、曝光，掃描β-肌動蛋白為內參照。

1.7 統計學方法 應用SPSS23.0統計學軟件分析數據，計量資料比較分別采用F檢驗和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組新生大鼠神經功能評分和腦含水量比較HIBD組、依達拉奉組、SB203580組神經功能評分和腦含水量明顯高于假手術組，依達拉奉組和SB203580組神經功能評分和腦含水量明顯低于HIBD組，差異均有統計學意義(P<0.05)；依達拉奉組與SB203580組神經功能評分和腦含水量差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 腦組織SOD活性、MDA含量和MMP-9濃度比較HIBD組、依達拉奉組和SB203580組SOD活性低于假手術組，MDA含量和MMP-9濃度高于假手術組，依達拉奉組和SB203580組SOD活性高于HIBD組，MDA含量和MMP-9濃度低于HIBD組，差異均有統計學意義(P<0.05)；依達拉奉組與SB203580組SOD活性、MDA含量和MMP-9濃度差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

組別 神經功能評分(分)腦含水量(%)假手術組0.000 76.73±0.66HIBD組3.750±0.463* 82.07±1.15*依達拉奉組1.625±0.518*#79.57±0.57*#SB203580組1.250±0.463*#79.90±0.99*#F 111.70150.100P 0.0000.001

*P<0.05與假手術組比較 #P<0.05與HIBD組比較(SNK-q檢驗)

組別 SOD(U/mg)MDA(nmol/mg)MMP-9(ng/ml)假手術組240.081±0.2011.535±0.0203.978±0.446HIBD組190.880±0.540*2.492±0.060*7.328±2.466*依達拉奉組223.392±0.572*#2.027±0.019*#5.232±1.674*#SB203580組219.233±0.466*#1.965±0.021*#5.341±1.460*#F 392.0518.654654.897P 0.0000.0020.000

*P<0.05與假手術組比較 #P<0.05與HIBD組比較(SNK-q檢驗)

2.3 MAPK通路中JNK1/2、ERK1/2和p38激酶及其磷酸化水平比較 HIBD組JNK1/2、p-JNK1/2、p38MAPK、p-p38MAPK含量明顯高于假手術組、依達拉奉組、SB203580組，ERK1/2、pERK1/2含量明顯高于假手術組，差異均有統計學意義(P<0.05)；依達拉奉組與SB203580組JNK1/2、p-JNK1/2、p38MAPK、p-p38MAPK差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

組別 ERK1/2p-ERK1/2JNK1/2p-JNK1/2p38MAPKp-p38MAPK假手術組1.0001.0001.0001.0001.0001.000HIBD組1.201±0.032*1.333±0.045*1.480±0.097*1.863±0.054*1.177±0.052*1.820±0.041*依達拉奉組1.056±0.1921.318±0.0390.963±0.046#0.940±0.048#0.923±0.056#1.003±0.040#SB203580組1.036±0.0221.317±0.0260.693±0.378#0.910±0.013#0.848±0.014#0.978±0.019#F 131.78194.17622.1591232.60784.8461465.740P 0.0000.0000.0010.0000.0000.000

*P<0.05與假手術組比較 #P<0.05與HIBD組比較(SNK-q檢驗)

3 討 論

新生兒HIBD目前多見于胎兒宮內窘迫和新生兒窒息，是嚴重威脅新生兒生命和健康的疾病之一。隨著我國高齡產婦的日益增多，產婦并發妊娠高血壓疾病等增加了宮內窘迫危險，導致胎兒宮內腦缺氧缺血，危及胎兒生命。新生兒腦缺氧缺血導致了新生兒腦損傷，增加了家庭和社會負擔。新生兒HIBD是一個包含了能量代謝障礙、興奮性氨基酸的釋放、炎癥級聯反應、氧自由基合成釋放、內環境失衡等的級聯損傷過程[2]。Kehrer等[3]認為氧自由基尤其是超氧陰離子，在HIBD過程中導致了腦水腫形成和腦損傷。越來越多的證據表明，MAPK信號通路被激活后，HIBD起著至關重要的作用[4-6]。新生大鼠腦組織發育未成熟，血腦屏障尚未完全建立，能量合成、儲備能力不足，原材料缺乏和內源性抗氧化能力不完善，在腦缺氧缺血的條件下，氧自由基容易過度產生，從而進一步加重腦組織水腫和損傷[7]。

本研究使用Rice方法建立HIBD模型，以進一步研究依達拉奉對新生大鼠缺氧性腦病的影響，以及其腦保護作用與MAPK信號通路的關系，結果表明3 mg/kg依達拉奉于腦缺氧2 h即刻給予腹腔注射，能改善新生大鼠神經功能，減輕腦水腫，有腦保護作用。

依達拉奉 (3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮，MCI-186)是一種新型自由基清除劑,對腦組織中具有高度細胞毒性的羥基基團有一定的清除能力，減少羥自由基的產生和清除[8]，減少了遲發性神經元死亡[9],同時抑制組織中的脂質過氧化反應，保護血管內皮細胞的完整性，減輕腦水腫。本研究結果顯示，依達拉奉組在大腦皮質缺血半暗帶顯著提高SOD活性，降低MDA水平。提供了依達拉奉腦缺氧缺血后抗氧化活性的證據。

HIBD通過氧化應激、炎癥反應，激活神經元凋亡級聯反應，MAPK信號級聯參與神經元的存活或損傷[5]。本研究結果顯示，磷酸化ERK1/2、JNK1/2和p38MAPK在新生大鼠腦HIBD模型中缺血半暗帶顯著增加；依達拉奉組抑制JNK1/2和p38 MAPK活化，但對增加ERK1/2表達沒有影響；值得注意的是，依達拉奉對 p-JNK1/2和p-p38MAPK蛋白水平也顯著下調。因此，JNK1/2和p38MAPK途徑參與了依達拉奉的神經保護作用。活化的JNK和p38蛋白主要功能為介導HIBD和細胞凋亡[10]。腦缺血時，磷酸化ERK、JNK和p38蛋白被激活，磷酸化底物被激活，使p-Elk-1、 p-c-Myc、p-ATF-2和p-c-Jun表達增加，介導細胞死亡[11]。此外，PI3K-Akt信號通路通過抑制JNK和c-Jun表達的激活抑制神經細胞凋亡[10]。許多細胞死亡過程中，通過JNK和p38蛋白途徑調節神經元損害。因此，依達拉奉的保護作用可能與JNK1/2和p38MAPK信號通路有關。

MMPs是一組含Zn2+的依賴Ca2+的能降解或修飾細胞外基質的蛋白酶，參與機體的許多生理過程，并發揮重要作用[11]。正常腦組織中只有無活性MMP-9前體，即使MMP-9酶原被激活后也會迅速降解，以防止其過度的活化，造成組織損傷[12]。在某些病理條件下， MMP-9大量活化，降解細胞外基質成分，破壞血腦屏障的完整性，增加組織水腫，導致腦水腫加重[13]。本研究結果顯示，HIBD組、依達拉奉組和SB203580組腦組織MMP-9水平明顯高于假手術組，證明了HIBD模型造成了腦損傷；依達拉奉組和SB203580組腦組織MMP-9水平明顯低于HIBD組，表明依達拉奉處理后，MMP-9水平降低，減輕了對血腦屏障的破壞，減輕了腦水腫，減小了梗死面積，對腦功能有一定的保護作用。依達拉奉組腦功能評分明顯高于HIBD組，水腫程度低于HIBD組，進一步證實了依達拉奉的腦保護作用。

炎癥反應、MMP-9相互促進，導致炎癥瀑布現象發生[14]。p38MAPK在炎癥級聯反應過程中發揮著重要作用,提示其與MMP-9之間可能存在相互作用。SB203580是p38MAPK的特異性抑制劑,能夠特異性地與序列非常相近的蛋白質結合并抑制其活性,從而發揮拮抗炎癥的作用。本研究應用p38MAPK特異性激活抑制劑SB203580后,HIBD減輕，MMP-9表達減少，證實p38MAPK信號通路與MMP-9存在密切的關系。依達拉奉組和SB203580組產生相同的效果，進一步證明依達拉奉的腦保護作用可能與p38MAPK/MMP-9信號通路存在密切的關系，依達拉奉通過下調P38MAPK/MMP-9通路活性，發揮腦保護作用。

總之，依達拉奉減輕新生大鼠HIBD的腦保護作用與JNK1/2和p38MAPK活化密切相關。依達拉奉可能通過p38MAPK/MMP-9信號通路，下調P38MAPK/MMP-9通路活性，發揮腦保護作用。

[1] 王琍琍,王楊,宣桂華,等.新生大鼠腦缺氧缺血損傷模型的建立[J].安徽醫科大學學報,2004,39(4):259-261.

[2] Wu Q,Chen W,Sinha B,et al. Neuroprotective agents for neonatal hypoxic-ischemic brain injury[J]. Drug Discovery Today,2015,20(11):1372-1381

[3] Kehrer JP,Klotz LO. Free radicals and related reactive species as mediators of tissue injury and disease:implications for Health[J]. Crit Rev Toxicol,2015,45(9):765-798.

[4] Chang D,Wang YC,Bai YY,et al. Role of P38 MAPK on MMP activity in photothrombotic stroke mice as measured using an ultrafast MMP activatable probe[J]. Sci Rep,2015,5:16951.

[5] Lehotsky J,Petras M,Kovalska M,et al. Mechanisms involved in the ischemic tolerance in brain:effect of the homocysteine[J]. Cell Mol Neurobiol,2015,35(1):7-15.

[6] Newby LK,Marber MS,Melloni C,et al. Losmapimod,a novel p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor,in non-ST-segment elevation myocardial infarction:a randomised phase 2 trial[J]. Lancet,2014,384(9949):1187-1195.

[7] Ma NT,Zhou R,Chang RY,et al. Protective effects of aloperine on neonatal rat primary cultured hippocampal neurons injured by oxygen-glucose deprivation and reperfusion[J]. J Nat Med,2015,69(4):575-583.

[8] Wang T,Zhai L,Guo Y,et al. Picroside Ⅱ has a neuroprotective effect by inhibiting ERK1/2 activation after cerebral ischemic injury in rats[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol,2015[Epub ahead of print].

[9] Zhao L,Guo Y,Ji X,et al. The neuroprotective effect of picroside II via regulating the expression of myelin basic protein after cerebral ischemia injury in rats[J]. BMC neurosci,2014,15:25.

[10] Vafadari B,Salamian A,Kaczmarek L. MMP-9 in translation:from molecule to brain physiology,pathology,and therapy[J]. J Neurochem,2016,139(Suppl 2):91-114.

[11] Kuhn E,Reis A,Campagnoli EB,et al. Effect of sealing infected dentin with glass ionomer cement on the abundance and localization of MMP-2,MMP-8,and MMP-9 in young permanent molars in vivo[J]. Int J Paediatr Dent,2016,26(2):125-133.

[12] Nagy B,Woth G,Mérei,et al. Perioperative time course of matrix metalloproteinase-9(MMP-9),its tissue inhibitor TIMP-1 & S100B protein in carotid surgery[J]. Indian J Med Res,2016,143(2):220-226.

[13] Lakhan SE,Kirchgessner A,Tepper D,et al. Matrix metalloproteinases and blood-brain barrier disruption in acute ischemic stroke[J]. Front Neurol,2013,4:32.

[14] Yang JS,Lin CW,Su SC,et al. Pharmacodynamic considerations in the use of matrix metalloproteinase inhibitors in cancer treatment[J]. Expert Opin Drug Metab Toxicol,2016,12(2):191-200.

(本文編輯：趙麗潔)

The effects of P38MAPK/MMP-9 signaling pathway on hypoxic ischemic brain damage in neonatal rats

YU Pei-xia1， BO Li-jun2， HUANG Li-ning2， LI Xin1， XU Guan-jie2*

(1.DepartmentofAnesthesiology，theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050051，China； 2.DepartmentofAnesthesiology，theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China)

ObjectiveToobservetheeffectofedaravoneonhypoxic-ischemicbraindamage(HIBD)inneonatalratsandtoinvestigatetheprotectiveeffectofedaravoneonbrainthroughp38MAPK/matrixmetalloprotein-9(MMP-9)signalingpathway.MethodsNeonatalratswererandomlyassignedtotheshamoperationgroup,theHIBDgroup,theedaravonegroup,theSB203580group(n=16,eachgroup).ThesurgicalprocedureofHIBDwasdescribedpreviously.Ischemicpenumbraeofthecerebralcortexwereharvestedtodeterminesuperoxidedismutase(SOD),malondialdehyde(MDA).MeasurementsofMMP-9inthebrainsampleswereperformedusingELISA.Measurementsofextracellularsignal-regulatedkinase1/2 (ERK1/2),c-JunN-terminalkinase1/2 (JNK1/2),p38MAPK,p-ERK1/2,p-JNK1/2,andp-p38MAPKconcentrationinthebrainsampleswereperformedusingwesternblotanalysis.ResultsTheneurologicalfunctionscoreandcerebralwatercontentoftheHIBDgroup,edaravonegroupandSB203580groupweresignificantlyhigherthanthoseintheshamoperationgroup.TheactivityofSODwaslowerthanthatintheshamoperationgroup,andthecontentofMDAandMMP-9werehigherthanthoseoftheshamoperationgroup.TheneurologicalfunctionscoreandcerebralwatercontentofedaravonegroupandSB203580groupweresignificantlylowerthanthoseinHIBDgroup.TheactivityofSODwashigherthanthatoftheHIBDgroup,andthecontentofMDAandMMP-9werelowerthanthoseoftheHIBDgroup(P<0.05).ThecontentsofJNK1/2,p-JNK1/2,p38MAPKandp-p38MAPKinHIBDgroupweresignificantlyhigherthanthoseintheshamoperationgroup,edaravonegroupandSB203580group,andthecontentsofERKandpERKweresignificantlyhigherthanthoseintheshamoperationgroup(P<0.05).ConclusionTheneuroprotectiveeffectofedaravoneonHIBDinneonatalrats(7d)wasassociatedwithinhibitionofproinflammatorymediatorproductionanddownregulationofJNK1/2andp38MAPKactivation,whichmayberelatedtodownregulationofp38MAPK/MMP-9pathwayactivity.

hypoxia-ischemia,brain;edaravone;rats

2017-06-14；

2017-07-31

河北省醫學科學研究重點課題(20130221)

于沛霞(1979-)，女，天津人，河北醫科大學第三醫院主治醫師，醫學碩士，從事臨床麻醉學研究。

*通訊作者。E-mail：535498241@qq.com

R743

A

1007-3205(2017)09-1063-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.09.017