兔出血癥病毒研究進展

鄒秋萍

（安陽市動物疫病預防控制中心，河南安陽455000）

兔出血癥病毒研究進展

鄒秋萍

（安陽市動物疫病預防控制中心，河南安陽455000）

兔出血癥病毒（RHDV），為嵌杯病毒科兔病毒屬成員，能引起3月齡以上青年或成年兔的兔出血癥（RHD）。RHD是兔的一種急性、烈性、高度傳染性和高度死亡性疾病，曾給世界養兔業帶來了非常嚴重的經濟損失。1984年2月，該病在中國無錫首次暴發，并迅速傳播至全國各地，其典型的病理變化是呼吸系統出血、肝壞死、出血，實質器官水腫、出血、淤血。鑒于RHD的嚴重危害性，世界動物衛生組織（OIE）將RHD正式列為“國際動物保健編目”B類傳染病，我國農業部也將其列為動物二類疾病。RHDV病毒粒子呈球形，二十面體對稱，無囊膜，病毒粒子由180個相同的蛋白分子（VP60，58～60 kDaa）包裹。研究表明，作為RHDV的主要衣殼蛋白，VP60是誘導機體產生免疫反應的重要成分，在RHDV診斷和疫苗制備中有著重要的作用。為梳理國內外近期在RHDV研究的主要進展，該文就VP60誘導抗體制備，抗原表位鑒定及RHDV變異進化方面進行了概述。

1 vp60基因及VP60蛋白的結構和功能

RHDV病毒基因組為單股正鏈RNA，全長7 437 nt，基因組5’端沒有帽狀結構而是以共價結合的方式與感染性相關的VPg蛋白（viral protein genome-linked）相連，3’端具有一個短的Poly（A）尾。電鏡下，RHDV病毒粒子呈球形，無囊膜，直徑約為35～40 nm，二十面體對稱，表面有32個高5～6 nm的圓柱狀殼粒，具有嵌杯樣病毒典型的杯狀結構，此外電鏡下還可見少數無核酸的病毒空衣殼。病毒粒子的衣殼厚4～6 nm，主要由分子量為60 kDa的結構蛋VP60聚合而成。三維結構分析表明，RHDV衣殼除具有杯狀病毒典型的結構特征外，還有其獨特結構，五鄰體和六鄰體殼粒之間由一條窄的蛋白密度帶連接，這在其他杯狀病毒中還未曾發現。病毒基因組含有兩個重疊的開放閱讀框（ORF）：ORF1、ORF2：ORF1編碼一個分子量約257 kDa的多聚蛋白前體，經酶解加工后形成7種非結構蛋白A（包括聚合酶、螺旋酶、6T和蛋白酶等）和主要結構蛋白VP60；ORF2編碼小結構蛋白VP10。RHDV VP60的氨基酸序列與其他嵌杯病毒相同，分為A（1-21）、B（22-300）、C（329-343）、E（344-434）和F（435-579）等六個區域。VP60由三個功能結構域構成：NTA（N-terminal arm）、S結構域（S domian）、P結構域（P domain），P結構域又可以進一步分為P1亞結構域（P1 sub-domian）和P2亞結構域（P1sub-domian）。S結構域包埋在衣殼內部由VP60的N端（66～230 aa）組成，保護病毒的基因組，含有抗原表位，具有一定的免疫原性。P結構域由VP60的C端（238～579 aa）組成，暴露在衣殼外部，而P2亞結構域在衣殼的最外面，具有較大的遺傳變異性，也是抗原表位的聚集區。金明蘭等對分離到的YL毒株VP60基因進行擴增分析發現，VP60蛋白A、B、D、F區變異相對較低，C、E區變異較高，因而推測A、B、D、F區在衣殼蛋白中執行更多的生物學功能。VP60參與完成病毒顆粒的包裝，能與組織血型抗原（HBGAs）結合在感染過程中維持病毒的感染性，VP60還是病毒的免疫保護性抗原，在誘導機體產生抗病毒感染的免疫反應中起重要的作用。近年來國內外已主要著眼于VP60蛋白基因工程疫苗的研究，現已在大腸桿菌、釀酒酵母及昆蟲細胞等多種表達系統中表達了VP60蛋白，所有這些表達產物都可以保護免疫兔抵抗RHDV的致死攻擊。體外真核系統表達的VP60可以自我裝配成病毒樣顆粒（VLPs），其形態大小和抗原性均與天然病毒粒子相似，免疫后可以激發免疫保護反應。孫飛研究組通過對RHDV衣殼蛋白的結構進行分析以及不同病毒株的序列比對，找到一段RHDV與抗體結合起關鍵作用的loop區（304～314 aa）。在此基礎上設計了一段包含此loop區的多肽（300～318 aa），受體結合實驗證明該多肽可以和兔的組織細胞結合，且中和實驗結果表明該多肽能有效刺激機體產生體液免疫和細胞免疫以有效防御RHDV的感染。孟春春等將VP60兩個抗原優勢區（31～250 aa和477～579 aa）串聯通用Th細胞表位的融合蛋白作為免疫原，可以激發機體抗RHDV感染的體液和細胞免疫反應。有別于傳統的大腸桿菌、酵母和昆蟲細胞表達系統表達的亞單位疫苗，還出現了利用轉基因植物生產VP60疫苗的新途徑。Castanon等將RHDV AST/89株VP60基因克隆到植物表達載體PK2，構建了表達載體PK2-VP60和雙重載體PROK3，重組載體轉化馬鈴薯葉片外植體，轉基因馬鈴薯表達的蛋白與天然VP60相似，免疫試驗證明表達物質具有良好的免疫保護效果。但鑒于VP60在植物細胞中的表達量較少，所以如何提高疫苗蛋白在植物中的表達量是未來的研究方向。Gil F等成功研制出轉基因植物可飼RHD疫苗。原冬偉等以表達VP60蛋白的真核表達載體pcDNA-VP60作為新型DNA疫苗，免疫后在兔體內產生了針對RHDV的免疫保護性反應。鑒于VP60在RHDV生物學和激發機體產生免疫保護中的重要作用，還常被選作目標分子開發疫苗和構建系統發育樹分析世界各地RHDV毒株的變異情況。

2 RHDV抗體制備和抗原表位鑒定

單克隆抗體是一種常用的檢測工具，也是探索細胞和大分子物質的工具。抗體在RHDV檢測，分析VP60蛋白結構功能和RHDV遺傳進化分析中起著重要的作用。迄今為止，以純化的RHDV病毒粒子和體外表達的VP60蛋白為免疫原制備的抗體在國內外均有報道。抗原表位是免疫原中誘導機體產生抗體的關鍵部位，分為構象表位和線性表位。鑒定RHDV抗體的抗原表位，對了解單克隆抗體的生物學特性以及分析病毒抗原位點的差異、病毒的分型、疾病的鑒別診斷和治療等有重要意義。Viaplana E等用大腸桿菌表達了5個VP60的相互重疊的片斷，經純化后分別與自然感染的血清和疫苗免疫血清反應，研究這些片斷的抗原性，結果表明，VP60 N端的前175個氨基酸殘基與血清反應最強烈。根據這一研究結果推測，VP60 C端的抗原結構主要是構象依賴的B細胞結合位點，而N端含有連續抗原決定簇，在感染和疫苗免疫中誘導機體的免疫應答。Laurent等以RHDV病毒粒子為免疫原制備了6株RHDV單抗，并研究了6株單抗的識別特征，根據6株單抗識別表位的不同將RHDV抗原表位分為表面線性表位、表面構象表位和內部線性表位3類。Martinez-Torrecuadrada等借助由桿狀病毒表達的RHDV重組病毒樣顆粒制備了11株單抗與在大腸桿菌中表達了VP60蛋白的12個相互重疊片段反應，鑒定出了兩段主要的抗原決定區：一段在VP60 N端的31至250位氨基酸殘基之間，另一端在VP60 C端的477至579位氨基酸殘基之間。但是能夠識別C端主要抗原區的單抗不能識別由完整的VP60蛋白質裂解而成的主要產物，表明RHDV最主要的抗原可能位于VP60蛋白的N端。Laurent S等的研究表明，識別RHDV構象表位的E3單抗可以識別VP60的C端區域，能結合內部隱藏表位A47單抗可以識別VP60的N端區域。pGEX表達系統進一步確定單抗A47表位位于VP60 N端的129和160殘基之間。楊廷亞等以針對RHDV的A3c單抗株作為靶物質應用噬菌體展示技術篩選的抗原表位集中在VP60 N端的25至38位氨基酸殘基之間，其中核心氨基酸基序位于N端的29至33位氨基酸之間。宋艷華等以純化的RHDV病毒樣顆粒為免疫原得到了9株單抗，通過與截短的VP60反應鑒定出這9株單抗的抗原表位均在VP60蛋白的P結構域。孔德生等以純化的RHDV病毒粒子為免疫原制備了6株單抗，經鑒定其中有4株識別的為構象表位，其余2株識別的為構象表位，并鑒定出這2株的抗原表位在VP60的C端。隨后，孔德生等又以原核表達的VP60為免疫原篩選出針對不同亞型的RHDV型特異性單抗，并鑒定了這些RHDV型特異性單抗的抗原表位，結果表明，RHDV型特異性單抗的抗原表位均分布在VP60蛋白的P結構域。根據這些研究結果推測VP60的N端包裹在衣殼內部，C端暴露在外部且主要為抗原表位的分布區域。

3 RHDV遺傳變異與進化

RHDV雖然是RNA病毒，遺傳變異性卻很低。1984年，RHD首次在江蘇無錫等地區暴發，隨后，朝鮮也暴發該病。所分離的RHDV毒株在遺傳性和抗原性上都極其穩定，似乎均為同一血清型。通過比較不同地區RHDV分離株的全基因序列發現同源性都很高，氨基酸序列改變很少。VP60蛋白的N端高度保守，而C端尤其是VP60的C區（301～328 aa）和E區（344～434 aa）高度變異。鑒于C區和E區暴露于衣殼蛋白的最表面，所受的免疫壓力較大，可能是高度變異的原因。20世紀90年代以來報道了有個別毒株在不同溫度下其血凝性與常規毒株不同。1995年，Chasey在英國分離到了一株只能在4℃條件下才能凝集人的“O”型紅細胞的特殊病毒株。1996年，Capucci在英國也分離到了一株無血凝型，無毒力的與RHDV相關的新的兔杯狀病毒，稱為兔杯狀病毒（RCV），且表明RCV刺激機體產生的抗體對RHDV有交叉保護作用。RCV在病原性、組織親嗜性、VP60序列等方面均與RHDV毒株不同。隨后，在其他地域也有分離RCV的報道。RCV無致病性，在腸道中而不是在肝臟中增值，病毒滴度較低。Strive等發現澳大利亞RCV-A1毒株刺激機體產生的抗體對RHDV具有部分交叉保護作用且使兔群免于發病，說明RCV能保護澳大利亞兔群抵抗RHDV的感染。1998年，Capucci等分離到兩株與RHDV參考毒株Bs89抗原性不同的新毒株，這兩株毒株與1H8單抗株無反應，與感染Bs89參考株恢復期兔子的血清也無反應，將其命名為RHDVa。研究表明RHDVa與野生型的RHDV有著不同的遺傳特性和抗原性，但具有相同的致病性。系統進化樹分析RHDVa雖為一個獨立的基因群，但在RHDV和RHDVa之間幾乎有完全的交叉保護作用。德國、法國、美國、伊利比亞半島也相繼報道分離出了RHDVa。基于RHDVa特異性識別單抗所建立的夾心ELISA可以用來快速鑒別RHDVa和RHDV。Lavazza等用夾心ELISA對近幾年來意大利RHDVa的流行情況分析發現，在1997年RHD僅由9%的RHDVa引起，而到2003年這一比例增加到了80%，說明RHDVa的流行正在逐步取代RHDV。有學者認為，RHDVa變異株的出現是由于疫苗免疫的選擇壓力引起的。此后，根據VP60的不同將RHDV分為6株不同的亞基因型：G1～G5和抗原變異株RHDVa即G6亞基因型。2001年，美國密歇根州報道了一種被稱為密歇根兔杯狀病毒（MRCV）的新型兔杯狀病毒，其基因組與RHDV的同源性平均為79%。相比RHDV之間衣殼蛋白98%的同源性，不同MRCV衣殼蛋白之間的同源性僅介于89.8%～91.3%。MRCV主要引起亞臨床感染，被認為只有在特定環境條件才能誘發兔出血癥樣的疾病。2010年在法國的家兔和野兔中發現了一種新型的RHDV突變體，并命名為RHDV2。RHDV2在病程、死亡率等方面均與RHDV不同，臨床表現亞急性或慢性型癥狀高發。RHDV2和RHDV-RHDVa有著不同的抗原性和遺傳特性，系統進化樹分析表明，RHDV2為一個獨立的分支，可能為兔病毒屬的一個新的成員。分子流行病學分析表明，在法國首次報道RHDV2的一年里，RHDV2已經擴散到了法國各地并幾乎全部代替了RHDV毒株。隨后RHDV2波及德國、意大利等國家，英國的康沃爾、諾丁漢郡、薩利郡和威爾士也有檢測到RHDV2的報道。RHDV2與RHDV-RHDVa核苷酸相似性平均為82.4%，氨基酸相似性平均為88.8%。所以，針對RHDV的多抗或有共同位點的單抗均能識別RHDV和RHDV2。目前，中國還沒有RHDV2型病毒的報道，但已有RHDV型特異性單抗制備的報道。

4 展望

兔病毒性出血病是在20世紀末期暴發的兔急性烈性傳染病，嚴重危害養兔業。RHDV還不能在體外長期傳代培養，這在一定程度上阻礙了對RHDV的進一步研究。隨著分子生物學的不斷發展，一些新的研究方法正應用在RHDV的研究上并取得了一定的成果。VP60蛋白在誘導機體產生免疫，RHDV病毒粒子的組裝和RHDV的遺傳進化方面有著重要的作用。越來越多針對VP60蛋白的單抗為我們了解RHDV的抗原性和解析VP60的結構和功能提供了工具。線性表位或構象表位的鑒定明確了RHDV抗原位點的差異，為鑒別診斷、治療提供了依據。RHDV進化的速度雖然很慢，但新型病毒已經出現，并正逐漸代替傳統病毒的流行，這為新形勢下RHD的防控帶來挑戰，并促使我們更加深入地研究RHD及RHDV。□