性控精液在畜牧業(yè)中的應用與使用方法

董月濤

（文安縣畜牧獸醫(yī)局，河北文安065800）

性控精液在畜牧業(yè)中的應用與使用方法

董月濤

（文安縣畜牧獸醫(yī)局，河北文安065800）

1 XY精子分離技術簡介

性控精液的生產就是將XY精子分離的過程，在哺乳動物中，決定動物性別的關鍵是其所攜帶不同的性染色體。當經過減數分裂形成單倍體的配子后，X精子攜帶X染色體，它與卵子受精后產生雌性后代，Y精子攜帶Y染色體，它與卵子受精后產生雄性后代。

在哺乳動物（家畜）中，通常X精子的DNA含量比Y精子多3.0%～4.5%。分離精子時首先用Hoechst33342（一種相對安全的活細胞熒光染料，以非嵌入方式特異地結合到DNA雙鏈小溝的腺嘌呤和胸腺嘧啶密集區(qū)域）給精子染色，染色后精子通過流式細胞儀時，精子上的熒光染料Hoechst33342被氬離子紫外激光（～350 nm）激發(fā)，產生藍色激發(fā)光（～460 nm）。由于X精子所含有DNA比Y精子多，結合上比較多的Hoechst33342，所激發(fā)出的熒光就比Y精子強。流式細胞儀根據熒光強度的差別分辨出哪個是X精子，哪個是Y精子。同時，由于噴嘴產生高頻率震動，高速噴射出的液流形成了包含單個X精子或者Y精子的微小液滴。因此包含精子的小液滴就被充上正電荷（X精子）或者負電荷（Y精子）。

染色的精子通過流束形成含有精子的帶電液滴，在流動室的噴嘴上裝備有一個超聲振蕩壓晶體片，這個振蕩裝置使自噴嘴射出的液束破碎成千萬個小滴，流動的精子就被分散在這些小水滴中。由于XY精子的熒光強度的不同，計算機就根據熒光量不同給小液滴帶上不同電荷。當帶有不同電荷的精子液流經一對帶正、負幾千伏恒定靜電電場的偏轉板時，帶電的小水滴就根據自身所帶的電荷性質產生偏轉，落入各自的收集容器中，不帶電荷的水滴就進入中間的廢液容器中，從而實現了細胞的分選。

2 性控精液的應用及其優(yōu)勢

性別控制一直是生物科學研究領域的一項重要課題，對畜牧業(yè)（尤其是養(yǎng)牛業(yè)）有著非常重要的意義，它可以按照生產需求控制仔畜性別，以提高畜牧業(yè)生產的經濟效率。在育種方面，通過性別控制可以增加選擇家畜遺傳和表型性別的強度，加速育種進程。在生產實踐中，X精子冷凍精液可用于直接給發(fā)情牛授精生產體內性控胚胎或者對供體超排后輸精生產性控胚胎，再將胚胎收集并用于移植。

2.1 具有節(jié)省成本，提高經濟效益的優(yōu)勢

若受性別限制的生產性狀（如泌乳等）和受性別影響的生產性狀（如生長速度等）的生產能力得到充分發(fā)揮，就能獲得很大的經濟效益。現有的胚胎性別控制技術，是將制作好的胚胎進行切割取樣，再采用分子生物學手段進行胚胎的性別鑒定，按照目前的市場價格生產一枚胚胎需要1 500元左右，且只有50%的機率是雌性胚胎，而性控凍精的價格為每支200元，資源和成本的優(yōu)勢相當明顯。Cran等、Seidel等用Y精子產下的公牛為90%，而用X精子則產下83%的母犢。而且Seidel等經過大量試驗（使用1 370頭青年母牛，22頭公牛，進行11個試驗）還發(fā)現:冷凍分離精子與新鮮分離精子授精后的懷孕率沒有明顯差異，分離冷凍精子授精劑量100萬～150萬個與300萬個精子懷孕率沒有差異，將冷凍的分離精子輸入子宮角與輸入子宮體的懷孕率沒有差異。盧克煥的研究表明:用性別分離精子進行體外受精產生的胚胎，移植后產出表現正常的后代，而且性別決定準確率達到90%。據美國XY公司報道，奶牛性控凍精配種產母率在90%以上。10 787頭青年母牛人工授精的受胎率為53%。據國內報道，產母率達到92%，受胎率達到49%～68%，平均達到50%以上。因此，從分離準確率及受胎率的影響考慮，性控凍精完全可以商業(yè)應用。

2.2 具有快速繁育的優(yōu)勢

按照傳統(tǒng)的繁育方法，母牛的繁殖比例一般是每兩年繁育一頭母犢，而一頭成年牛一生只能繁育3～4頭母犢。而使用XY分離精液就可以打破傳統(tǒng)的繁殖規(guī)律。據羅應榮等應用分離X精子冷凍精液對12頭供體母牛進行輸精，獲得與未分離冷凍精液輸精后相近的超排母牛采集胚胎的數量和質量。對采集到的61枚胚胎進行性別鑒定后，確定雌性胚胎的比例為100%，頭均獲得了可用胚胎5.5枚，11枚性控冷凍胚胎移植后，40 d以上的未返情率為63.6%。使用分選的X精子，結合人工授精技術就可以實現一頭母牛每年產一頭母犢，即一頭母牛一生生產6～8頭母犢。如果同時結合超數排卵技術與胚胎移植技術，生產體內性控胚胎，理論上它的效率將是超數排卵、性別鑒定和胚胎移植效率的一倍，而且可以省去性別鑒定的過程，從而降低成本，并且可以減少在性別鑒定中對胚胎造成的損傷，提高胚胎移植成功率。

2.3 具有加快種群改良的優(yōu)勢

在育種工作中，種公牛的選擇強度遠大于母牛的選擇強度，如果采用目前市場上所用的人工授精方法，選擇優(yōu)質公牛精液，至少五代才能培育出優(yōu)質、高產奶牛。而應用精子分選技術，在現有的條件下就可以加大母牛的選擇強度，加快遺傳進展，根據上述的擴增繁育方式，培育優(yōu)良種群的時間將可縮短到3年以下。這將極大地提高育種工作效率。

3 性控凍精人工授精技術要點

性控精液經過XY精子的染色，多次篩選后對精子具有不同程度的損傷。性控凍精在制作時，分離時間延長，從采精到冷凍要比常規(guī)凍精時間長，因而精子的存活時間、受精能力會受到影響，比常規(guī)凍精受精能力稍低。Sartori等研究了用不同劑量的性控冷凍精液對超排青年母牛受精率和胚胎質量的影響，結果不同劑量的X冷凍精子（2×107個/支∶1×107個/支）獲得可用胚胎數無明顯差異，但明顯低于常規(guī)精液的可用胚胎數。另外，使用X精子的青年母牛的受精率明顯低于常規(guī)精液組。表明X精子經分離后受到一定程度的損傷，并影響超排青年母牛的受精率和胚胎的發(fā)育。因此性控凍精比常規(guī)凍精人工授精時間的把握要更加準確，技術要求更加嚴格，具體規(guī)程如下。

3.1 參配牛必須健康

要求無生殖系統(tǒng)疾病及其他疾病，營養(yǎng)均衡，體況適中，以青年牛為主，其次是健康經產牛。

3.2 輸精時間更準確

根據奶牛的年齡、營養(yǎng)、體況、季節(jié)、發(fā)情持續(xù)期、卵泡發(fā)育程度掌握。排卵前3～5 h，發(fā)情結束后5～8 h，卵泡發(fā)育到有一觸即破時為最佳輸精時間。

3.3 輸精位置更確切

一般輸精位置在優(yōu)勢卵泡發(fā)育側子宮角基部前2～3 cm處輸精，如果確定不準就輸在子宮體內，但不要輸在子宮頸內3～5 cm處。

3.4 每個情期只輸精一次

由于性控凍精價格較高，兩次輸精是一種浪費，同時也不利于適時輸精的掌握。牛只排一個卵，適時一次輸精完全可以找準精卵結合的最佳時間。配種后返情的牛，要仔細分析情況，檢查是否有生殖疾病，如各種子宮炎癥，并及時治療，一般每頭牛最多做兩個情期輸精，以后結合治療再用常規(guī)凍精輸精。

3.5 輸精后發(fā)現炎癥及時治療

如果配種后發(fā)現有炎性分泌物，可以在輸精后1～6 h宮注抗生素，以提高受胎率（注意抗奶的處理）。

3.6 結合促排卵保胎激素藥物

可肌肉注射促排3號、絨毛膜促性腺激素、促黃體生成素等，促進卵泡成熟排卵，縮短輸精后精卵結合時間。

3.7 做好配種記錄

每次輸精完畢，繁育員應詳細填寫配種繁殖記錄，內容包括：母牛號、年齡、體況、胎次、發(fā)情時間、與配公牛號、輸精時間、輸精位置、產犢情況、繁育員簽字等。記錄詳細，真實可靠。

3.8 技術水平和責任心

要求人工授精員有較高的現場實際操作經驗，能通過外部觀察及直腸檢查準確判斷發(fā)情牛所處的發(fā)情階段，能判斷卵巢上的優(yōu)勢卵泡，能掌握正確的輸精部位且適時輸精。能準確判斷子宮炎癥并及時治療，會合理應用激素類藥物。

4 性控精液存在的問題及應用前景展望

人們對性別控制精液在奶牛生產中的應用期盼已久，近年來熒光活性細胞的分類將該技術帶到了商業(yè)應用的邊緣。但兩種限制因素依然存在，即分選的速度（可用性和價格）和受精率，還不能滿足國內奶牛繁殖的需要。此外，性控精液的受孕率（含青年牛）約為35%～40%，而常規(guī)精液為55%～60%，限制了生產者應用性控精液的積極性。到目前為止，尚未發(fā)現流式細胞檢索儀分離精子對DNA等有明顯影響:Catt等研究發(fā)現，未見高濃度H33342和紫外線對DNA的內源性缺口有影響；Seidel等認為，染色與未染色精子在通過檢索儀后在運動性和DNA完整性方面無差異，使用流式細胞檢索儀進行精子性別分離后產下的后代沒有明顯的表型或基因型變化。但一些試驗報道表明，使用性別分離精子比非分離者授精后懷孕率低，其原因還不很清楚。還有學者認為在精子分選過程中對精子細胞核的染色及紫外線的照射可能引起遺傳學損傷，因有研究表明，紫外線照射可引起小鼠精子異常率增加，低濃度的Hoechst33342可使金黃地鼠產生突變。因此對于性控精液安全性還需進行深入研究。隨著研究的深入和相關生物技術的不斷發(fā)展，效果更穩(wěn)定的性別控制技術將成為現實，從而推動我國畜牧業(yè)的前進。□