轉移性腎細胞癌中RSK4、CD44及MMP-9的表達及意義

馬 靜，余 州，李明陽，李培峰，李 俠，王 哲，范林妮

轉移性腎細胞癌中RSK4、CD44及MMP-9的表達及意義

馬 靜1,2，余 州1,2，李明陽1,2，李培峰1,2，李 俠1,2，王 哲1,2，范林妮1,2

目的 檢測核糖體S6蛋白激酶4(ribosomal S6 protein kinase 4, RSK4)、CD44和MMP-9在原發性腎細胞癌(primary renal cell carcinoma, pRCC)及轉移性腎細胞癌(metastatic renal cell carcinoma, mRCC)中的表達，探討三者表達水平及與臨床病理特征的相關性。方法 采用免疫組化EnVision法檢測52例pRCC及48例mRCC中RSK4、MMP-9和CD44蛋白的表達，并分析三者表達的相關性及與臨床病理特征的關系。結果 48例mRCC中RSK4、CD44及MMP-9的陽性率分別為75%(36/48)、68.75%(33/48)及91.7%(44/48)，而三者在52例pRCC中的陽性率分別為44.2%(23/52)、34.6%(18/52)及69.2%(36/52)。RSK4、CD44及MMP-9在mRCC中的表達高于pRCC(PRSK4=0.002；PMMP-9=0.002；PCD44=0.001)；RSK4、CD44及MMP-9表達與mRCC患者年齡、性別和腫瘤Fuhrman分級、轉移部位之間未見明確相關性(P>0.05)。在mRCC中，三者之間的表達呈正相關(P=0.008)；兩兩相關分析發現RSK4與CD44(P=0.019)、MMP-9與CD44(P=0.05)的表達之間存在正相關，而RSK4與MMP-9(P=1.00)未見明確相關性。結論 RSK4、CD44及MMP-9在mRCC中的表達高于pRCC，提示三者可能介導腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)的轉移，而其具體作用機制尚有待進一步研究。

腎腫瘤；轉移性腎細胞癌；侵襲轉移；RSK4；MMP-9；CD44

腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，早期RCC起病無明顯癥狀，且缺乏特異性的診斷指標，導致20%～30%的患者在初次就診時已出現不同程度的擴散或者轉移，20%～40%患者術后仍會復發，且復發者預后較差。因此，探索新的腎癌惡性進展相關分子及新的治療靶點顯得尤為重要。RSK4是核糖體S6蛋白激酶(ribosomal s6 kinase, RSK)家族成員之一[1]，與細胞的增殖活化及部分腫瘤的轉移進展有關。本研究小組前期實驗發現RSK4在RCC的表達高于正常腎組織，并且在細胞研究中發現，過表達RSK4的腎癌細胞侵襲遷移能力增強，同時，轉移相關分子CD44及MMP-9的表達也升高[2-3]。但三者在RCC中是否確實存在相關性，且其具體作用機制如何尚不清楚。本實驗采用免疫組化EnVision法同時分析三種分子在轉移性腎細胞癌(metastatic renal cell carcinoma, mRCC)和原發性腎細胞癌(primary renal cell carcinoma, pRCC)中的表達及三者之間的相關性，并分析其與臨床病理特征的關系，旨在探討三者是否具有促RCC轉移的作用，進而為RCC的治療及預后評估提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 組織標本 收集2007～2016年第四軍醫大學西京醫院病理科存檔的100例RCC標本，其中48例為mRCC(其中3例有原發灶)，52例為pRCC，患者均查閱臨床資料并進行隨訪，均無腎臟及腎外的復發轉移灶。pRCC組平均年齡為54.2歲(19～80歲)，其中男性45例，女性7例，男女比為6.4 ∶1，根據Fuhrman核分級進行分級：41例(78.8%)為低分級(1～2級)，11例(21.2%)為高分級(3～4級)。根據AJCC TNM進行分期統計的48例中有47例(97.9%)為低pT分期(pT1及pT2)，1例(2.1%)為高pT分期(pT4)。mRCC組的平均年齡為58.4歲(28～80歲)，其中男性41例，女性7例，男女比為5.9 ∶1。22例為Fuhrman 2級，10例為Fuhrman 3級。轉移部位包括骨(23例)、軟組織(如大腿、坐骨直腸窩等10例)、肺(6例)、腦(5例)、腎上腺(1例)及膽囊(1例)。同時對48例mRCC患者進行了隨訪，共獲得29例患者的生存期資料，統計患者從出現轉移至隨訪截止日期的生存時間，其平均時間為36個月(6～99個月)，隨訪截止日期為2016年10月31日。

1.2 免疫組化及結果判定 采用免疫組化EnVision法分別檢測RSK4、MMP-9及CD44在RCC組織中的表達，染色方法參考文獻[3]：石蠟組織塊4 μm厚連續切片，常規脫蠟至水，PBS沖洗3次，RSK4應用堿修復的方法(pH 9.0，Tris-EDTA)進行抗原修復，CD44、MMP-9應用酸修復法(pH 6.0，檸檬酸-檸檬酸鈉溶液)修復，后用1%H2O2-甲醇作用20 min以消除內源性過氧化物酶；5%(m/V)BSA孵育20 min以封閉非特異性結合位點，分別加入1 ∶50稀釋的RSK4、1 ∶300稀釋的MMP-9、1 ∶150稀釋的CD44一抗，均為兔抗人單克隆抗體(Sigma公司，美國)，4 ℃孵育過夜；次日37 ℃復溫1 h，PBS漂洗3次，加入EnVision(Dako公司，丹麥)二抗室溫孵育40 min，PBS清洗3次后DAB顯色，蘇木精復染，脫水封固。同時用同種非免疫動物血清及PBS代替一抗分別作陰性對照及空白對照。陽性結果為棕黃色顆粒，RSK4陽性定位于胞質，MMP-9陽性為彌漫表達于細胞質及細胞間隙中的棕黃色顆粒，CD44陽性定位于細胞膜。根據文獻[4]對染色結果進行半定量分析：每張切片從陽性細胞比例及細胞著色強度計分，其中陽性細胞比例統計范圍(A)為0～100%；著色強度計分(B)：無陽性著色為0分，弱著色(呈淡棕黃色)為1分，較強著色(呈棕黃色)為2分，強著色(呈明顯的棕黃色)為3分。然后將兩者相乘，3個視野求和，即H score=1×a1+2×a2+3×a3，0≤H≤300，經統計，H中位數為110，故<100為陰性，≥100為陽性。

1.3 統計學分析 采取R×C列表χ2檢驗分析3種抗體在mRCC及pRCC之間的表達差異性及相關性，采取χ2檢驗3種抗體表達水平與mRCC臨床病理特征的關系。采用Kaplan-Meier單因素生存分析檢驗RSK4、CD44、MMP-9表達與mRCC轉移后生存期的關系。所有數據均應用SPSS 13.0軟件獨立分析2遍。

2 結果

2.1 RSK4、CD44、MMP-9蛋白在pRCC及mRCC中的表達 52例pRCC中，RSK4陽性率為44.2%(圖1A)，Fuhrman分級分別為1級1例，2級16例，3級5例，4級1例；TNM分期分別為pT1期19例，pT2期2例。CD44陽性率為34.6%(圖1B)，Fuhrman分級分別為2級14例，3級3例，4級1例；TNM分期為pT1期17例。MMP-9陽性率為69.2%(圖1C)，Fuhrman分級分別為1級1例，2級24例，3級9例，4級2例；TNM分期分別為pT1期27例，pT2期4例，pT4期1例。

48例mRCC中，RSK4陽性率為75%(圖1D)，Fuhrman分級分別為2級16例，3級6例；TNM分期分別為pT1期2例，pT2期1例。CD44陽性率為68.75%(圖1E)，Fuhrman分級分別為2級12例，3級7例；TNM分期分別為pT1期1例，pT2期1例。MMP-9陽性率為91.7%(圖1F)，Fuhrman分級分別為2級20例，3級9例；TNM分期分別為pT1期3例，pT2期1例。

綜上所述，RSK4在mRCC中的陽性率為75%，在pRCC中陽性率為44.2%，兩者相比差異有統計學意義(P=0.002)；CD44在mRCC中的陽性率為68.75%，在pRCC中的陽性率為34.6%，兩組相比差異有統計學意義(P=0.001)；MMP-9在mRCC中的陽性率為91.7%，在pRCC中陽性率為69.2%，兩組相比差異有統計學意義(P=0.002)。RSK4(P=0.002)、CD44(P=0.001)、MMP-9(P=0.002)蛋白在mRCC中的表達均高于pRCC(表1)。

表1 RSK4、CD44及MMP-9在原發性腎細胞癌及 轉移性腎細胞癌中的表達

2.2 RSK4、CD44、MMP-9蛋白表達與mRCC臨床病理特征的關系 本實驗以58.4歲為平均年齡劃分患者，兩組患者RSK4、CD44和MMP-9陽性率相比差異無統計學意義(PRSK4=0.094，PCD44=0.482，PMMP-9=0.382，表2)；41例男性患者與7例女性患者中，不同抗體在不同性別之間的表達差異無統計學意義(PRSK4=0.098，PCD44=0.295，PMMP-9=0.388)；22例Fuhrman 1～2級mRCC患者與10例Fuhrman 3～4級患者中，不同抗體在不同Fuhrman分級之間的表達差異無統計學意義(PRSK4=0.472，PCD44=0.409，PMMP-9=0.935)；不同抗體在不同轉移部位之間的表達差異無統計學意義(PRSK4=0.216，PCD44=0.458，PMMP-9=0.658)，但是可以看出RCC最常見的轉移部位為骨組織，其次為軟組織。采用χ2檢驗分別分析3種抗體的表達與患者各臨床病理特征的關系發現：RSK4、CD44、MMP-9表達與患者年齡、性別、腫瘤Fuhrman分級和轉移部位之間未發現明確相關性(P>0.05，表2)。

2.3 mRCC中RSK4、CD44及MMP-9蛋白表達的相關性分析 在mRCC中，RSK4、CD44及MMP-9的陽性率分別為75%、68.75%及91.7%，統計分析發現三者之間的表達呈正相關(P=0.008，圖2)。

①A①B①C①D①E①F②A②B②C

圖1 RSK4、CD44、MMP-9在同一病例的原發性腎細胞癌及轉移性腎細胞癌中的表達：A.RSK4在原發性腎細胞癌中呈胞質弱陽性；B.CD44在原發性腎細胞癌中呈胞膜弱至中等強度陽性；C.MMP-9在原發性腎細胞癌中呈胞質弱至中等強度陽性；D.RSK4在轉移性腎細胞癌中呈胞質強陽性；E.CD44在轉移性腎細胞癌中呈胞膜及胞質強陽性；F.MMP-9在轉移性腎細胞癌中呈胞質強陽性，EnVision法 圖2 RSK4、CD44、MMP-9在不同病例轉移性腎細胞癌中的表達：A.RSK4呈胞質強陽性；B.CD44呈胞膜及胞質強陽性；C.MMP-9呈胞質強陽性，EnVision法進一步兩兩相關分析發現，RSK4和CD44(r=0.337，P=0.019)、CD44和MMP-9(r=0.285，P=0.05)之間呈正相關；而RSK4和MMP-9(r=0.000，P=1.00)無顯著相關性(表3)。

表2 RSK4、CD44及MMP-9表達與轉移性腎細胞癌臨床病理特征的相關性

表3 RSK4、CD44及MMP-9在轉移性腎細胞癌中表達的相關性

CD44vsRSK4，r=0.337，CD44vsRSK4，P<0.05；MMP-9vsCD44，r=0.285，MMP-9vsCD44，P<0.05；RSK4vsMMP-9，r=0.000，RSK4vsMMP-9，P>0.05

2.4 預后分析 本組對獲得隨訪資料的29例mRCC進行單因素及多因素生存分析，統計了自出現轉移到隨訪截止日期患者的生存狀況。結果顯示，29例mRCC的中位時間為36個月(6～99個月)。單因素生存分析發現，MMP-9的表達與mRCC患者的轉移后生存期相關(P=0.038)，RSK4和CD44蛋白的表達以及患者的年齡、性別、Fuhrman分級和轉移部位均尚不能預測患者RCC轉移后的生存期(P>0.05，表4)。

3 討論

RCC是泌尿系統十分常見的惡性腫瘤之一，其早期診斷比較困難，因此對發病及轉移機制進行深入研究，探索早期診斷、治療、轉移相關分子以及預后評估方法非常必要。首先在病例選取方面，48例mRCC中僅3例與原發病例一一對應，而其余病例可能由于患者初次未在我院就診等客觀原因未能對應原發病例，為保證原發對照組的客觀性和可對照性，作者通過隨訪，挑選手術日期相近、分級分期相似的病例并且隨訪排除了后續出現轉移的病例作為原發對照組。本組通過分析對比RSK4、CD44和MMP-9在mRCC中的表達，發現mRCC中RSK4、CD44和MMP-9的表達顯著增強(PRSK4=0.002，PCD44=0.001，PMMP-9=0.002)，進一步統計分析發現三者表達之間呈正相關(P=0.008)，提示三者在RCC的侵襲轉移中可能發揮作用，在隨后進行兩兩比較，發現CD44與RSK4(P=0.019)、CD44與MMP-9(P=0.05)表達之間存在正相關，而MMP-9和RSK4(P=1.00)表達之間未發現明顯相關性。

表4 29例轉移性腎細胞癌患者復發轉移單因素生存分析

RSK是一種蛋白激酶，存在于細胞質中直到促有絲分裂的作用使其移位至核中促進某些mRNA的翻譯，廣泛參與細胞的生長和增殖，文獻中曾報道RSK4在子宮內膜癌[5]、卵巢癌[6]及乳腺癌[7]中異常表達，說明在腫瘤發生發展、侵襲轉移中存在一定的作用。有文獻報道RSK通過磷酸化其下游的位點EphA2與肺癌、黑色素膠質母細胞瘤和三陰型乳腺癌等惡性腫瘤的細胞運動和促進腫瘤惡性進展密切相關[8]。RSK家族的各個成員在不同組織中擁有不同的表達水平，說明它們各自不同的功能，而成員之間功能的共性仍然有待研究。RSK4作為RSK家族的新興成員，目前的報道十分有限，所以具體功能尚不完全明確。本組前期關于RSK4與RCC的研究中發現，RSK4可能為RCC潛在的獨立預后因子之一，其陽性表達往往提示RCC患者預后不良，這些結果表明RSK4可能是重要的腫瘤促進基因，在RCC的發生和演進中起重要作用[2-3]。本組前期實驗發現，RSK4在RCC中的表達高于正常腎臟，細胞學試驗中發現高表達RSK4的細胞系其侵襲遷移能力增強，提示其可能促進了RCC的轉移[2]。本組結果表明RSK4在mRCC中的表達高于pRCC，與本組前期的猜想一致，但RSK4的這種促轉移的具體機制尚不清楚。

金屬基質酶家族(MMPs)和細胞表面黏附家族分子家族在腫瘤的侵襲轉移中起重要作用。MMP-9是MMPs家族中被最廣泛研究的成員之一，當原癌基因(Ras)活化后，會引起MMP-9轉錄子的聚集及后續MMP-9蛋白的生成，成熟活化的MMP-9可以降解細胞外基質中的明膠，促進腫瘤的侵襲遷移。而CD44與其配體的相互作用可以促進細胞對透明質酸的攝取及降解，增加細胞的遷移能力[9]。在腎癌中，過表達MMP-9及CD44與患者的不良預后相關[10]。另有研究發現CD44與局限性腎透明細胞癌患者術后復發及不良預后相關，但具體機制尚不明確。在本組中mRCC的MMP-9及CD44表達均高于pRCC，進一步提示兩者與RCC的轉移可能相關。但MMP-9陽性的mRCC患者，其轉移后的生存期長于MMP-9陰性患者，提示在相同手術時間后，MMP-9陽性患者可能更早出現了轉移，但該猜想仍需大量的樣本資料進一步證明。

mRCC中RSK4、CD44及MMP-9三者的表達呈正相關，其中兩兩相關分析發現，RSK4與CD44及CD44與MMP-9之間呈正相關。查閱文獻發現，MMP-9基因的轉錄活性及蛋白表達依賴原癌基因活化的RAS-MEK-ERK信號通路[11]，而RSK又是ERK下游表達的激酶，所以猜想RSK通過MER-ERK信號通路調節MMP-9的轉錄及表達。但本組組織學中未發現RSK4與MMP-9之間存在明確的相關性，而與CD44的表達呈正相關，因此需要進一步進行細胞學實驗來揭示其關系。MMP-9可與CD44的胞外結構域結合，并調節CD44自身基因的轉錄[12]，Orgaz等[13]報道MMP-9可以通過CD44增加肌動蛋白的收縮力和p-MLC2的水平，從而增加磷酸化STAT3的水平，使MMP-9更高的表達和分泌，形成一個正反饋循環來維持腫瘤細胞的侵襲轉移，與本組結果一致，即MMP-9與CD44之間的表達存在正相關性。

隨訪100例RCC患者，并通過免疫組化法對RCC組織中RSK4、CD44、MMP-9蛋白表達進行檢測，結果顯示在mRCC中3種蛋白的表達明顯增高，且在mRCC和pRCC中三者表達差異較大(PRSK4=0.002，PCD44=0.001，PMMP-9=0.002)。這些結果表明RSK4、MMP-9、CD44可能是腎癌轉移的促進基因，在腫瘤的發展演進中有著重要的作用，而三者組織學上表達具有相關性，其促轉移的具體機制尚需后續的分子學實驗進一步補充，明確上述問題，將有助于為mRCC的診治提供更多的理論基礎。

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Expression of RSK4, CD44 and MMP-9 in metastatic renal cellcarcinoma and its correlation with clinicopathologic features

MA Jing1,2, YU Zhou1,2, LI Ming-yang1,2, LI Pei-feng1,2, LI Xia1,2, WANG Zhe1,2, FAN Lin-ni1,2

(1DepartmentofPathology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;2DepartmentofPathology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China)

Purpose To investigate the expression of RSK4 (ribosomal S6 protein kinase 4), CD44 and MMP-9 protein in primary renal cell carcinoma (pRCC) and metastatic renal cell carcinoma (mRCC), and to explore the level of expression as well as the association with clinicopathologic features and clinical outcome. Methods The expression of RSK4, CD44 and MMP-9 in 52 pRCC and 48 mRCC samples was detected by immunohistochemistry and its relationship with clinicopathologic features as well as prognosis was analyzed by statistical methods. Results In the 48 mRCC samples, there were 36 (75%, 36/48), 33 (68.75%, 33/48) and 44 (91.7%, 44/48) positive for RSK4, CD44 and MMP-9, respectively, while the positive rate in 52 pRCC samples were 23 (44.2%, 23/52), 18 (34.6%, 18/52) and 36 (69.2%, 36/52), respectively. Statistical analysis showed that the expression of RSK4, CD44 and MMP-9 in mRCC samples was higher than the pRCC samples (PRSK4=0.002,PMMP-9=0.002,PCD44=0.001). Furthermore, the expression of RSK4, CD44 and MMP-9 in mRCC samples was not correlated with ages, genders, Fuhrman grading and the metastatic sites (P>0.05). Further analysis showed that there was positive correlation among the three proteins (P=0.008)， particularly, the expression of RSK4 and CD44 (P=0.019), MMP-9 and CD44 (P=0.05) were positively correlated, while the expression of RSK4 and MMP-9 (P=1.00) had no significance of correlation. Conclusion The expression of RSK4, CD44 and MMP-9 in mRCC samples is significantly higher than pRCC samples, suggesting that the three may mediate the metastasis of renal cell carcinoma, and its specific mechanism of action remains to be further studied.

renal neoplasms; metastatic renal cell carcinoma; invasion and metastasis; RSK4; MMP-9; CD44

國家自然科學基金(81472402、81272651)

1第四軍醫大學病理學教研室，西安 7100322第四軍醫大學西京醫院病理科，西安 710032

馬 靜，女，碩士研究生。E-mail: 854700623@qq.com 范林妮，女，講師，通訊作者。E-mail: fanlinni@fmmu.edu.cn

時間：2017-8-20 15:27 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170820.1527.006.html

R 737.11

A

1001-7399(2017)08-0852-06

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.08.006

接受日期：2017-05-16