銀屑平治療尋常型銀屑病的動物實(shí)驗(yàn)研究

陳都紅　陳少秀　王超

[摘要] 目的 建立Balb/c裸小鼠尋常型銀屑病動物模型，觀察銀屑平對其表皮組織中雙調(diào)蛋白（AREG）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子（KGF）的影響。 方法 Balb/c裸小鼠36只，隨機(jī)分為模型對照組和銀屑平A組、銀屑平B組，三組均連續(xù)8 d于小鼠頭頸部、上肢、軀干和下肢4個(gè)部位皮膚涂咪喹莫特軟膏的方法建模。末次給藥造模第8天，銀屑平A、B組按0.1 g/kg和0.5 g/kg劑量灌胃治療10 d，模型對照組灌等量生理鹽水。于造模第8天和治療第10天，采用皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）對動物頭頸部、上肢、軀干和下肢4個(gè)部位皮膚病變情況進(jìn)行評分；ELISA法定量測定表皮組織勻漿液中AREG、KGF、VEGF和血管內(nèi)皮生長因子受體1（VEGFR1）等指標(biāo)含量。 結(jié)果 銀屑平A組、銀屑平B組和模型對照組造模第8天PASI評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），灌胃治療第10天時(shí)，銀屑平A組、銀屑平B組PASI評分均較模型對照組和同組造模第8天明顯降低（P < 0.05），表皮組織勻漿液中AREG、KGF、VEGF和VEGFR1均低表達(dá)（P < 0.05）。銀屑平A組、銀屑平B組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 銀屑平可能通過降低表皮組織勻漿液中AREG、KGF、VEGF含量，并有可能阻斷VEGF與和VEGFR1結(jié)合，這對抑制表皮病變細(xì)胞角化和皮下組織血管新生，減輕受試動物銀屑病樣病理改變有肯定的干預(yù)作用。

[關(guān)鍵詞] 尋常型銀屑??；銀屑平；雙調(diào)蛋白；血管內(nèi)皮生長因子；角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）08（a）-0021-04

[Abstract] Objective To establish animal models of Balb/c nude mice with psoriasis vulgaris， observe the effect of Yinxieping on double adjustable epidermal tissue protein （AREG）， vascular endothelial growth factor （VEGF） and keratinocyte growth factor （KGF）. Methods 36 Balb/c nude mice were randomly divided into model control group and Yinxieping A group， Yinxieping B group， the three groups were all smeared imiquimod cream for consecutive 8 d in skin of 4 sections in head and neck， upper limbs， torso and lower extremities of mice to built the model. At the dose of 8th day after modeling， Yinxieping A group， Yinxieping B group were treated by gavage for 10 d with 0.1 g/kg and 0.5 g/kg dose， model group was injected into the same amounts saline. At the treatments 8th， 10th day， psoriasis area and severity index （PASI） was used to evaluated the animal head neck， upper limbs， torso and lower extremities 4 skin lesions； ELISA was uesd to determine contents of AREG， KGF， VEGF and vascular endothelial growth factor receptor 1 （VEGFR1） and other indicators in epidermal tissue homogenates in a fixed quantity. Results PASI scores of Yinxieping A group， Yinxieping B group and model control group at modeled 8th day were compared， the differences were not statistically significant （P > 0.05）， when treated by gavage at 10th day， compared with the model control group and themsavies at modeled 8th day， PASI scores of Yinxieping A group， Yinxieping B group decreased significantly （P < 0.05）， the expression of AREG， KGF， VEGF and VEGFR1 in epidermal tissue homogenates was lower （P > 0.05）. Yinxieping A group and Yinxieping B group were compared， the differences were not statistically significant （P > 0.05）. Conclusion Yinxieping can decrease contents of AREG， KGF， VEGF in epidermal tissue homogenate， and it may block the combination of VEGF and VEGFR1， which has positive effects in the inhibition of epidermal keratinocyte lesions and subcutaneous tissue angiogenesis， reducing the subjects change in animal with psoriasis to play parts in pathological intervention.endprint

[Key words] Psoriasis vulgaris； Yinxieping； Amphiregulin； Vascular endothelial growth factor； Keratinocyte growth factor

雙調(diào)蛋白（AREG）是與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）同源的穿膜糖蛋白，其分子C端有相似的表皮生長因子結(jié)構(gòu)，可刺激人成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖，兩者在正常上皮組織均中低表達(dá)，但尋常型銀屑病表皮組織中則高表達(dá)[1]。在皮膚發(fā)育過程中，表皮發(fā)育基因角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子（KGF）具有促進(jìn)表皮細(xì)胞分化作用，其分泌保持在相對穩(wěn)定水平，對抑制上皮細(xì)胞有絲分裂、維持表皮功能具有重要作用，在尋常型銀屑病病理改變時(shí)KGF會出現(xiàn)過度分泌造成表皮過度角化或角化不全的現(xiàn)象[2]。在對尋常型銀屑病的實(shí)驗(yàn)研究中，人們往往局限于以T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)或表皮細(xì)胞因子VEGF過度表達(dá)而忽視了AREG和KGF在尋常型銀屑病中的重要環(huán)節(jié)。銀屑平現(xiàn)已廣泛用于治療銀屑病，目前研究證實(shí)其對銀屑病表皮組織VEGF、白細(xì)胞介素（IL）-8、IL-17、IL-23等有調(diào)節(jié)作用[3-4]。但對AREG和KGF的表達(dá)缺少相關(guān)研究，本文重點(diǎn)研究了以上多因素的相互作用，以期為尋常型銀屑病病理改變和治療發(fā)掘新的理論憑據(jù)和實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

Balb/c裸小鼠36只，體重（18～22）g，采用隨機(jī)數(shù)字表編號隨機(jī)分為模型對照組和銀屑平A、B組（n = 12），實(shí)驗(yàn)過程在十堰市太和醫(yī)院科研中心的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室完成，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SYXK（鄂）2016-0031。

1.2 藥品及試劑

銀屑平（山西華元醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：0.24 g/片，批號：A1400012047）；咪喹莫特軟膏（珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司中山分公司，批號：B14200158 270）；VEGF和VEGFR1酶聯(lián)反應(yīng)ELISA試劑盒（上海浩然生物技術(shù)有限公司，批號：400-31-2、400-31-10）；KGF和AREG酶聯(lián)反應(yīng)ELISA試劑盒（上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司，批號：CSB-E04497、cyt-041）。

1.3造模及治療

將咪喹莫特軟膏均勻涂于小鼠頭頸部、上肢、軀干和下肢4個(gè)部位皮膚，軟膏涂抹厚1 mm、直徑1 cm，三組均連續(xù)8 d。8 d后頭頸部、上肢、軀干和下肢4個(gè)部位出現(xiàn)紅斑、鱗屑、乳頭瘤樣增生、角化過度、局灶性角化不良、病理出現(xiàn)棘層肥厚和淋巴細(xì)胞浸潤等銀屑病樣皮損變化為成模標(biāo)準(zhǔn)[5]。本實(shí)驗(yàn)成功率為100%，造模8 d后所有動物均符合以上銀屑病成模標(biāo)準(zhǔn)。三組治療方法：于末次涂藥第8天，將銀屑平研碎后配制成10%的混懸液備用。末次涂藥造模后，銀屑平A組、銀屑平B組按0.1 g/kg和0.5 g/kg劑量灌胃1次/d，治療10 d，模型對照組灌等量生理鹽水。

1.4 皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）

評分方法：計(jì)算裸鼠頭頸部、上肢、軀干和下肢4個(gè)部位PASI分值。皮損面積評分為4個(gè)體部位，分別以0～6分。面積：0 = 無皮疹；1<10%；2 = 10%～29%； 3 = 30%～49%；4 = 50%～69%；5=70%～89%；6 = 90%～100%；軀干部位：頭面=10%、軀干=30%、上肢=20%、下肢=40%：以上4個(gè)部位分別進(jìn)行皮損面積評分。皮損嚴(yán)重程度：紅斑；浸潤；鱗屑。浸潤（infiltration，I）：皮損向四周擴(kuò)散蔓延的趨勢，邊界模糊不清，壓之有實(shí)質(zhì)感；表皮脫屑/鱗屑（desquamation，D）：指脫落的表皮細(xì)胞成片剝落；紅斑（erythema，E）：紅色或暗紅色炎癥性斑，壓之退色；I、D、E用0～4分評價(jià)：0=無；1=輕度；2=中度；3=重度；4=極重度。根據(jù)以上計(jì)分再計(jì)算PASI總分。PASI=（E頭+I頭+D頭）×A頭×0.1+（E上肢+I上肢+D上肢）×A上肢×0.2+（E軀干+I軀干+D軀干）×A軀干×0.3+（E下肢+I下肢+D下肢）×A下肢×0.4，PASI分值越高代表皮損嚴(yán)重程度越嚴(yán)重[6-7]。

1.5實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)及檢測方法

三組小鼠于造模第8天時(shí)和治療第10天，每組各處死6只，取背部皮膚研磨勻漿，然后3000轉(zhuǎn)離心10 min，取上清液，ELISA法檢測勻漿液中AREG、KGF、VEGF和VEGFR1含量[8]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1小鼠皮損情況觀察

造模前所有小鼠均無銀屑病樣病變發(fā)生，模型對照組和銀屑平A組、銀屑平B組在造模第8天，頭頸部、上肢、軀干和下肢4個(gè)部位均出現(xiàn)紅斑、鱗屑、乳頭瘤樣增生、角化過度、局灶性角化不良現(xiàn)象。病理檢查其表皮出現(xiàn)棘層肥厚和淋巴細(xì)胞浸潤等銀屑病樣皮損病理改變，小鼠背部涂藥皮膚表皮角質(zhì)層出現(xiàn)過度角化現(xiàn)象，釘突延長、棘層變厚，真皮層出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤反應(yīng)，說明用咪喹莫特軟膏涂小鼠皮膚造模是成功的。在治療第10天，模型對照組有3只小鼠表皮有病變加重現(xiàn)象，而銀屑平A組、銀屑平B組皮損消失，無角化、紅斑、鱗屑、乳頭瘤樣增生現(xiàn)象，表皮釘突完全消退。

2.2 銀屑平對小鼠PASI、AREG和KGF的影響

治療第10天，模型對照組PASI、AREG和KGF與同組造模第8天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；銀屑平A組、銀屑平B組治療第10天明顯降低，與模型對照組和同組治療比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。銀屑平A組、銀屑平B組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。endprint

2.3 銀屑平對小鼠VEGF和VEGFR1的影響

模型對照組VEGF和VEGF1治療第10天與同組造模第8天比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；銀屑平A組、銀屑平B組治療第10天明顯降低，與模型對照組和同組治療比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。銀屑平A組、銀屑平B組組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。如表2。

3 討論

尋常型銀屑病屬于“松皮癬”“白疕”“干癬”等范疇，多從血論證辯證施治，以血瘀、血燥、血熱辨證分型，治療時(shí)以活血、養(yǎng)血、涼血為主[9-10]。該病具有泛發(fā)性、易復(fù)發(fā)性和頑固性特征[11-12]。銀屑平具有疏通氣血、軟堅(jiān)消積、清熱解毒、燥濕殺蟲、涼血養(yǎng)陰之功效，臨床用于治療銀屑病[13]。

觀察發(fā)現(xiàn)，銀屑平A組、銀屑平B組小鼠在治療第10天時(shí)，小鼠皮膚組織中AREG、KGF、VEGF和VEGFR1均明顯低于模型對照組和同組造模第8天，小鼠頭頸部、上肢、軀干和下肢4個(gè)部位涂藥處皮損組織基本消退。這說明白銀屑平可能阻斷VEGF與和VEGFR1結(jié)合，并通過抑制表皮病變細(xì)胞角化和皮下組織血管新生來減輕受試動物銀屑病樣病理改變，這可能是治療尋常型銀屑病重要途徑之一。研究表明，VEGF可促進(jìn)尋常型銀屑病病變皮損處組織血管新生，其受體VEGFL在皮膚組織中表達(dá)也會明顯增強(qiáng)，這可能激活真皮乳頭微血管的內(nèi)皮細(xì)胞而促進(jìn)自身的生長而加重尋常型銀屑病病理改變[14]。AREG可刺激人成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖，在尋常型銀屑病表皮組織中高表達(dá)[15]。KGF在皮膚角化不全和過度增殖等形態(tài)學(xué)改變的過程中發(fā)揮重要作用，KGF主要來源于T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，募集在表皮組織中的T淋巴細(xì)胞在活化后會刺激成纖維細(xì)胞不斷產(chǎn)生KGF，造成表皮細(xì)胞角質(zhì)過度增殖[16]。由于尋常型銀屑病發(fā)病多以風(fēng)熱、風(fēng)寒、寒溫、濕熱、燥毒之邪侵襲肌膚有關(guān)，且患者多因?yàn)榉A賦先天不足，情志內(nèi)傷導(dǎo)致氣血運(yùn)行受阻、內(nèi)外合邪而致血瘀，瘀血內(nèi)停，瘀久化熱，瘀熱互結(jié)，搏于氣血而致病[17-18]?！把觥⒀獰岷脱铩必灤┯诩膊〉陌l(fā)展全過程，故中醫(yī)治療多強(qiáng)調(diào)“涼血養(yǎng)陰”為主，兼以“活血解毒”為輔，銀屑平丸就是根據(jù)這一治療原則研制而出的純中藥制劑[19]。在本實(shí)驗(yàn)中，模型對照組AREG、KGF、VEGF和VEGFR1等指標(biāo)異常升高，而銀屑平可以明顯降低銀屑病樣小鼠模型皮膚組織中的含量，此結(jié)果提示銀屑平丸可能是通過抑制以上指標(biāo)而達(dá)到治療銀屑病的目的。分析認(rèn)為，這與本方中生地黃、半枝蓮、大青葉、白花蛇舌專清熱涼血解毒養(yǎng)陰、清熱解毒有關(guān)。針對本病的熱瘀病機(jī)，方中牡丹皮、紫草、赤芍、丹參具有清熱涼血、活血化斑的作用。而白鮮皮以皮達(dá)皮、清熱祛風(fēng)止癢，女貞子、旱蓮草養(yǎng)陰生津，助生地加強(qiáng)滋陰之效，甘草清熱解毒兼調(diào)和諸藥，又可顧護(hù)脾胃，本方清熱之中兼以養(yǎng)陰、涼血與活血散瘀配伍并用，共奏清熱解毒、涼血散瘀、養(yǎng)陰生津之功[20]。

綜上所述，銀屑平可能通過抑制VEGF與VEGFR1結(jié)合來減少皮損部位的血管增生，同時(shí)，可能通過抑制與VEGF同源的細(xì)胞因子AREG的分泌來減少成纖維細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖，使KGF介導(dǎo)的表皮細(xì)胞過度角化現(xiàn)象減輕，從而達(dá)到治療尋常型銀屑病的目的。

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（收稿日期：2017-04-11 本文編輯：蘇 暢）endprint