歸芪聰志湯對血管性癡呆大鼠模型腦組織氧化應激損傷的影響

顧 靜 吳紅彥 李海龍 楊長生 王虎平 車 敏

(甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000)

歸芪聰志湯對血管性癡呆大鼠模型腦組織氧化應激損傷的影響

顧 靜 吳紅彥 李海龍 楊長生 王虎平 車 敏

(甘肅中醫藥大學基礎醫學院，甘肅 蘭州 730000)

目的觀察歸芪聰志湯對血管性癡呆(VD)大鼠模型腦組織氧化應激損傷的作用。方法采用反復夾閉頸動脈加注射硝普鈉降壓再加單側永久結扎頸總動脈法制備VD模型，從行為學、組織病理、氧化應激酶學三個方面觀察歸芪聰志湯對VD的影響。結果對比假手術組，模型組大鼠定位航行潛伏期明顯延長，空間搜索穿越平臺次數明顯減少(P<0.05)，海馬病理切片顯示：細胞數量明顯較少、細胞輪廓模糊皺縮、胞質深染、核不清晰，丙二醛(MDA)含量增加，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性均明顯降低；歸芪聰志湯中劑量組中、高劑量組上述指標明顯改變，尤以中劑量組效應最明顯。對比模型組，中劑量歸芪聰志湯組大鼠定位航行潛伏期明顯變短，空間搜索穿越平臺次數明顯增多，海馬病理切片顯示細胞損傷減輕，MDA含量明顯降低，SOD 和GSH-Px活性明顯升高；中劑量歸芪聰志湯療效類似于甚至優于西藥腦復康。結論中劑量歸芪聰志湯通過抗氧化應激作用保護VD大鼠腦組織，改善其病理損傷和記憶功能。

血管性癡呆；氧化應激；歸芪聰志湯

血管性癡呆(VD)主要是腦血管病變引起供血不足而致腦組織缺血缺氧性改變，最終使大腦功能全面衰退。近年來缺血缺氧引起的氧化應激在VD中的病理損傷作用越來越受到重視〔1～3〕，氧自由基通過氧化損傷神經元細胞膜中的不飽和脂肪酸，改變細胞膜表面Na+-K+-ATP酶活性等作用損傷神經元〔2〕。腦組織缺血缺氧性改變往往涉及并表現為腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量〔4〕、活性的改變。本研究以王清任治療中風名方“補陽還五湯”化裁，自擬歸芪聰志湯干預VD大鼠模型觀察其藥效和相關分子機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物、試劑 SPF級Wistar大鼠80只，體重(280±10)g，飼料由甘肅中醫學院科研實驗動物中心提供。SOD、MDA、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購自南京建成科技有限公司；多聚甲醛等基礎試劑購自天津科化。

1.2藥物 歸芪聰志湯藥物用量參照2010年版《中華人民共和國藥典》及全國高等中醫院校規劃教材《方劑學》確立的比例為當歸∶黃芪∶川芎∶苦參∶枸杞子∶地龍∶石菖蒲=6∶3∶3∶3∶3∶2∶2，各藥物用量按人與動物體表面積比換算。藥劑制備：采用傳統水煎法，加中藥10倍量水冷浸1 h，然后加熱煮沸40 min，濾出煎液，藥渣再加6倍量水煮沸40 min，合并兩次煎液。將藥液平均分成7份，取1份量為低劑量，2份量為中劑量，4份量為高劑量。將三組藥液分別水浴濃縮成252 ml，低、中、高劑量濃度為1.39、2.77、5.54 g/ml，4℃儲存備用；腦復康(吡拉西坦膠囊，陜西白鹿制藥股份有限公司)，腦復康藥液的配制：用雙蒸水配制成濃度為0.09 g/ml水溶液，4℃儲存備用。

1.3VD大鼠模型制備 采用反復夾閉頸動脈加注射硝普鈉降壓再加單側永久結扎頸總動脈法。大鼠術前禁食、水，用10%水合氯醛麻醉，常規消毒，頸正中切口，分離雙側頸總動脈，模型組及藥物組在夾閉雙側頸總動脈之前，腹腔注射硝普鈉(2.0 mg/kg)，隨即用無創動脈夾夾閉雙側頸總動脈10 min，隨后去除動脈夾通血10 min，共間歇阻斷-再通雙側頸總動脈血流3次，之后結扎一側頸總動脈，縫合傷口、保溫飼養。假手術組僅分離雙側頸總動脈。術后肌注慶大霉素預防感染。

1.4動物分組及給藥 大鼠隨機分為6組：假手術組、模型組、西藥組(腦復康)、歸芪聰志湯高劑量組、中劑量組、低劑量組。歸芪聰志湯各組按高、中、低劑量灌胃給藥，西藥組給予腦復康，假手術組、模型組給予等量生理鹽水，每日一次，連續灌胃治療23 d。

1.5Morris水迷宮行為學檢測 訓練開始時將大鼠任意從四個象限之一面向池壁入水，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺所需時間(逃逸潛伏期)。每次大鼠共游120 s尋找平臺，若成功找到給予15 s休息時間，若未找到，將其引至平臺也休息15 s，逃逸潛伏期為120 s。連續訓練4 d，上午2次，下午2次。第5天撤去平臺，將大鼠面向池壁放入水中找記憶平臺，每只大鼠限時游60 s，記錄其在60 s內游過原平臺相應位置的次數。數據采集和處理由Morris迷宮圖像自動監視處理系統完成。

1.6海馬組織病理切片觀察 禁食12 h頸椎脫臼處死大鼠，使頭置于冰塊上開顱取出腦，冰盤上剝離取出大腦皮質及海馬，保存于-80℃備用。將海馬放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規乙醇梯度脫水，二甲苯透明后石蠟包埋；海馬區石蠟切片、脫蠟、復水、蘇木素染色；鹽酸乙醇分化、伊紅復染、乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察。根據大鼠海馬病理切片顯示的神經細胞特點，從細胞輪廓、細胞數量、胞質深染程度、胞核清晰度等4個方面描述評價神經細胞損傷程度。每個觀察指標按下述標準依次評分為1、2、3分，各指標累計評分越高表示細胞損傷越嚴重。細胞輪廓：1分：清楚飽滿，2分：部分模糊皺縮，3分：模糊皺縮；細胞數量：1分：多，2分：較多，3分：少；胞質深染程度：1分：未深染，2分：部分深染，3分：深染；胞核清晰度：1分：清晰，分：較清晰，3分：不清晰。

1.7大鼠腦皮質勻漿液氧化應激酶學指標檢測 準確稱取大鼠腦皮質1 g，按1/9的比例加入9倍體積的冷生理鹽水勻漿，4℃，2 500 r/min離心10 min，取上清液用冰生理鹽水按1/1稀釋成5%組織勻漿液。用考馬斯亮藍蛋白定量試劑盒，于595 nm處測OD值，繪圖，運用公式計算蛋白含量。分別采用黃嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸比色法、酶促反應。按試劑盒操作說明測定SOD、MDA及GSH-Px活性。

1.8統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1Morris 水迷宮行為學檢測結果 模型組與假手術組比較，大鼠逃逸潛伏期明顯增長5.7倍(P<0.05)，與模型組比較各治療組大鼠逃逸潛伏期均明顯縮短，中劑量組縮短了71.6%(P<0.05)，與西藥組比較，歸芪聰志湯中劑量組大鼠逃逸潛伏期縮短最顯著(P<0.05)。模型組與假手術組比較，大鼠穿越平臺次數減少70%(P<0.05)，與模型組比較歸芪聰志湯高劑量組、中劑量組、西藥組大鼠穿越平臺次數顯著增多，中劑量組增加了1.9倍(P<0.05)，與西藥組比較，中劑量組大鼠穿越平臺次數增多最顯著(P<0.05)。見表1。

2.2海馬組織病理切片觀察 假手術組4個觀察指標海馬神經細胞損傷合計為4分，模型組為12分，西藥組為10分，歸芪聰志湯高劑量組為8分，歸芪聰志湯中劑量組為4分，歸芪聰志湯低劑量組為10分。與假手術組比較，模型組海馬神經細胞數量較少、細胞輪廓模糊皺縮、胞質深染、核不清晰、損傷嚴重；與模型組比較，各治療組海馬神經細胞損傷程度均有好轉；中、高劑量歸芪聰志湯對海馬神經細胞損傷的改善作用優于西藥組。見表2，圖1。

表1 Morris水迷宮行為學檢測結果

與假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與西藥組比較：3)P<0.05，下表同

表2 各組海馬組織病理切片評分(分)

圈內為細胞固縮深染主要區域圖1 各組海馬組織病理切片(HE，×40)

2.3腦皮質勻漿SOD、GSH-Px活性及MDA含量檢測結果 與假手術組比較，模型組大鼠MDA含量顯著增加了1.11倍(P<0.05)。與模型組比較，西藥組和歸芪聰志湯高、中、低劑量組明顯抑制腦皮質MDA含量，分別下降了21.8%、24.4%、37.2%和7.7%(P<0.05)。與西藥組相比，歸芪聰志湯中劑量組對MDA的抑制作用明顯增強(19.7%，P<0.05)，歸芪聰志湯高劑量組抑制效應類似于西藥組，歸芪聰志湯低劑量組作用較弱。與假手術組比較，模型組大鼠SOD、GSH-Px活性分別降低80.76%和80.80%(均P<0.05)。與模型組比較，西藥組和歸芪聰志湯組明顯提高上述酶的活性：西藥組SOD、GSH-Px活性分別增加了2.57倍和0.99倍；歸芪聰志湯中劑量組分別提高了4.08倍和2.59倍，中劑量組歸芪聰志湯組分別提高了2.83倍和1.23倍，低劑量歸芪聰志湯組分別提高了81.97%和23.6%(P<0.05)。中劑量歸芪聰志湯組對SOD和GSH-Px活性的增強作用優于西藥組(SOD 42.2%，GSH-Px 80.6%，均P<0.05)，高劑量組效應類似于西藥組，低劑量歸芪聰志湯作用較弱。見表3。

表3 各組腦皮質勻漿SOD、GSH-Px活性

3 討 論

研究認為兩血管阻斷法(2-VO)改良法〔5～8〕——反復阻斷再灌注聯合腹腔注射硝普鈉法重復性、穩定性好，操作簡單，對動物創傷小，存活率高，并且與VD發病機制相似，但應該注意兩點，第一此方法對硝普鈉注射量、環境溫度要求較高，所以本次實驗開始前進行了預實驗，摸索硝普鈉的注射條件，發現硝普鈉注射量按文獻2.5 mg/kg〔5〕的量過大，實驗后最后確定硝普鈉注射量為2.0 mg/kg時，手術時室溫控制在28℃，術后24 h內控制在25℃時大鼠狀態穩定，死亡數減少；第二考慮反復阻斷再灌注造成短暫性腦缺血，術后大鼠可能會恢復，所以手術中反復阻斷三次雙側頸總動脈后直接永久性結扎左側頸總動脈，這樣可以切斷大約三分之一的腦供血，造成慢性腦供血不足狀態，更接近VD發病機制。由于大腦細胞耗氧量高，抗氧化物含量較低，大腦很容易受到氧化應激損傷。腦缺血后生成大量自由基，腦內脂質過氧化作用加強，因此自由基毒性已成為腦缺血損害的關鍵病理因素。MDA是脂質代謝產物，可反映機體脂質過氧化的速率及強度，并間接反映組織受自由基損傷的程度，本實驗表明，VD發生過程中MDA含量的改變與抗氧化酶活性密切相關，論證了氧化損傷是VD病理機制之一，提示該病治療應從抗氧化損傷出發，從中醫治法角度來看，應該積極的“益氣解毒”。歸芪聰志湯(黃芪、當歸、地龍、石菖蒲、苦參等) 是根據中醫腦病的癥候特點，不局限傳統活血化瘀的中風療法，而針對濁毒損傷腦絡這一關鍵病機，應用益氣活血解毒治法。方中重用黃芪、當歸為君，益氣養血，活血通絡；以川芎理氣活血通瘀，苦參清解濕熱毒火為臣；以枸杞子滋補肝腎、益精填髓，地龍活血通腦絡，石菖蒲以化濁開竅醒神為佐藥。諸藥相合，攻補兼施，標本兼顧，使神竅得養，腦絡清利。現代藥理研究證明黃芪多糖具有抗衰老、抗應激、抗氧化等藥理作用，可改善VD小鼠的學習記憶能力〔9，10〕；當歸可抗氧自由基、抑制細胞鈣超載、改善腦微循環，清除自由基，提高抗氧化酶活性，減輕膜脂質過氧化，抑制衰老模型小鼠腦組織細胞凋亡，改善其學習記憶能力〔11〕；川芎嗪擴張小血管、改善微循環等作用，抑制自由基、SOD等作用〔12〕；苦參抑制中樞神經炎癥介質釋放，保護神經元損傷，進而控制VD發展〔13〕。本研究證明歸芪聰志湯能有效抵抗氧化應激對VD大鼠腦組織的破壞作用，從認知功能和組織病理學方面改善VD大鼠的疾病進程。

1郭軒東，常履華.血管性認知障礙研究進展〔J〕.醫學綜述，2010；16(9)：1379-81.

2Gomez-Ramos A，Diaz-Nido J，Smith MA，etal.Effect of the lipid peroxidation product acrolein on tauphosphorylation in neural cells〔J〕.J Neurosci Res，2003；71(6)：863-70.

3王天俊，郎靜芳，呂佩源，等.血管性癡呆小鼠海馬 CA1 區 Calpain I 表達的變化〔J〕.疑難病雜志，2010；9(2)：85-9.

4孫文佳，葉山東.腎小球系膜細胞與氧化應激〔J〕.國際病理科學與臨床雜志，2011；31(5)：448-521.

5王 蕊，楊秦飛.大鼠擬血管性癡呆模型的改進〔J〕.中國病理生理雜志，2000；16(10)：914-6.

6王興華，李露斯.兩種大鼠 2-VO 模型制作方法的比較〔J〕.第三軍醫報，2004；24(12)：1496-9.

7黃文革，郭芬芬，劉慰華，等.血管性癡呆動物模型制作方法的改良〔J〕.中國比較醫學雜志，2011；21(5)：49-52.

8唐啟盛，黃肩福，郭建文.高脂血癥火鼠缺血再灌流誘發行為學障礙模型的實驗研究〔J〕.北京中醫藥大學學報，1997；20(5)：34-6.

9李英順，李天琪，梁 莎，等.黃芪多糖對血管性癡呆大鼠學習記憶能力的影響〔J〕.延邊大學醫學學報，2013；36(2)：92-4.

10劉志洋，萬 朋，高俊濤.黃芪多糖對血管性癡呆小鼠學習記憶能力的影響〔J〕.吉林醫藥學院學報，2014；35(1)：14-6.

11李雪燕，陳開兵，張麗云.當歸多糖對衰老模型小鼠學習、記憶能力及腦組織凋亡蛋白表達的影響〔J〕.中醫研究，2013；26(6)：68-71.

12Xiao X，Liu Y，Qi C，etal.Neuroprotection and enhanced neurogenesis by tetramethylpyrazine in adult rat brain after focal ischemia〔J〕.Neurol Res，2010；32(5)：547-55.

13倪晶晶，吳仲敏，凌樹才.苦參堿注射液對老年癡呆模型大鼠腦組織白細胞介素1β含量及海馬神經元超微結構的影響〔J〕.解剖學雜志，2006；29(5)：608-11.

〔2016-06-16修回〕

(編輯 曹夢園)

R749.1+3

A

1005-9202(2017)18-4443-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.006

甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室自主課題(ZDSYS-ZZKJ-2013〔B〕-004)

顧 靜(1980-)，女，副教授， 博士，主要從事心血管藥理生理學研究和循證中醫藥研究。