基于微通道傳感器的牛奶體細(xì)胞定量檢測(cè)方法研究

張曉晨++龔瑞昆++崔傳金

體細(xì)胞數(shù)（SCC）是指每毫升牛奶中含有的細(xì)胞總數(shù)，它是衡量新鮮的牛奶質(zhì)量及奶牛乳房健康的重要指標(biāo)之一。當(dāng)奶牛乳房感染時(shí)，體細(xì)胞數(shù)會(huì)明顯增加，奶牛的產(chǎn)奶量會(huì)降低，并且牛奶中含有致病菌的風(fēng)險(xiǎn)增大，影響人類健康。體細(xì)胞數(shù)做為衡量牛奶質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，世界各國(guó)對(duì)體細(xì)胞數(shù)制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，其中新西蘭的標(biāo)準(zhǔn)最為嚴(yán)格，為SCC≤40萬(wàn)/mL。我國(guó)發(fā)布了《中國(guó)農(nóng)墾生鮮乳生產(chǎn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，第一次對(duì)體細(xì)胞數(shù)有了規(guī)定，為40萬(wàn)/mL。

檢測(cè)體細(xì)胞含量的方法也多種多樣。其中電化學(xué)阻抗法在細(xì)胞定量檢測(cè)方面具有操作簡(jiǎn)便、成本低、能實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，是一種極具優(yōu)勢(shì)的檢測(cè)方法，特別是與微流控技術(shù)結(jié)合使這個(gè)方向成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。

本文使用微通道傳感器，運(yùn)用阻抗檢測(cè)技術(shù)，研究了牛奶中細(xì)菌細(xì)胞的濃度。在未來(lái)阻抗檢測(cè)技術(shù)會(huì)與新領(lǐng)域相結(jié)合，以達(dá)到更低的檢測(cè)限，縮短檢測(cè)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)功能多樣化。

試驗(yàn)研究

儀器與試劑。GamryReference 600電化學(xué)工作站、C1-20B離心機(jī)、XYF2-10-H超純水機(jī)， thermo二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，BHLM-M18無(wú)油真空泵，LDZX-30KBS壓力蒸汽滅菌器，K562細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)）。

細(xì)胞懸浮液的制備。將新鮮牛奶用真空泵過(guò)濾后，于室溫下盛放于燒杯中備用。培養(yǎng)后的K562細(xì)胞按照計(jì)算好的比例分成六份，用離心機(jī)分離細(xì)胞，離心后去除上層清液。將細(xì)胞與定量的牛奶混合，制成20萬(wàn)，40萬(wàn)，80萬(wàn)，160萬(wàn)，320萬(wàn)，640萬(wàn)六個(gè)濃度的細(xì)胞懸浮液，放置在培養(yǎng)箱中等待檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)所用器皿都經(jīng)過(guò)高溫滅菌處理。

阻抗的檢測(cè)。微通道傳感器的阻抗檢測(cè)使用GamryReference 600電化學(xué)工作站完成，頻率測(cè)試范圍為10Hz-1MHz。測(cè)試前，用乙醇和超純水清洗芯片，晾干使用。測(cè)試時(shí)用注射器將細(xì)胞懸浮液慢慢推送到微通道內(nèi)，為了使測(cè)量到的阻抗更加準(zhǔn)確，減小不利因素對(duì)檢測(cè)的影響，每組濃度檢測(cè)三次并取其平均值進(jìn)行分析。在測(cè)量結(jié)束后立即丟棄檢測(cè)樣品，避免污染。

結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，盡可能排除其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，所有不同濃度的細(xì)胞均是現(xiàn)配現(xiàn)用。分別對(duì)20萬(wàn)/ml，40萬(wàn)/ml，80萬(wàn)/ml，160萬(wàn)/ml，320萬(wàn)/ml，640萬(wàn)/ml的牛奶溶液進(jìn)行了測(cè)量，結(jié)果如圖1所示。在低頻率下，隨著牛奶中細(xì)胞濃度的增大，阻抗逐漸增大，不同細(xì)胞濃度的牛奶有著良好的區(qū)分度。隨著頻率的逐漸增大，各濃度曲線漸漸重合，阻抗值的變化減小，無(wú)法很好地區(qū)分各濃度牛奶。綜上所述，采用低頻率測(cè)試較為合適。

測(cè)試的阻抗是電阻和電抗的矢量和，電抗由兩部分組成，界面電抗和奶體的介質(zhì)電抗。細(xì)胞懸浮在牛奶中，是奶體介質(zhì)電容的主要阻抗部分。當(dāng)細(xì)胞濃度大時(shí)，介質(zhì)電容很大，對(duì)奶體的電抗起作用。但由于界面電抗遠(yuǎn)大于介質(zhì)電抗，使界面電容充放電的時(shí)間更長(zhǎng)，而介質(zhì)電容的充放電時(shí)間短，使得電活性離子更容易在界面處堆積，從而使界面電容增大，而介質(zhì)電容表現(xiàn)出較小值，進(jìn)而影響牛奶中細(xì)胞濃度檢測(cè)的檢測(cè)限。因此，為了盡量減小界面電容的影響，提高電抗，本實(shí)驗(yàn)采用提高介質(zhì)電阻的方法。增加了微通道的長(zhǎng)度，減小了橫截面積，從而增大了介質(zhì)電阻。

在實(shí)際測(cè)量中，由于微通道內(nèi)部的體積非常小，所以當(dāng)細(xì)胞濃度為20萬(wàn)/mL和40萬(wàn)/mL時(shí)，理論上通道內(nèi)的細(xì)胞個(gè)數(shù)應(yīng)為6個(gè)和12個(gè)，相差非常小，再加上實(shí)際操作及環(huán)境等因素的影響，使得測(cè)量結(jié)果非常接近。在未來(lái)研究中，將會(huì)嘗試進(jìn)一步增大電抗的方法，以期獲得更大的阻抗改變。endprint