?；o酶A-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義*

梁慧玲，伍龍，張一橋，陳能，馮翎，蔣振旻，陳心，徐細(xì)明

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院 腫瘤中心，湖北 武漢 430060）

酰基輔酶A-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義*

梁慧玲，伍龍，張一橋，陳能，馮翎，蔣振旻，陳心，徐細(xì)明

（武漢大學(xué)人民醫(yī)院 腫瘤中心，湖北 武漢 430060）

目的研究酰基輔酶A-膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1（ACAT1）和?；o酶A-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶2（ACAT2）在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義。方法收集60例結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織、癌旁組織和正常腸道黏膜組織，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)3組組織中ACAT1和ACAT2的基因和蛋白表達(dá)水平，采用SPSS 20.0軟件分析其表達(dá)量與結(jié)腸癌患者臨床病理因素之間的關(guān)系。結(jié)果結(jié)腸癌組織中ACAT1和ACAT2在基因和蛋白水平的表達(dá)量與癌旁組織和正常腸道黏膜比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)腸癌組織高于另外兩組。ACAT1和ACAT2的基因表達(dá)與患者的年齡、Duke分期、組織分化程度相關(guān)，且二者在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論ACAT1和ACAT2在結(jié)腸癌組織中呈高表達(dá)，且與患者的部分臨床病理特征相關(guān)，對(duì)臨床上早期診斷結(jié)腸癌有一定的參考價(jià)值。

結(jié)腸癌；酰基輔酶A-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶；表達(dá)

Abstract:ObjectiveTo explore the expressions and clinical significance of acyl coenzyme A-cholesterol acyltransferase 1(ACAT1)and ACAT2 in patients with colon cancer.MethodsThe colon cancer,paracancerous and normal colon tissues of 60 patients with colon cancer were collected.PCR and immunohistochemical staining were used to detect the gene and protein expression levels ofACAT1andACAT2in the tissues,and then SPSS20.0 was used to analyze their correlations with clinicopathological indices.ResultsThe gene and protein expressions ofACAT1andACAT2in the colon cancer tissues were higher than those in the paracancerous tissues and the normal colon tissues,and the differences were statistically significant(P＜0.05).The expressions ofACAT1andACAT2genes were correlated to age of the patients,Duke's stage and degree of tumor differentiation;and there was a correlation between the expressions of both genes in the colon cancer tissues(P＜0.05).ConclusionsACAT1 and ACAT2 are highly expressed in colon carcinoma tissues,and their expressions are correlated to some clinical pathological characteristics such as the degree of differentiation of colon cancer and the distant metastasis.Therefore ACAT1 and ACAT2 have potential clinical significance for the early diagnosis of colon cancer.

Keywords:colon cancer;acyl coenzyme A-cholesterol acyltransferase;expression

結(jié)腸癌是男性最常見的惡性腫瘤之一，在女性中僅次于乳腺癌，2012年結(jié)腸癌的死亡人數(shù)男性與女性分別為140萬和69.39萬。其中澳大利亞/新西蘭、歐洲、北美洲的發(fā)病率最高，非洲以及中南亞的發(fā)病率較低。大部分地區(qū)男性的發(fā)病率較女性高[1-2]。隨著生活水平的日益提高，膳食結(jié)構(gòu)不合理，高蛋白質(zhì)、高熱量食物攝入量增加，我國己經(jīng)是結(jié)腸癌高發(fā)的國家之一[3]。

結(jié)腸癌的危險(xiǎn)因素包括低纖維、高脂飲食，飲酒、吸煙以及肥胖。關(guān)于結(jié)腸癌的病因雖然在世界各國做了大量的研究，但至今尚未完全闡明[4]。高脂飲食作為其重要影響因素之一是如何影響結(jié)腸癌的發(fā)生與惡變，其機(jī)制尚未完全明確[5]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗可增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[6]，患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)也更高[7]，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，胰島素水平增高可引起胰島素樣生長因子活性增強(qiáng)，而胰島素樣生長因子與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期相關(guān)，會(huì)增加結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲[8]。研究發(fā)現(xiàn)，高胰島素上調(diào)巨噬細(xì)胞?；o酶A-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（acyl coenzymeA-cholesterolacyltransferase1，ACAT1）mRNA和蛋白表達(dá)[9-10]，這可能是高胰島素水平影響結(jié)腸癌發(fā)病的途徑。此課題擬研究ACAT1和ACAT2在結(jié)腸癌癌變過程中的表達(dá)情況，以探究ACAT1和ACAT2在大腸癌中的表達(dá)及臨床意義。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年1月-2015年9月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院接受腫瘤切除術(shù)的結(jié)腸癌患者60例。其中,男性36例，女性24例；年齡47～77歲，中位年齡65歲。所有標(biāo)本均詳細(xì)記載患者的基本信息，記錄腫瘤大小、分化程度、Duke分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等情況。所有病例均于腫瘤切除后1/2 h內(nèi)取癌組織、癌旁組織（離腫瘤邊緣3～5 cm）和對(duì)應(yīng)正常黏膜組織（離開腫瘤邊緣＞5 cm），迅速放置液氮或甲醛中保存，1 h后轉(zhuǎn)入深低溫冰箱-80℃保存。該研究經(jīng)過武漢大學(xué)人民醫(yī)院臨床研究倫理學(xué)會(huì)委員會(huì)批準(zhǔn)、患者入院時(shí)均簽知情同意書。

1.1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①初次結(jié)腸癌手術(shù)后臨床資料和病理檢查完整的結(jié)腸癌患者；②入選前2周內(nèi)行腹部CT、腹部B超、內(nèi)鏡觀察或者取檢等檢查初步診斷為結(jié)腸癌患者；③入選前1周內(nèi)已完善相關(guān)術(shù)前檢查，無明顯異常，可行結(jié)腸癌根治術(shù)患者；④結(jié)腸單一部位病變；⑤由2位以上病理醫(yī)師共同確診；⑥結(jié)腸癌病例有完整的隨訪資料；⑦術(shù)前均未行新輔助放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非首次就診病例；②結(jié)腸多部位病變或者結(jié)腸癌已經(jīng)發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移，無法做到腫瘤根治性切除的患者；③手術(shù)不能耐受患者；④腫瘤較小，取樣會(huì)影響患者腫瘤標(biāo)本的病檢操作的患者；⑤家族性腺瘤性息肉病及其他結(jié)腸疾病，例如潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸結(jié)核、克羅恩病。

1.1.2 人結(jié)腸癌組織標(biāo)本收集 正常組織來源于距腫瘤邊緣5 cm以上的正常腸壁組織，癌旁組織來源于距腫瘤邊緣3～5 cm的腸壁組織。標(biāo)本經(jīng)適當(dāng)處理后，置于-80℃低溫冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)ACAT mRNA的表達(dá) 組織低溫充分勻漿后，用Trizol試劑抽提總RNA，取總RNA 5μl，在20μl逆轉(zhuǎn)錄體系中合成cDNA，以5μl cDNA為模板加入靶基因正反向引物，在50μl體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最終獲得各樣本中ACAT1與ACAT2的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2 免疫組織化學(xué)方法分析ACAT蛋白的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)了60例結(jié)腸癌組織中ACAT1和ACAT2蛋白的表達(dá)。（ACAT1、ACAT2一抗均為即用型，選取PBS代替一抗作為陰性對(duì)照）。具體操作步驟如下：石蠟切片經(jīng)二甲苯、酒精常規(guī)脫蠟至水；3%雙氧水H202室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min×3次；滴加10%封閉用胎牛血清（FBS）工作液，室溫下20 min；滴加兔抗人一抗（美國Sigma公司）50μl，4℃過夜；復(fù)溫后，PBS沖洗，5 min×3次；滴加適量生物素標(biāo)記羊抗兔二抗（美國Sigma公司）50μl，37℃孵育10～30 min；滴加適量的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30 min；PBS沖洗，5 min×3次；加入新鮮DBA顯色劑顯色15 min；自來水充分沖洗15 min；蘇木精復(fù)染；脫水，透明；封片，顯微鏡（德國萊卡公司）下行結(jié)果判斷。

1.3 結(jié)果判讀

分別由2名專業(yè)人員在未知任何臨床與病理資料的情況下使用Image Pro Plus 6.0軟件根據(jù)切片的陽性細(xì)胞數(shù)比例和染色深度對(duì)免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。當(dāng)2名專業(yè)人員的判斷結(jié)果不一致則釆取共同討論決定。ACAT蛋白定位于細(xì)胞漿中，以胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒的細(xì)胞作為陽性細(xì)胞。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定參照染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞數(shù)綜合評(píng)分判斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.1 染色強(qiáng)度評(píng)分 每張切片選擇5個(gè)高倍視野（×400倍）進(jìn)行觀察，無色或藍(lán)色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕揭色為3分。

1.3.2 染色細(xì)胞數(shù)評(píng)分 計(jì)數(shù)每張切片中的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野，每次計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，取其平均值，折合成分值:陽性細(xì)胞比例0為0分，陽性細(xì)胞比例1%～25%為1分，陽性細(xì)胞比例26%～50%為2分，陽性細(xì)胞比例51%～75%為3分，陽性細(xì)胞比例＞75%為4分。

1.3.3 計(jì)算綜合評(píng)分 按陽性細(xì)胞分值與染色分值的乘積對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組積分相乘時(shí)陰性（-）為0分、弱陽性（+）為1～4分，中度陽性（++）為5～8分，強(qiáng)陽性（+++）為9～12分，其中弱陽性、中度陽性及強(qiáng)陽性均歸為陽性。

1.4 相關(guān)評(píng)價(jià)指標(biāo)

于200倍光鏡下觀察切片并計(jì)數(shù)陽性切片數(shù)；分析ACAT1和ACAT2與結(jié)腸癌患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、Duke分期等的關(guān)系，并分析ACAT1與ACAT2的相關(guān)性，以探討ACAT1與ACAT2表達(dá)在結(jié)腸癌中的意義。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件；各分組樣本陽性率比較及樣本內(nèi)兩指標(biāo)間相關(guān)性分析均采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ACAT1和ACAT2在結(jié)腸癌組織、癌旁組織和正常黏膜組織中的表達(dá)情況

ACAT1和ACAT2陽性染色成棕黃的顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)（見附圖）于結(jié)腸癌組織、癌旁組織及正常腸道黏膜組織中均有表達(dá)，但表達(dá)的程度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

附圖 ACAT1和ACAT2在結(jié)腸癌組織、癌旁組織和正常黏膜組織中的表達(dá)

在上述60例結(jié)腸癌患者的標(biāo)本中，結(jié)腸癌組織、癌旁組織和正常腸道黏膜組織中ACAT1陽性表達(dá)率分別為56例（93.3%）、12例（20.0%）和11例（18.3%），ACAT2陽性表達(dá)率分別為57例（95.0%）、11例（18.3%）和10例（16.7%）。3組間ACAT1陽性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)直腸癌組織中ACAT1陽性率高于癌旁組織及正常組織，癌旁組織中ACAT1和ACAT2陽性率與正常組織比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 ACAT1和ACAT2的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征相關(guān)性分析

結(jié)腸癌中ACAT1和ACAT2在不同性別、不同的大小、不同的腫瘤部位中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），ACAT1和ACAT2的表達(dá)在不同年齡、不同的Duke’s分期、不同分化程度的結(jié)腸癌組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、3。

表2 結(jié)腸癌組織中ACAT1蛋白表達(dá)與臨床因素的相關(guān)性分析 例

表3 結(jié)腸癌組織中ACAT2蛋白表達(dá)與臨床因素的相關(guān)性分析 例

2.3 結(jié)直腸癌組織中ACAT1與ACAT2的相關(guān)性

結(jié)腸癌組織中ACAT1與ACAT2的表達(dá)相關(guān)（P=0.010）。

3 討論

結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)高發(fā)的惡性腫瘤之一，特別在發(fā)達(dá)國家[11]，隨著生活水平的日益提高，膳食結(jié)構(gòu)不合理，高蛋白質(zhì)、高熱量食物攝入量增加，我國己經(jīng)是結(jié)腸癌高發(fā)的國家之一，每年新發(fā)病例約34萬，有接近1/4的病例死亡。男女發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[12]，男性每1萬人中約有4人患癌，女性每1萬人中約有3人患癌，其中40歲以上的男性為結(jié)腸癌高發(fā)人群，而且近年結(jié)腸癌還呈現(xiàn)低齡化趨勢(shì)，這是我國結(jié)腸癌發(fā)病的一個(gè)主要特點(diǎn)。約有一半的結(jié)腸癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)巳為中晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，采取常規(guī)的治療手段如手術(shù)、化療、放療往往效果不佳，因此，結(jié)腸癌已經(jīng)嚴(yán)重威脅我國人民的身心健康。

結(jié)腸癌的發(fā)生與家族遺傳、不良的飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣均具有密切關(guān)系。一般認(rèn)為，高脂飲食與結(jié)腸癌的發(fā)病密切相關(guān)[13]。流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗可增加結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及死亡風(fēng)險(xiǎn)[6-7]，另有研究發(fā)現(xiàn)，胰島素水平增高可引起胰島素樣生長因子活性增強(qiáng)，而胰島素樣生長因子與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期相關(guān)，會(huì)增加結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲[8]。在研究胰島素抵抗與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，高胰島素上調(diào)巨噬細(xì)胞ACAT mRNA和蛋白表達(dá)，導(dǎo)致大量膽固醇酯在細(xì)胞中堆積，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成，加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，其中ERK/p38MAPK/JNK多條信號(hào)途徑參與其中[14-15]。ACAT是一種駐留內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的酶，通過將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇酯防止膽固醇堆積。ACAT不僅與動(dòng)脈粥樣硬化和阿爾海默氏病密切相關(guān)，更為關(guān)鍵的是，人們發(fā)現(xiàn)ACAT/膽固醇酯是一種新的途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展[9-10]。故猜想發(fā)現(xiàn)ACAT/膽固醇酯表達(dá)上調(diào)，可能是高脂飲食導(dǎo)致惡性腫瘤如結(jié)腸癌的一個(gè)新機(jī)制。

為了探究ACAT1及ACAT2在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義，本研究選取了60例結(jié)腸癌患者，用免疫組織化學(xué)的方法研究了ACAT1及ACAT2在結(jié)腸癌患者中的表達(dá)。本文結(jié)果提示ACAT1及ACAT2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，且二者的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？傊?，本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法首次發(fā)現(xiàn)ACAT1及ACAT2在結(jié)腸癌中高表達(dá)，且與患者的部分臨床病理特征相關(guān)，對(duì)臨床上早期診斷結(jié)腸癌有一定的參考價(jià)值。

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（張西倩 編輯）

Expression and clinical significance of ACAT in colon cancer*

Hui-ling Liang,Long Wu,Yi-qiao Zhang,Neng Chen,Ling Feng, Zhen-min Jiang,Xin Chen,Xi-ming Xu
(Cancer Center,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan,Hubei 430060,China)

R735.3

A

2016-11-25

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金（No：2042014kf0149）

陳心，E-mail：whdxchenxin@163.com；Tel：18171235882

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.22.005

1005-8982（2017）22-0025-05