基于16S rDNA高通量測序方法比較新疆西北部地區乳品中微生物的多樣性

張 敏，張 艷，黃麗麗，劉憶冬，周 紅，倪永清*

基于16S rDNA高通量測序方法比較新疆西北部地區乳品中微生物的多樣性

張 敏，張 艷，黃麗麗，劉憶冬，周 紅，倪永清*

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

為更加全面地了 解新疆特色乳品中微生物多樣性，比較不同動物來源的原奶和酸奶的細菌群落結構，運用高通量測序技術，對乳品中細菌16S rDNA V4-V5區測序，進而對新疆克州和塔城地區牛奶、駝奶、馬奶、羊奶、酸牛奶、酸駝奶和酸馬奶7 種乳品中細菌群落組成和多樣性進行分析。研究共獲得539 557 條有效序列，379 個OTU。多樣性分析表明，原奶樣品中細菌Shannon-Wiener指數明顯高于酸奶樣品。微生物群落組成分析發現，不同乳品之間菌群組成差異較大。7 種乳品中的菌群均以厚壁菌門和變形菌門為主，但原奶樣品主要以變形菌門為主，而酸奶樣品主要以厚壁菌門為主。在屬水平上，牛奶主要以假單胞菌屬（Pseudomonas）為主，駝奶主要以埃希菌屬-志賀菌屬（Escherichia-Shigella），馬奶主要以明串珠菌屬（Leuconostoc）為主，羊奶中的優勢菌屬為乳球菌屬（Lactococcus），而酸牛奶、酸駝奶和酸馬奶都是以乳桿菌屬（Lactobacillus）為優勢菌屬。不同動物來源的原奶和酸奶樣品中的微生物多樣性存在顯著差異，并且原奶中檢測到的環境污染菌和致病菌（或條件致病菌）的豐度也相對較高。本研究結果將為準確評估乳品中的微生物群落對新疆地區少數民族健康的影響提供一定的數據基礎。

乳品；微生物多樣性；高通量測序技術

動物原奶及其衍生的各種加工乳制品含有豐富的營養物質，千百年來成為人類喜愛的營養食品，同時也為不同的外源微生物提供了理想的棲息生境，形成了復雜多樣的微生物組，對乳品的品質和經濟價值起著關鍵作用[1-2]。雖然乳制品的營養價值眾所周知，但是人們對其中的微生物成分并沒有很好地描述，因此進一步研究新疆乳制品中微生物的多樣性至關重要。

我國新疆地區地域廣袤、氣候差異顯著、生態環境復雜、少數民族眾多，這些民族畜牧養殖業歷史悠久（養殖牲畜包括牛、山羊、綿羊、駱駝、馬、牦牛等），豐富的養殖業造成了多樣的天然乳品（各種原奶）及其加工乳品 （酸馬奶、酸牛奶、酸駝奶等），孕育了極其豐富的乳酸菌資源及遺傳多樣性。環境的差異和宿主動物的來源不同直接影響著原奶的微生物群落結構組成；而原奶加工乳制品中微生物組不僅受到環境條件、來源動物的影響，也受到乳品加工過程的影響[3-4]。這些不同類型的乳品將以直接或者間接的方式進入食品消費鏈，生存繁衍于其中的各種微生物也將被消費者攝入，進入人體消化系統，部分菌群將直接構成消費者的腸道微生物組。目前，已經知道人類的飲食對其腸道菌群有著直接的影響，而腸道微生物組對人的健康發揮著至關重要的作用[5]。有益功能是益生菌促進食物的消化吸收、增強機體免疫力[6]，有害作用將是病原微生物的致病性以及造成攜帶的抗生素抗性等毒力基因的擴散[2-3]。到目前為止，對新疆地區少數民族經年累月消費的乳制品中微生物群落組成及結構了解極少，因此開展乳品微生物組的研究將非常必要。

在早期的乳制品微生物研究中，采用傳統的培養和免培養技術對其微生物組成有了初步的認識[7-8]。傳統的免培養技術比如變性梯度凝膠電泳[9-10]、溫度梯度凝膠電泳、熒光原位雜交[11]、限制性片段長度多態性[12-13]等方法在對乳制品比如斯提爾頓奶酪[11]、丹麥奶酪[14]和開菲爾谷粒[15]中微生物的組成分析的研究方面越來越成熟。雖然用這種技術，鑒定到的微生物的種類有所增加，但是僅僅利用這種技術去完善乳制品中微生物種類的文庫還是遠遠不夠的。因此，新的技術-高通量測序技術以其高讀長、精度高、通量高、無偏性的自身優勢被廣泛應用去研究微生物的群落多樣性。早期的研究基于可培養的方法對微生物進行分離鑒定，相比之下，高通量測序技術不僅能檢測到普通的可培養物種，而且還可以檢測到那些難培養和低豐度的物種以及那些很難從樣品中獲取曾經存活或是難以分離的部分微生物，它已被成功用于檢測相對較少部分的發酵食品比如奶酪[1,14]、開菲爾谷粒[15-16]和發酵海鮮食品[17]等。

本研究的目的是利用高通量測序方法對新疆西北地區不同動物來源的原奶和發酵酸奶中細菌群落組成和結構進行比較分析，進而更加全面地展現新疆地區乳制品的微生物多樣性，從而準備評估乳品對新疆地區少數民族健康的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PCR產物純化試劑盒 德國Qiagen公司；用于PCR擴增的全套試劑及擴增引物 TaKaRa公司；相關生理生化實驗所用試劑均為進口或國產分析純。

1.2 儀器與設備

Fresco21型高速冷凍離心機 美國Thermo公司；Tprofessiona PCR儀 德國Biometral公司；Gel DOC XR凝膠成像系統、PowerPacUniversal水平電泳儀、SUBCELL GT電泳槽（20 cm×25 cm） 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

采集來自新疆兩個地區（包括塔城、克州）不同動物來源的天然乳制品（馬、駱駝、山羊、奶牛等飼養動物原奶）和加工乳品（自然發酵酸奶）。采樣時間在2014年7月，所有的樣品經無菌容器密封好后放入車載冰箱運回實驗室，樣品保存在-80 ℃超低溫冰箱。樣品及其采集地見表1。

表1 樣品及其采集地Table 1 Samples and their geographical origin

1.3.2 總DNA提取

吸取5 mL的奶樣品放進20 mL 2%的檸檬酸鈉溶液中45 ℃培養30 min；懸浮液在Vortex mixer中攪打大約5 min，上清液轉移到干凈的試管中；8 000 r/min離心10 min后，脂肪層用棉花棒吸走，細胞顆粒用1 mL TE緩沖液懸浮，并且8 000 r/min離心10 min；上清液被移走，剩下的大約100 μL和顆粒混合并轉移到2 mL帶蓋的離心管中，加入0.3 g鋯珠和150 μL的飽和TE酚后在水平擊打器上擊打5 min；加入CI溶液（氯仿-異戊醇（24∶1，V/V））后，離心管簡單地旋渦振蕩；繼續加入飽和TE酚和CI溶液，直到得到一個較澄清的上層；用2 倍體積的乙醇（100%）加入清液中，再用70%乙醇溶液洗脫，懸浮在500 μL TE中；DNA在3 mol/L乙酸鈉（pH 5.2）和96%乙醇溶液中沉淀；最后溶解與100 μL TE緩沖液。

1.3.3 16S rDNA V4-V5區的PCR擴增及測序

用提取的總DNA作為模板，以515F（5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’）和907R（5’-CCGTCAAT TCMTTTRAGTTT-3’）為引物（引物為原來文獻中報道的[18]），對細菌的16S rDNA V4-V5可變區進行特異性擴增。擴增體系（20 μL）為：5×Taq FastFu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，引物各0.4 μL（20 μmol/mL），模板0.5 μL（約50 ng），用dd H2O補齊至20 μL。反應程序為：95 ℃預變性2 min后，進行30 次循環（95 ℃變性30 s，55 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min），最后72 ℃延伸5 min。每個樣品PCR擴增3 份，擴增樣品混合后采用QIAquick PCR purifi cation kit純化，在超微量紫外分光光度計上精確定量后，等量混合在Miseq測序平臺進行測序，PCR擴增及測序工作由上海美吉公司完成。

1.4 數據分析

采用QIIME 1.8.0軟件處理原始數據，首先對V4-V5區片段進行拼接，其次去除引物，接著對其進行質量控制。質控時，去除模糊不清的序列；去除在正逆向引物中有錯誤的序列；去除堿基錯配的序列。最后用usearch 7.0軟件去除嵌合體序列得到干凈的序列。將得到的干凈序列聚類成操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），通過歸類操作，對所有序列在97%的相似水平下進行OTU劃分，根據OTU分類計算了樣品的Chao1指數、ACE指數、Shannon-Wiener指 數和樣品文庫的覆蓋率。基于UniFrac分析，根據主成分分析檢測種族間距的差異。通過稀釋曲線評價序列的豐度。

2 結果與分析

2.1 樣品序列數的特點

通過細菌的16S rDNA基因V4-V5區測序，14 個樣品共產生655 778 個序列標簽，平均長度為469 bp。質控后，獲得539 557 個序列標簽，平均長度為396 bp。質控過程中每個樣品剔除了17.7%的序列標簽。所有序列按97%的相似度進行OTU分類，總共聚成379 個OTU。

2.2 樣品細菌群體間的多樣性分析

表2 乳品樣品的信息、序列豐度以及微生物多樣性Table 2 Sequence abundance and microbial diversity in the dairy products

每個樣品的Chao1指數和Shannon-Wiener指數用于評估物種豐度和多樣性。由表2可知，原奶樣品中細菌Shannon-Wiener指數明顯高于其他樣品，牛奶例外，表明原奶中微生物群落種群差異性較大；而原奶的OTU數普遍高于酸奶的OTU數，而原奶中馬奶的OTU數最多，接下來是駝奶和牛奶，羊奶中的OTU數最少；Chao1指數的結果與OTU的結果相似，這是因為Chao1算法常用來估計群落中含有OTU的數目的指數，也就是用來估計物種數，即Chao1指數就是OTU數的一個反應指標，進一步證明了原奶中微生物群落的種群多樣性和總體豐度較高。乳品樣品的覆蓋率都大于99%，說明樣品文庫的覆蓋率很大，樣品中序列沒有被測出的概率極低，即反映了本測序結果可以代表樣本的真實情況。

2.3 樣品細菌群落門水平分布

圖1 門水平各樣本菌群分布圖Fig. 1 Distribution of microbial communities in the dairy samples at phylum level

本研究中，乳品的12 個細菌門被鑒定出，它們分別是酸桿菌亞門（Acidobacteria）、Candidate-division-TM7、奇異球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠菌門（Chlorobi）、厚壁菌門（Firmicutes）、軟壁菌門（Tenericutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、藍菌門（Cyanobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、未分類菌群（Others）。對樣品信息中主要組成的12 個門進行門水平菌群比例分布繪圖，結果如圖1所示。原奶和發酵酸奶之間微生物組成存在明顯的差異，但也存在著一定的規律性，其中厚壁菌門和變形菌門是最占優勢的菌群門，分別占細菌總序列的82.69%和17.20%。進一步分析表明，原奶中主要的菌群是變形菌門，而不同動物來源的原奶中變形菌門占各自樣品細菌序列的比例也不盡相同，其中在牛奶和駝奶中變形菌門所占比例較大，分別為97.00%和87.96%，而變形菌門在羊奶和馬奶中的比例較小，分別為26.53%和5.03%；發酵酸奶中主要是以厚壁菌門為主，其中在酸牛奶和酸馬奶中厚壁菌門占各自樣品序列的比例高達98%，在酸駝奶N5和N6中也可高達98%，而厚壁菌門在酸駝奶N8和N9中所占比例不如N5和N6中的高，它們分別占89.96%和94.89%。

2.4 樣品細菌群落屬水平分布

圖2 屬水平各樣本菌群分布圖Fig. 2 Distibution of microbial communities in the dairy samples at genus level

本實驗將乳品中前10 種豐度最高的屬信息整理成表3，發現4 種原奶中的微生物菌群的主要種屬相差甚大。牛奶（N1）主要以假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）和乳球菌屬（Lactococcus）等細菌種屬為主；羊奶（N2）主要以乳球菌屬、不動桿菌屬（Acinetobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等細菌種屬為主；駝奶（N7）主要以埃希菌屬-志賀菌屬（Escherichia-Shigella）、腸桿菌屬和乳球菌屬為主；馬奶（N11）主要以明串珠菌屬（Leuconostoc）、不動桿菌屬和乳球菌屬等細菌種屬為主；酸牛奶主要以乳桿菌屬（Lactobacillus）和鏈球菌屬（Streptococcus）等細菌種屬為主；酸駝奶主要以乳桿菌屬和乳球菌屬等細菌種屬為主；酸馬奶主要以乳桿菌屬、乳球菌屬和醋桿菌屬（Acetobacter）為主。

表3 乳品中主要微生物菌落種屬組成Fig. 3 Major bacterial genera in the dairy pro ducts

如圖2所示，各種酸奶主要以乳桿菌屬（Lactobacillus）為主，其所占比例在不同樣品個體中大小不一，酸牛奶N3中的乳桿菌屬占該樣品總序列的86.90%，酸牛奶N10中的乳桿菌屬占45.63%，酸牛奶中乳桿菌的數量差異如此之大，這可能和采樣地點有關系，N10中乳桿菌的比例相對較小，說明N10中的其他菌的種類較多，多樣性較豐富，這也和Shannon-Wiener指數結果相一致；酸馬奶N4、N12、N13、N14中乳桿菌分別占各自序列的比例為99.69%、98.32%、92.98%和96.53%；酸駝奶N5、N6、N8、N9中乳桿菌分別占各自序列的比例為67.08%、97.03%、72.13%和88.46%。

2.5 樣品細菌群落相似性分析

圖3 細菌群落聚類分析圖Fig. 3 Clustering analysis of bacterial communities

圖4 細菌群落的非度量多維尺度分析Fig. 4 Non-metric multidimensional scaling of bacterial communities

本實驗將全部相似度為97%的OTUs用Primer 6.0做聚類分析14 個樣品之間的微生物群落相似性。如圖3可知，所有樣品共聚成兩類。第1大類包括不同動物來源的原奶樣品，馬奶除外，這可能與不同的采樣地點有關；第2大類包括不同動物來源的酸奶樣品。第2大類又進一步聚成兩個亞組，原馬奶一組，各種酸奶一組。酸奶亞組下又分成3 個小分支，酸馬奶一組，酸牛奶一組，酸駝奶一組。這就說明不同類型的乳品微生物群落結構相差甚遠，而且微生物群落結構存在生物地理分布差異。

細菌群落間存在的可能的關系也可以通過非度量多維尺度（nonmetric multidimensional scaling，N-MDS）來分析的。N-MDS是根據樣品中包含的物種信息，以點的形式反映在多維空間上，而對不同樣品間的差異程度，則是通過點與點間的距離體現的，最終獲得樣品的空間定位圖。由圖4可知，N-MDS展現的結果類似，不同動物來源的原奶之間的距離較遠，說明各種原奶中的微生物差異較大；而不同動物來源的酸奶之間的距離較近，說明各種酸奶中的微生物相似性較高。兩份酸牛奶之間的距離并不是很近，這也有可能與采樣地點有關。

3 討 論

高通量測序技術能夠為環境樣品中的微生物群體結構提供一個全面的描述分析，本實驗通過此方法分析并比較新疆地區不同宿主動物來源的原奶和酸奶中的細菌群體結構及多樣性。在兩類乳品中，原奶樣品展示了較高的物種豐度，然而隨著樣品加工過程的繼續，酸奶中的多樣性減少。眾所周知，在發酵過程中食品生態系環境的轉變會造成原奶中微生物群落的選擇，這也說明了環境因素比如說溫度和相對濕度會影響乳品加工和成熟過程中微生物的群落多樣性[19-21]。

原奶中的微生物成分曾經在描述孔泰奶酪的特點中被研究過，但是并沒有對不同動物來源的原奶以及原奶和發酵酸奶中的成分進行比較[22-23]。本研究的目的是了解新疆地區不同宿主動物來源的天然原奶中的有益微生物和一些致病菌，以及對原奶和加工乳品中的成分進行比較，以準確評估特色乳品對新疆地區少數民族健康的影響。在門水平上，厚壁菌門和變形菌門是優勢菌門，然而在原奶和酸奶中這兩個細菌門的豐度不同，原奶中最占優勢的細菌門是變形菌門，酸奶中最占優勢的細菌門是厚壁菌門，這和自然發酵乳品（開菲爾谷粒[24]、發酵海鮮食品[13]、珍珠粟漿[25]、自然發酵牦牛奶[26]和手工奶酪[1]等）的研究結果相一致。

在屬水平上，4 種不同動物來源的原奶中的微生物成分差異較大，而發酵酸奶中的成分近乎一致。研究結果表明乳球菌和乳桿菌是原奶和酸奶樣品中主要的微生物，在乳制品的生產發酵過程中發揮了重要作用[27-29]，而乳球菌是原奶中最豐富的屬，乳桿菌是酸奶中最占優勢的屬。據報道，乳桿菌的酸耐受力高于鏈球菌和乳球菌[30]。乳球菌的一些種的酸耐受力較低，所以它們大部分是分離自原奶和原奶的發酵早期[30-31]。由于乳桿菌比乳球菌有較強的酸耐受力，因此酸奶中乳桿菌的豐度較高而原奶中乳球菌的豐度較高，這也正和本研究結果一致。

此外，在本實驗樣品中主要的屬（大于總序列的0.1%）有Pseudomonas、Enterobacter、Leuconostoc、Streptococcus、Escherichia-Shigella、Acinetobacter、Acetobacter、Yersinia、Burkholderia、Enhydrobacter、Enterococcus。在這些屬中，Streptococcus、Leuconostoc和Enterococcus在Delbes等[32]對原奶的研究中曾被報道過。Acinetobacter和Enterobacter在墨西哥的一款酒精性飲料中檢測到過，據推測這些屬可能和原奶中的細菌污染有關，并且在原奶的發酵過程中不斷減少[33]。Enhydrobacter、Acinetobacter、Chryseobacterium和Bacillus等環境細菌在以前的利用基于培養的方法和免培養的方法來檢測原奶中的微生物組研究中也報道過[1,27,32,34-35]。原奶中的微生物一般是來自不同動物的乳房，不同的農場，擠奶環境和與奶直接接觸的擠奶工人和容器[36]。實驗發現不同動物來源的原奶中的微生物成分差異較大，主要是其中的致病菌和環境污染菌不同，牛奶主要以Pseudomonas和Enterobacter為主；羊奶主要以Acinetobacter和Pseudomonas為主；駝奶主要以Escherichia-Shigella和Enterobacter為主；馬奶主要以Leuconostoc和Acinetobacter為主。乳品中Enterobacteria的出現可能會造成健康風險并且反映出在對乳制品處理過程中的衛生標準較低，Escherichia-Shigella和Pseudomonas會導致腹瀉[37-41]。

4 結 論

不同動物來源的原奶和酸奶樣品中的微生物多樣性存在顯著差異。與酸奶相比，不同動物來源的原奶中微生物群落的種群多樣性和總體豐度較高，并且原奶中檢測到的致病菌和環境污染菌的豐度也相對較高。這無疑增加了消費者對原奶安全性的擔憂，也將為研究者準確評估乳品中的微生物群落對新疆地區少數民族健康的影響提供一定的數據基礎。

[1] QUIGLEY L, O’SULLIVAN O, BERESFORD T P, et al. Highthroughput sequencing for detection of subpopulations of bacteria not previously associated with Artisanal cheeses[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(16)∶ 5717-5723. DOI∶10.1128/AEM.00918-12.

[2] QUIGLEY L, O’SULLIVA N O, STANTON C, et al. The complex microbiota of raw milk[J]. Fems Microbiology Reviews, 2013, 37(5)∶664-698. DOI∶10.1111/1574-6976.12030.

[3] DEVIRGILIIS C, ZINNO P, PEROZZI G. Update on antibiotic resistance in foodborne Lactobacillus and Lactococcus species[J]. Frontiers in Microbiology, 2013, 4∶ 301. DOI∶10.3389/fmicb.2013.00301.

[4] CAVANAGH D, FITZGERALD G F, MCAULIFFE O. From fi eld to fermentation∶ the origins of Lactococcus lactis and its domestication to the dairy environment[J]. Food Microbiology, 2015, 47∶ 45-61.DOI∶10.1016/j.fm.2014.11.001.

[5] SOMMER F, B?CKHED F. The gut microbiota-masters of host development and physiology[J]. Nature Reviews Microbiology, 2013,11(4)∶ 227-238. DOI∶10.1038/nrmicro2974.

[6] KAU A L, AHERN P P, GRIFFIN N W, et al. Human nutrition, the gut microbiome and the immune system[J]. Nature, 2011, 474∶ 327-336. DOI∶10.1038/nature10213.

[7] GIRAFFA G, NEVIANI E. DNA-based, culture-independent strategies for evaluating microbial communities in food-associated ecosystems[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001,67(1/2)∶ 19-34. DOI∶10.1016/S0168-1605(01)00445-7.

[8] JANY J L, BARBIER G. Culture-independent methods for identifying microbial communities in cheese[J]. Food Microbiology, 2008, 25(7)∶839-848. DOI∶10.1016/j.fm.2008.06.003.

[9] MUYZER G, DE WAAL E C, UITTERLINDEN A G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplifi ed genes coding for 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology,1993, 59(3)∶ 695-700.

[10] RANDAZZO C L, TORRIANI S, AKKERMANS A L D, et al.Diversity, dynamics, and activity of bacterial communities during production of an artisanal Sicilian cheese as evaluated by 16S rRNA analysis[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(4)∶1882-1892. DOI∶10.1128/AEM.68.4.1882-1892.2002.

[11] ERCOLINI D, HILL P J, DODD C E R. Bacterial community structure and location in Stilton cheese[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2003,69(6)∶ 3540-3548. DOI∶10.1128/AEM.69.6.3540-3548.2003.

[12] LIU W T, MARSH T L, CHENG H, et al. Characterization of microbial diversity by determining terminal restriction fragment length polymorphisms of genes encoding 16S rRNA[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1997, 63(11)∶ 4516-4522.

[13] ARTEAU M, LABRIE S, ROY D. Terminal-restriction fragment length polymorphism and automated ribosomal intergenic spacer analysis profiling of fungal communities in Camembert cheese[J].International Dairy Journal, 2010, 20(8)∶ 545-554. DOI∶10.1016/j.idairyj.2010.02.006.

[14] MASOUD W, TAKAMIYA M, VOGENSEN F K, et al.Characterization of bacterial populations in Danish raw milk cheeses made with different starter cultures by denaturating gradient gel electrophoresis and pyrosequencing[J]. International Dairy Journal,2011, 21(3)∶ 142-148. DOI∶10.1016/j.idairyj.2010.10.007.

[15] LEITE A, MAYO B, RACHID C, et al. Assessment of the microbial diversity of Brazilian kefi r grains by PCR-DGGE and pyrosequencing analysis[J]. Food Microbiology, 2012, 31(2)∶ 215-221. DOI∶10.1016/j.fm.2012.03.011.

[16] DOBSON A, O’SULLIVAN O, COTTER P D, et al. High-throughput sequence-based analysis of the bacterial composition of kefi r and an associated kefi r grain[J]. FEMS Microbiology Letters, 2011, 320(1)∶56-62. DOI∶10.1111/j.1574-6968.2011.02290.x.

[17] ROH S W, KIM K H, NAM Y D, et al. Investigation of archaeal and bacterial diversity in fermented seafood using barcoded pyrosequencing[J].ISME Journal, 2010, 4(1)∶ 1-16. DOI∶10.1038/ismej.2009.83.

[18] SAMUEL O A, RONALD M, MICHAEL I, et al. Postinoculation protozoan establishment and association patterns of methanogenic archaea in the ovine rumen[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007,73(14)∶ 4609-4618. DOI∶10.1128/AEM.02687-06.

[19] BONETTA S, BONETTA S, CARRARO E, et al. Microbial characterization of Rabiola di Roccaverano cheese using PCRDGGE[J]. Food Microbiology, 2008, 25(6)∶ 786-792. DOI∶10.1016/j.fm.2008.04.013.Epub2008May7.

[20] CARIDI A, MICARI P, FOTI F, et al. Ripening and seasonal changes in microbiological and chemical parameters of the artisanal cheese Caprino d’Aspiomonte produced from raw and thermized milk[J].Food Microbiology, 2002, 20(2)∶ 201-209.

[21] PSONI L, TZANETAKIS N, LITOPOULOU-TZANETAKI E.Microbial characteristics of Batzos, a traditional Greek cheese from raw goats’ milk[J]. Food Microbiology, 2003, 20(5)∶ 575-582.

[22] BERTHIER F, BEUVIER E, DASEN A, et al. Origin and diversity of mesophilic lactobacilli in Comté cheese, as revealed by PCR with repetitive and species-specifi c primers[J]. International Dairy Journal,2001, 11(4/5/6/7)∶ 293-305.

[23] DEPOUILLY A, DUFRENE F, BEUVIER E, et al. Genotypic characterisation of the dynamics of the lactic acid bacterial population of Comté cheese[J]. Lait, 2004, 84∶ 155-167.

[24] CHEN H C, WANG S Y, CHEN M J. Microbiological study of lactic acid bacteria in kefi r grains by culture-dependent and cultureindependent methods[J]. Food Microbiology, 2008, 25(3)∶ 492-501.DOI∶10.1016/j.fm.2008.01.003.

[25] HUMBLOT C, GUYOT J P. Pyrosequencing of tagged 16S rRNA gene amplicons for rapid deciphering of the microbiomes of fermented foods such as pearl millet slurries[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(13)∶ 4354-4361. DOI∶10.1128/AEM.00451-09.

[26] LIU W J, ZHENG Y, KWOK L Y, et al. High-throughput sequencing for the detection of the bacterial and fungal diversity in Mongolian naturally fermented cow’s milk in Russia[J]. BMC Microbiology,2015, 15(1)∶ 45. DOI∶10.1186/s12866-015-0385-9.

[27] ALEGRíA á, SZCZESNY P, MAYO B, et al. Biodiversity in Oscypek, a traditional Polish cheese, determined by culturedependent and-independent approaches[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012, 78(6)∶ 1890-1898. DOI∶10.1128/AEM.06081-11.

[28] WATANABE K, FUJIMOTO J, SASAMOTO M, et al. Diversity of lactic acid bacteria and yeasts in Airag and Tarag, traditional fermented milk products of Mongolia[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 24(8)∶ 1313-1325. DOI∶10.1007/s11274-007-9604-3.

[29] BAO Q H, YU J, LIU W J, et al. Predominant lactic acid bacteria in traditional fermented yak milk products in the Sichuan Province of China[J]. Dairy Science and Technology, 2012, 92(3)∶ 309-319.DOI∶10.1007/s13594-012-0061-x.

[30] ROGOSA M, MITCHELL J A, WISEMAN R F. A selective medium for the isolation and enumeration of oral and fecal lactobacilli[J].Journal of Bacteriology, 1951, 62(1)∶ 132-133.

[31] AN Y, ADACHI Y, OGAWA Y. Classifi cation of lactic acid bacteria isolated from chigee and mare milk collected in Inner Mongolia[J].Animal Science Journal, 2004, 75(3)∶ 245-252. DOI∶10.1111/j.1740-0929.2004.00183.x.

[32] DELBES C, ALI-MANDJEE L, MONTEL M C. Monitoring bacterial communities in raw milk and cheese by culture-dependant and independent 16S rRNA gen-based analyses[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(6)∶ 1882-1891. DOI∶10.1128/AEM.01716-06.

[33] ESCALANTE A, GILES-GóMEZ M, HERNáNDEZ G, et al.Analysis of bacterial community during the fermentation of pulque,a traditional Mexican alcoholic beverage, using a polyphasic approach[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008,124(2)∶ 126-134. DOI∶10.1016/j.ijfoodmicro.2008.03.003.

[34] CALLON C, DUTHOIT F, DELBES C, et al. Stability of microbial communities in goat milk during a lactation∶ molecular approaches[J].Systematic and Applied Microbiology, 2007, 30(7)∶ 547-560.DOI∶10.1016/j.syapm.2007.05.004.

[35] FEURER C, IRLINGER F, SPINNLER H, et al. Assessment of the rind microbial diversity in a farmhouse-produced vs a pasteurized industrially produced soft red-smear cheese using both cultivation and rDNA-based methods[J]. Journal of Applied Microbiology, 2004,97(3)∶ 546-556. DOI∶10.1111/j.1365-2672.2004.02333.x.

[36] OLIVER S, JAYARAO B, ALMEIDA R. Foodborne pathogens in milk and the dairy farm environment∶ food safety and public health implications[J]. Foodborne Pathogens and Disease, 2005, 2(2)∶115-129. DOI∶10.1089/fpd.2005.2.115.

[37] ARAUJO V S, PAGLIARES V A, QUEIROZ M L, et al.Occurrence of Staphylococcus and enteropathogens in soft cheese commercialized in the city of Rio de Janeiro, Brazil[J]. Journal of Applied Microbiology, 2002, 92(6)∶ 1172-1177. DOI∶10.1046/j.1365-2672.2002.01656.x.

[38] COIA J E, JOHNSTON Y, STEERS N J, et al. A survey of the prevalence of Escherichia coli O157 in raw meats, raw cow’s milk and raw-milk cheeses in south-east Scotland[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 66(1/2)∶ 63-69. DOI∶10.1016/S0168-1605(00)00490-6.

[39] DE BUYSER M L, DUFOUR B, LAFARGE M M, et al. Implication o f milk and milk products in food-borne diseases in France and in different industrialised countries[J]. International Journal of Food Microbiology, 2001, 67(1/2)∶ 1-17. DOI∶10.1016/S0168-1605(01)00443-3.

[40] ALBERT M J, ALAM K, ISLAM M, et al. Hafnia alvei, a probable cause of diarrhea in humans[J]. Infection and Immunity, 1991, 59(4)∶1507-1513.

[41] ALBERT M J, FARUQUE S M, ANSARUZZAMAN M, et al.Sharing of virulence-associated properties at the phenotypic and genetic levels between enteropathogenic Escherichia coli and Hafnia alvei[J]. Journal of Medical Microbiology, 1992, 37(5)∶ 310-314.DOI∶10.1099/00222615-37-5-310.

Application of 16S rDNA High-Throughput Sequencing for Comparative Study of the Microbial Diversity of Dairy Products from Western and Northern Xinjiang, China

ZHANG Min, ZHANG Yan, HUANG Lili, LIU Yidong, ZHOU Hong, NI Yongqing*
(College of Food, Shihezi University, Shihezi 832000, China)

This study aimed to fully demonstrate the microbial diversity in dairy products from Xinjiang, China and to compare the microbial community composition of raw and fermented milk from different animal species. The composition and structure of bacterial communities in bovine milk, camel milk, mare’s milk, caprine milk, fermented cow milk,fe rmented camel milk and koumiss from Kizilsu Kirghiz and Tacheng regions of Xinjiang were analyzed based on highthroughput sequencing of the V4-V5 region of the 16S rDNA. A total of 539 557 effective sequences and 379 OTUs were obtained. The results showed that the Shannon-Wiener diversity index for raw milk was higher than that for fermented milk.The microbiota of raw and ferm ented milk were signifi cantly different. Two bacterial phyla, Firmicutes and Proteobacteria,dominated the microbiota of all seven dairy products, and Proteobacteria dominated the microbiota of raw milk, while Firmicutes was the predominant phylum in fermented milk. At the genus level, Pseudomonas was dominant in cow milk,Escherichia-Shigella was the major bacterial population in camel milk, Leuconostoc was the most abundant bacteria in mare’s milk, Lactococcus was the dominant bacteria in goat milk samples, and Lactobacillus domin ated the microbiota of yogurt, camel yogurt and koumiss. The microbiota in raw and fermented milk from different animals were significantly different, and the abundances of environmental bacterial and pathogenic bacteria (or conditional pathogenic bacteria) in raw milk were highest. The results of this study would provide preliminary data of the microbial diversity in dairy products to assess their effect on the health of Xinjiang minorities.

dairy product; microbial diversity; high-throughput sequencing

Q935

A

1002-6630（2017）20-0027-07

2016-08-23

新疆生產建設兵團科技攻關與成果轉化計劃項目（2015AC003）

張敏（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。E-mail：18703080975@163.com

*通信作者：倪永清（1969—），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。E-mail：niyqlzu@sina.com

張敏, 張艷, 黃麗麗, 等. 基于16S rDNA高通量測序方法比較新疆西北部地區乳品中微生物的多樣性[J]. 食品科學,2017, 38(20)∶ 27-33. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720005. http∶//www.spkx.net.cn

ZHANG Min, ZHANG Yan, HUANG Lili, et al. Application of 16S rDNA high-throughput sequencing for comparative study of the microbial diversity of dairy products from western and northern Xinjiang, China[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶27-33. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720005. http∶//www.spkx.net.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720005