β2腎上腺素受體基因在Sf9細胞中的表達及純化

王 健，劉 媛，張俊花，韓正政，蘭鳳英

β2腎上腺素受體基因在Sf9細胞中的表達及純化

王 健1,2，劉 媛1，張俊花1，韓正政1，蘭鳳英1

（1.河北北方學院農林科技學院，河北 張家口 075000；2.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，農業部農產品質量安全重點實驗室，北京 100081）

通過密碼子優化、昆蟲桿狀病毒表達系統（Bac-to-Bac）構建、表達條件篩選及鎳柱親和層析，研究β2腎上腺素受體（β2adrenergic receptor，β2AR）基因（β2AR）在昆蟲細胞Sf9中的高效表達及純化策略。方法：人工合成改造后的β2AR基因，將其克隆至轉移載體pFastBac1中，構建重組桿狀病毒表達質粒pFastBac1-β2AR’，轉染昆蟲細胞Sf9，優化表達條件，采用鎳離子親和層析法純化重組蛋白并進行活性鑒定。結果：適宜的表達條件為感染細胞使用的感染復數5、感染后表達時間48 h，Western blot分析顯示在47 kD左右處出現清晰的特異性條帶，與預期結果一致。純化的受體蛋白純度大于90%，活性鑒定結果顯示該受體蛋白可特異性吸附鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多 巴胺3 種β激動劑的酶標記物，OD值分別為0.983、0.947和0.91 2。結論：本研究實現了β2AR受體在Sf9細胞中的表達，且純化后的受體蛋白保持了較好的β激動劑親和活性，為利用β2AR受體開展β激動劑多殘留快速檢測技術提供了依據。

β2腎上腺素受體；桿狀病毒表達載體；Sf9細胞；表達；純化

目前，β激動劑（俗稱“瘦肉精”）的違禁添加仍然是影響我國畜產品安全及養殖業健康發展的熱點問題之一。特別是多種β激動劑的混合使用及新型結構類似物的層出不窮，充分暴露出了現行檢測技術對該類違禁物的多殘留高通量分析及未知物篩查存在嚴重不足。

現有針對β激動劑檢測的標準方法及研究報道主要分為確證檢測技術和快速檢測技術兩大類。確證分析方法常見的有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[1]、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[2-3]、液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[4-5]和四極桿-飛行時間質譜（quadrupole-time of flight，Q-TOF）[6-7]等，但其均存在著儀器設備昂貴、操作步驟復雜等固有缺點。近年來快速檢測方法順應市場需要和監管需求異軍突起，將傳統的抗原抗體識別體系與新興的材料或信號放大機制相結合形成了多種方法，如酶聯免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）[8-9]、膠體金免疫層析[10-11]、電化學[12-13]、量子點[14]和傳感器[15]等，但它們往往只能檢測有限的特定目標物，使用范圍仍有很大的局限性。

基于受體的快速檢測方法是利用受體與配體間的特異性吸附，從而完成具有相同生物學效應的一類目標物的類特異性測定，可實現對β激動劑類違禁物的多殘留檢測和非目標物分析。β2腎上腺素受體（β2adrenergic receptor，β2AR）是構建β激動劑受體檢測方法的關鍵識別元件，鑒于天然β2AR在生物體內的極低豐度和分離難度，近些年體外表達已成為獲得該受體的主流方法[16]。β2AR是具有7次跨膜α螺旋結構的膜蛋白[17]，影響其用于檢測方法研發的難點主要集中在重組β2AR受體的數量、活性及純度等方面。國內外已有研究報道表明，通過大腸桿菌[18]、酵母[19]、昆蟲細胞[20]、哺乳動物細胞[21]以及無細胞表達系統[22]均可在體外制備具有β激動劑親和活性的蛋白，但表達水平和活性強弱因宿主細胞不同而呈現出較大差異[23]。其中桿狀病毒感染的昆蟲細胞草地貪葉蛾（Spodoptera frugierda）卵巢細胞Sf9是β2AR受體最為有效的體外表達體系之一，重組蛋白不僅產量高，而且具有與哺乳動物細胞相近的蛋白活性。但國內相關報道極少，僅見Cheng Guyue等[24]利用該表達體系對野生型β2AR基因進行了表達和純化。由于β2AR基因中存在著不適于昆蟲細胞表達的稀有密碼子，影響了表達效果，因此本研究擬先對野生型β2AR基因改造后再進行表達嘗試，以求實現β2AR的高效表達。

本研究首先對前期克隆得到的豬β2AR基因進行改造，然后將其與轉移載體pFastBac1連接，構建重組桿狀病毒表達質粒并轉染Sf9細胞，優化得到適宜的感染細胞感染復數（multiplicity of infection，MOI）和表達時間，采用Ni2+親和層析法純化重組蛋白并進行ELISA活性分析，以期為建立基于重組受體的β激動劑多殘留快速檢測方法提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬β2AR基因重組克隆質粒pMD-18T-β2AR由筆者前期構建及所在實驗室保存；Sf9細胞 中國協和醫科大學基礎醫學研究所細胞中心。

Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統（主要包括轉移載體pFastBacTM1、大腸桿菌（Escherichia coli）DH10 BacTM菌株、E. coli DH5α和轉染試劑Cellfectin） 美國Invitrogen公司；T4連接酶 寶生物工程（大連）有限公司；質粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 美國Axygen公司；限制性內切酶EcoRⅠ和XbaⅠ 美國NEB公司；昆蟲細胞無血清培養基SF 900ⅡSFM 美國Hyclone公司；辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標記的羊抗鼠二抗 美國Sigma公司；His鼠源單克隆抗體、Ni-NTA樹脂 美國Qiagen公司。

1.2 儀器與設備

9902型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Applied Biosystems公司；Imaging G3凝膠成像儀 北京昊諾斯科技有限公司；Power Pac 300型DNA電泳儀、Powerpac Universal蛋白電泳儀 美國Bio-Rad公司；Multiskan MK3酶標儀 美國Thermo公司；AKTA explorer蛋白純化系統 美國GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 β2AR基因序列的改造與合成

利用Protparam工具（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）對已克隆得到的豬β2AR基因（GenBank登錄號：KF023571.1）對應的氨基酸序列進行理化特性分析，依據昆蟲細胞密碼子的偏好性對其進行改造，使其適應昆蟲細胞表達系統。分別在改造后基因的5’端和3’端引入限制性內切酶EcoRⅠ位點和限制性內切酶XbaⅠ位點，改造后基因由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 重組桿狀病毒表達質粒的構建與鑒定

將上述合成的β2AR改造基因與轉移載體pFastBac1分別用EcoRⅠ和XbaⅠ進行雙酶切，然后瓊脂糖凝膠電泳切膠回收目的片段和載體片段，經T4 DNA連接酶16 ℃條件下連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取Amp陽性單菌落并提取質粒，用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，將初步鑒定為陽性的重組質粒送上海博亞生物技術有限公司測序，驗證讀碼框的正確性，序列正確的重組質粒命名為pFastBac1-β2AR′。

1.3.3 重組桿狀病毒表達質粒轉染Sf9細胞

Sf9細胞的培養：選擇無血清培養基SF 900ⅡSFM，27 ℃孵育，無需CO2，采用半貼壁培養方式，3～4 d傳代一次。在6 孔細胞培養板中，將9×105個處于對數生長期的Sf9細胞接種于每孔含有2 mL培養基的平板中，27 ℃培養箱中培養2 h。采用Cellfectin試劑以脂質體法將鑒定正確的pFastBac1-β2AR’質粒轉染Sf9細胞，具體步驟參考Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統說明書進行。在27 ℃潮濕條件下孵育72 h左右，在倒置顯微鏡下觀察，直到細胞發生典型病毒感染的病變，從培養基中收獲細胞制備P1代重組病毒株。測定P1病毒株的滴度，并擴增得到滴度更高的P2病毒株，測定滴度后同法擴增得到P3病毒株，用于重組蛋白表達。

1.3.4 表達條件的優化及鑒定

大量因素影響著重組蛋白的最優表達，本實驗主要對MOI和感染后表達時間兩個關鍵因素進行了優化。首先，用鑒定正確的重組桿狀病毒質粒進行小量表達嘗試，篩選能夠特異表達的病毒株。然后將其擴增得到的P3病毒株進行表達條件的優化研究，具體方法如下：在24孔細胞板中，以6×105個/孔接種Sf9細胞，接觸至少30 min；棄去培養基，用新鮮的培養基清洗一次，換上300 μL新鮮培養基；按照MOI值1、5、10將重組毒株分別感染Sf9細胞，在27 ℃培養箱中培養。對應每個MOI值分別在48 h和72 h感染后收獲細胞，用細胞裂解液（含終濃度為1 mmol/L的苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）裂解后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和Western blot檢測，陰性對照為正常Sf9昆蟲細胞裂解物。

1.3.5 重組受體蛋白的純化

采用固定有鎳離子的親和色譜柱對帶有His標簽的重組蛋白進行蛋白純化。以Ni-NTA樹脂為填料，對適宜表達條件下獲得的細胞裂解產物進行純化，主要步驟為：1）柱平衡：以1 mL/min的流速用10 CV的Lysis buffer平衡色譜柱。2）上樣純化：將細胞裂解液過柱，流速為1 mL/min。3）漂洗：連續用結合緩沖液PBS、含有30 mmol/L咪唑的PBS及含有50 mmol/L咪唑的PBS各5～10 CV漂洗柱子，流速為1 mL/min。4）洗脫：用含有250 mmol/L咪唑的PBS以1 mL/min的流速洗脫色譜柱。最后取適量純化蛋白進行Western blot和活性鑒定。

1.3.6 純化蛋白的Western blot及活性鑒定

以正常Sf9昆蟲細胞裂解物為陰性對照，采用His鼠源單克隆抗體對獲得的純化蛋白樣品進行Western blot鑒定。參考筆者前期優化的ELISA方法[25-26]，測定該純化受體蛋白對鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇3 種β激動劑HRP酶標記物的特異性結合程度，對其進行活性鑒定。

2 結果與分析

2.1 改造后β2AR基因序列的分析與鑒定

根據β2AR的氨基酸組成，考慮昆蟲細胞的偏好性，進行密碼子優化，并在編碼核苷酸序列的5’端添加了6×His標簽的核苷酸序列，改造后的β2AR基因及其氨基酸序列如圖1所示，與野生型β2AR不同的基因用下劃線標示，受體結合部位的氨基酸用圓圈標示。1%瓊脂糖凝膠電泳分析結果與理論設計一致，表明已獲得目的基因。

圖1 改造后的β2AARR基因序列及其編碼的氨基酸序列Fig. 1 Modifi ed gene and amino acid sequence of β2AR

2.2 重組桿狀病毒表達質粒的鑒定

用限制性內切酶EcoRⅠ和XbaⅠ對重組桿狀病毒表達質粒進行雙酶切鑒定，結果如圖2所示，在4.8 kb和1.3 kb左右分別出現了pFastBac1載體條帶和目的基因條帶，與預期大小相符，將雙酶切鑒定為陽性的重組質粒進行測序，測序結果與基因合成報告完全一致，將該重組質粒命名為pFastBac1-β2AR’。

圖2 重組桿狀病毒質粒的雙酶切鑒定Fig. 2 Identifi cation of recombinant plasmid by double restriction enzyme digestion

2.3 重組桿狀病毒的鑒定及轉染后的細胞病變

采用病毒空斑試驗測定病毒滴度，結果顯示P1病毒株滴度為2×106PFU/mL，P2病毒株滴度為1×107PFU/mL。用重組桿狀病毒質粒轉染Sf9細胞，27 ℃潮濕條件下孵育，觀察細胞形態變化：轉染后24 h，細胞直徑逐漸增大且變圓；轉染后24～72 h，細胞停止增長，細胞核顯著增大；轉染后72 h，細胞內顆粒狀物增多，部分貼壁細胞脫落甚至消亡（圖3）；以上細胞形態學變化證明重組桿狀病毒質粒成功轉染Sf9細胞。

圖3 正常Sf9細胞（a）及轉染后72 h Sf9細胞（b）顯微鏡圖（×400）Fig. 3 Normal Sf9 cells and Sf9 cells at 72 h post transfection (× 400)

2.4 表達條件的優化及產物鑒定

挑選兩個鑒定正確的重組桿粒在6 孔細胞板中轉染Sf9細胞，每個桿粒轉染2 個孔，表達測試結果如圖4、5所示。SDS-PAGE結果（圖4）顯示，由于檢測靈敏度等原因從圖中無法清晰地看到目的蛋白條帶。Western blot進一步分析（圖5）得知，與正常的Sf9細胞相比，兩重組桿粒均在47 kD左右處出現了單一的特異性反應條帶，與預期結果一致，且2#桿粒表達產物（3、4泳道）條帶更加清晰，因此選擇2#桿粒擴增得到的P3病毒株進行表達條件優化試驗。由圖6可知，第2泳道的蛋白條帶最為清晰濃重，因此篩選獲得的適宜表達條件為：MOI值5、感染后表達時間48 h。

圖4 Sf9細胞表達產物的SDS-PAGE結果Fig. 4 SDS-PAGE analysis of expression product from Sf9 cells

圖5 Sf9細胞表達產物的Western blot結果Fig. 5 Western blot analysis of expression product on Sf9 cells

圖6 表達條件優化的Western blot鑒定Fig. 6 Western blot analysis under the optimized expression conditions

2.5 純化蛋白的Western blot鑒定

采用鎳離子親和層析法對帶有His標簽的重組蛋白進行純化，結果如圖7所示，過柱后的洗滌液在47 kD左右出現特異性條帶，但同時伴隨著彌散性雜蛋白，說明在洗滌過程中有部分目的蛋白被洗脫。洗脫液E1和E2出現了較為清晰的目的條帶，且幾乎無雜蛋白污染，純度大于90%，將其收集后進行活性鑒定。

圖7 表達條件優化的Western blot鑒定結果Fig. 7 Western blot analysis of the purifi ed protein

2.6 純化蛋白的活性鑒定

以正常的Sf9細胞裂解蛋白為對照，按照已優化的ELISA方法對純化蛋白進行活性鑒定，結果如表1所示，純化得到的受體蛋白與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺3 種β激動劑的酶標記物均能夠特異性吸附，OD值分別為0.983、0.947和0.912，表明純化后的重組受體蛋白仍然保持了特異性識別β激動劑的生物活性。

表1 純化蛋白ELISA測定結果Table 1 Determination of the purifi ed protein by ELISA

3 討 論

提高β2AR表達效果的策略有很多，如密碼子優化、將疏水氨基酸突變為親水氨基酸、增加表達基因中的GC含量、摸索適宜的表達條件、不同蛋白標簽的作用和有效終止子的使用等[27]。此外，定點突變也用于提高β2AR的表達水平和活性。如Warne等[28]在Sf9細胞中表達了截短的火雞β2AR，其去除了N端的糖基化位點，并將116位的半胱氨酸突變為亮氨酸，達到了每升培養基生產0.5 mg粗蛋白的較高表達水平。本研究所采用的方法是將野生型β2AR基因按照昆蟲細胞的密碼子偏好性進行優化，使其更適合于昆蟲細胞表達系統，同時在C端增加了組氨酸標簽，這些操作均在一定程度上提高了蛋白表達水平，接近了每升毫克數量級的表達量，同時組氨酸標簽的添加也為后續的純化操作提供了便利。

昆蟲桿狀病毒表達系統（Bac-to-Bac）具有人們所普遍接受的一些優點[29]：可進行轉錄翻譯后的加工修飾，使重組蛋白的生物活性接近天然蛋白；表達水平高，可同時表達多個外源基因；克隆容量大，能插入10 kb左右的外源基因；生物安全性好，在自然條件下桿狀病毒對脊椎動物無致病性，也不能在脊椎動物細胞中復制表達和融合，是遺傳學上最為安全的表達載體。基于以上原因，該表達系統是一種非常理想的真核表達系統。由于昆蟲桿狀病毒表達系統在產量和生物活性方面的良好表現，因此它也是目前國內外用于G蛋白偶聯受體（GPCRs）類膜蛋白體外表達最為常用的表達系統。本研究對影響表達水平最為顯著的兩個因素進行了優化，得到感染細胞使用的MOI最適為5，表明MOI過高或過低時均會對桿狀病毒的生長產生抑制效應。適宜的表達時間為感染后48 h，與Cheng Guyue等[24]所得的結果相同。

膜蛋白的純化一直以來都被認為具有極大的挑戰性，β2AR受體具有GPCRs共有的7 次跨膜α螺旋結構，純化時面臨著蛋白生物活性喪失和回收率不高等難題。本研究依據重組蛋白上添加的6×His標簽，采用近年來普遍使用的膜蛋白純化方法Ni2+親和層析法，并對純化蛋白進行了Western blot檢測和直接ELISA活性鑒定。經典的受體活性鑒定方法多采用以125I-CYP為放射性配基的檢測法，盡管靈敏性較高，但放射性配基價格昂貴，實驗條件復雜，且對操作人員健康影響較大。因此，本實驗選擇由王迪[30]采用的ELISA活性鑒定方法，不僅簡便安全，而且為后續建立基于受體的非放射性快速分析方法進行了初步探索。

4 結 論

本研究利用昆蟲桿狀病毒表達系統在Sf9細胞中成功表達了密碼子優化后的β2AR基因，篩選得到的適宜表達條件為：感染細胞使用的MOI值5、感染后表達時間48 h。Western blot分析可知在47 kD左右出現單一清晰的特異性條帶，與目的蛋白分子質量大小一致。純化后所得受體蛋白純度大于90%，ELISA活性鑒定結果表明該受體蛋白對鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺3 種β激動劑的酶標記物均呈特異性吸附，OD值依次為0.983、0.947和0.912。本實驗為β2AR活性蛋白的大量制備及建立基于該受體的β激動劑快速檢測方法提供了科學依據。

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Expression and Purifi cation of β2Adren ergic Receptor in Sf9 Cells

WANG Jian1,2, LIU Yuan1, ZHANG Junhua1, HAN Zhengzheng1, LAN Fengying1
(1. College of Agriculture and Forestry, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China;2. Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products of CAAS, Key Laboratory of Agrifood Safety and Quality,Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China)

Codon optimization, construction of recombinant baculovirus system (Bac-to-Bac), screening of optimal expression conditions and Ni-chelating affi nity chromatography were used to develop an effi cient strategy for the expression and purifi cation of β2adrenergic receptor（β2AR）gene in Sf9 cells. The modifi ed β2AR gene was artifi cially synthesized and cloned to the transfer vector pFastBac1 to construct the recombinant baculovirus expression plasmid pFastBac1-β2AR′.Then Sf9 cells were transfected with the recombinant plasmid. The expression conditions were optimized. The expression product was purifi ed by Ni-NTA-affi nity chromatography and its ligand binding affi nity was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results showed that the optimal expression conditions were as follows: multiplicity of infection (MOI) of the infected ce lls, 5; and expression time, 48 h. In the Western blot analysis, a single band with an apparent molecular mass of 47 kD appeared as expected. After purifi cation, the recombinant protein was more than 90%pure. The ligand binding assay indicated that it could specifi cally bind to all three horseradish peroxidase (HRP)-β-agonists:clenbuterol, salbutamol, ractopamine, and the OD values obtained from ELISA were 0.983, 0.947 and 0.912, respectively.In this paper, the effi cient expression of β2AR in Sf9 cells was accomplished. Furthermore, the purifi ed receptor protein remained better binding affinity to β-agonists, laying a foundation for developing a rapid multi-residue assay for the determination of β-agonists with β2AR.

β2adrenergic receptor; baculovirus expression vector; Sf9 cells; expression; purifi cation

10.7506/spkx1002-6630-201720006

TS201.6

A

1002-6630（2017）20-0034-06

王健, 劉媛, 張俊花, 等. β2腎上腺素受體基因在Sf9細胞中的表達及純化[J]. 食品科學, 2017, 38(20): 34-39. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720006. http://www.spkx.net.cn

WANG Jian, LIU Yuan, ZHANG Junhua, et al. Expression and purifi cation of β2adrenergic receptor in Sf9 cells[J]. Food Science,2017, 38(20)∶ 34-39. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720006. http∶//www.spkx.net.cn

2016-09-24

河北北方學院博士啟動基金項目（201706）；公益性行業（農業）科研專項（201203094）

王健（1980—），男，副教授，博士，研究方向為食品安全快速檢測技術。E-mail：xuanyuanjian0228@126.com