β2腎上腺素受體基因在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)及純化

王 健，劉 媛，張俊花，韓正政，蘭鳳英

β2腎上腺素受體基因在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)及純化

王 健1,2，劉 媛1，張俊花1，韓正政1，蘭鳳英1

（1.河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

通過密碼子優(yōu)化、昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（Bac-to-Bac）構(gòu)建、表達(dá)條件篩選及鎳柱親和層析，研究β2腎上腺素受體（β2adrenergic receptor，β2AR）基因（β2AR）在昆蟲細(xì)胞Sf9中的高效表達(dá)及純化策略。方法：人工合成改造后的β2AR基因，將其克隆至轉(zhuǎn)移載體pFastBac1中，構(gòu)建重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒pFastBac1-β2AR’，轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9，優(yōu)化表達(dá)條件，采用鎳離子親和層析法純化重組蛋白并進(jìn)行活性鑒定。結(jié)果：適宜的表達(dá)條件為感染細(xì)胞使用的感染復(fù)數(shù)5、感染后表達(dá)時(shí)間48 h，Western blot分析顯示在47 kD左右處出現(xiàn)清晰的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。純化的受體蛋白純度大于90%，活性鑒定結(jié)果顯示該受體蛋白可特異性吸附鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多 巴胺3 種β激動(dòng)劑的酶標(biāo)記物，OD值分別為0.983、0.947和0.91 2。結(jié)論：本研究實(shí)現(xiàn)了β2AR受體在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)，且純化后的受體蛋白保持了較好的β激動(dòng)劑親和活性，為利用β2AR受體開展β激動(dòng)劑多殘留快速檢測(cè)技術(shù)提供了依據(jù)。

β2腎上腺素受體；桿狀病毒表達(dá)載體；Sf9細(xì)胞；表達(dá)；純化

目前，β激動(dòng)劑（俗稱“瘦肉精”）的違禁添加仍然是影響我國(guó)畜產(chǎn)品安全及養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的熱點(diǎn)問題之一。特別是多種β激動(dòng)劑的混合使用及新型結(jié)構(gòu)類似物的層出不窮，充分暴露出了現(xiàn)行檢測(cè)技術(shù)對(duì)該類違禁物的多殘留高通量分析及未知物篩查存在嚴(yán)重不足。

現(xiàn)有針對(duì)β激動(dòng)劑檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法及研究報(bào)道主要分為確證檢測(cè)技術(shù)和快速檢測(cè)技術(shù)兩大類。確證分析方法常見的有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）[1]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[2-3]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[4-5]和四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（quadrupole-time of flight，Q-TOF）[6-7]等，但其均存在著儀器設(shè)備昂貴、操作步驟復(fù)雜等固有缺點(diǎn)。近年來快速檢測(cè)方法順應(yīng)市場(chǎng)需要和監(jiān)管需求異軍突起，將傳統(tǒng)的抗原抗體識(shí)別體系與新興的材料或信號(hào)放大機(jī)制相結(jié)合形成了多種方法，如酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）[8-9]、膠體金免疫層析[10-11]、電化學(xué)[12-13]、量子點(diǎn)[14]和傳感器[15]等，但它們往往只能檢測(cè)有限的特定目標(biāo)物，使用范圍仍有很大的局限性。

基于受體的快速檢測(cè)方法是利用受體與配體間的特異性吸附，從而完成具有相同生物學(xué)效應(yīng)的一類目標(biāo)物的類特異性測(cè)定，可實(shí)現(xiàn)對(duì)β激動(dòng)劑類違禁物的多殘留檢測(cè)和非目標(biāo)物分析。β2腎上腺素受體（β2adrenergic receptor，β2AR）是構(gòu)建β激動(dòng)劑受體檢測(cè)方法的關(guān)鍵識(shí)別元件，鑒于天然β2AR在生物體內(nèi)的極低豐度和分離難度，近些年體外表達(dá)已成為獲得該受體的主流方法[16]。β2AR是具有7次跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)的膜蛋白[17]，影響其用于檢測(cè)方法研發(fā)的難點(diǎn)主要集中在重組β2AR受體的數(shù)量、活性及純度等方面。國(guó)內(nèi)外已有研究報(bào)道表明，通過大腸桿菌[18]、酵母[19]、昆蟲細(xì)胞[20]、哺乳動(dòng)物細(xì)胞[21]以及無細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)[22]均可在體外制備具有β激動(dòng)劑親和活性的蛋白，但表達(dá)水平和活性強(qiáng)弱因宿主細(xì)胞不同而呈現(xiàn)出較大差異[23]。其中桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞草地貪葉蛾（Spodoptera frugierda）卵巢細(xì)胞Sf9是β2AR受體最為有效的體外表達(dá)體系之一，重組蛋白不僅產(chǎn)量高，而且具有與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相近的蛋白活性。但國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道極少，僅見Cheng Guyue等[24]利用該表達(dá)體系對(duì)野生型β2AR基因進(jìn)行了表達(dá)和純化。由于β2AR基因中存在著不適于昆蟲細(xì)胞表達(dá)的稀有密碼子，影響了表達(dá)效果，因此本研究擬先對(duì)野生型β2AR基因改造后再進(jìn)行表達(dá)嘗試，以求實(shí)現(xiàn)β2AR的高效表達(dá)。

本研究首先對(duì)前期克隆得到的豬β2AR基因進(jìn)行改造，然后將其與轉(zhuǎn)移載體pFastBac1連接，構(gòu)建重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，優(yōu)化得到適宜的感染細(xì)胞感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）和表達(dá)時(shí)間，采用Ni2+親和層析法純化重組蛋白并進(jìn)行ELISA活性分析，以期為建立基于重組受體的β激動(dòng)劑多殘留快速檢測(cè)方法提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬β2AR基因重組克隆質(zhì)粒pMD-18T-β2AR由筆者前期構(gòu)建及所在實(shí)驗(yàn)室保存；Sf9細(xì)胞 中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（主要包括轉(zhuǎn)移載體pFastBacTM1、大腸桿菌（Escherichia coli）DH10 BacTM菌株、E. coli DH5α和轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin） 美國(guó)Invitrogen公司；T4連接酶 寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒 美國(guó)Axygen公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ 美國(guó)NEB公司；昆蟲細(xì)胞無血清培養(yǎng)基SF 900ⅡSFM 美國(guó)Hyclone公司；辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠二抗 美國(guó)Sigma公司；His鼠源單克隆抗體、Ni-NTA樹脂 美國(guó)Qiagen公司。

1.2 儀器與設(shè)備

9902型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；Imaging G3凝膠成像儀 北京昊諾斯科技有限公司；Power Pac 300型DNA電泳儀、Powerpac Universal蛋白電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；AKTA explorer蛋白純化系統(tǒng) 美國(guó)GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 β2AR基因序列的改造與合成

利用Protparam工具（http://www.expasy.org/tools/protparam.html）對(duì)已克隆得到的豬β2AR基因（GenBank登錄號(hào)：KF023571.1）對(duì)應(yīng)的氨基酸序列進(jìn)行理化特性分析，依據(jù)昆蟲細(xì)胞密碼子的偏好性對(duì)其進(jìn)行改造，使其適應(yīng)昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。分別在改造后基因的5’端和3’端引入限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ位點(diǎn)和限制性內(nèi)切酶XbaⅠ位點(diǎn)，改造后基因由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.2 重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

將上述合成的β2AR改造基因與轉(zhuǎn)移載體pFastBac1分別用EcoRⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，然后瓊脂糖凝膠電泳切膠回收目的片段和載體片段，經(jīng)T4 DNA連接酶16 ℃條件下連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取Amp陽(yáng)性單菌落并提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，將初步鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，驗(yàn)證讀碼框的正確性，序列正確的重組質(zhì)粒命名為pFastBac1-β2AR′。

1.3.3 重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞

Sf9細(xì)胞的培養(yǎng)：選擇無血清培養(yǎng)基SF 900ⅡSFM，27 ℃孵育，無需CO2，采用半貼壁培養(yǎng)方式，3～4 d傳代一次。在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將9×105個(gè)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Sf9細(xì)胞接種于每孔含有2 mL培養(yǎng)基的平板中，27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。采用Cellfectin試劑以脂質(zhì)體法將鑒定正確的pFastBac1-β2AR’質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，具體步驟參考Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)說明書進(jìn)行。在27 ℃潮濕條件下孵育72 h左右，在倒置顯微鏡下觀察，直到細(xì)胞發(fā)生典型病毒感染的病變，從培養(yǎng)基中收獲細(xì)胞制備P1代重組病毒株。測(cè)定P1病毒株的滴度，并擴(kuò)增得到滴度更高的P2病毒株，測(cè)定滴度后同法擴(kuò)增得到P3病毒株，用于重組蛋白表達(dá)。

1.3.4 表達(dá)條件的優(yōu)化及鑒定

大量因素影響著重組蛋白的最優(yōu)表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)MOI和感染后表達(dá)時(shí)間兩個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行了優(yōu)化。首先，用鑒定正確的重組桿狀病毒質(zhì)粒進(jìn)行小量表達(dá)嘗試，篩選能夠特異表達(dá)的病毒株。然后將其擴(kuò)增得到的P3病毒株進(jìn)行表達(dá)條件的優(yōu)化研究，具體方法如下：在24孔細(xì)胞板中，以6×105個(gè)/孔接種Sf9細(xì)胞，接觸至少30 min；棄去培養(yǎng)基，用新鮮的培養(yǎng)基清洗一次，換上300 μL新鮮培養(yǎng)基；按照MOI值1、5、10將重組毒株分別感染Sf9細(xì)胞，在27 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對(duì)應(yīng)每個(gè)MOI值分別在48 h和72 h感染后收獲細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液（含終濃度為1 mmol/L的苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）裂解后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和Western blot檢測(cè)，陰性對(duì)照為正常Sf9昆蟲細(xì)胞裂解物。

1.3.5 重組受體蛋白的純化

采用固定有鎳離子的親和色譜柱對(duì)帶有His標(biāo)簽的重組蛋白進(jìn)行蛋白純化。以Ni-NTA樹脂為填料，對(duì)適宜表達(dá)條件下獲得的細(xì)胞裂解產(chǎn)物進(jìn)行純化，主要步驟為：1）柱平衡：以1 mL/min的流速用10 CV的Lysis buffer平衡色譜柱。2）上樣純化：將細(xì)胞裂解液過柱，流速為1 mL/min。3）漂洗：連續(xù)用結(jié)合緩沖液PBS、含有30 mmol/L咪唑的PBS及含有50 mmol/L咪唑的PBS各5～10 CV漂洗柱子，流速為1 mL/min。4）洗脫：用含有250 mmol/L咪唑的PBS以1 mL/min的流速洗脫色譜柱。最后取適量純化蛋白進(jìn)行Western blot和活性鑒定。

1.3.6 純化蛋白的Western blot及活性鑒定

以正常Sf9昆蟲細(xì)胞裂解物為陰性對(duì)照，采用His鼠源單克隆抗體對(duì)獲得的純化蛋白樣品進(jìn)行Western blot鑒定。參考筆者前期優(yōu)化的ELISA方法[25-26]，測(cè)定該純化受體蛋白對(duì)鹽酸克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇3 種β激動(dòng)劑HRP酶標(biāo)記物的特異性結(jié)合程度，對(duì)其進(jìn)行活性鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 改造后β2AR基因序列的分析與鑒定

根據(jù)β2AR的氨基酸組成，考慮昆蟲細(xì)胞的偏好性，進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在編碼核苷酸序列的5’端添加了6×His標(biāo)簽的核苷酸序列，改造后的β2AR基因及其氨基酸序列如圖1所示，與野生型β2AR不同的基因用下劃線標(biāo)示，受體結(jié)合部位的氨基酸用圓圈標(biāo)示。1%瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果與理論設(shè)計(jì)一致，表明已獲得目的基因。

圖1 改造后的β2AARR基因序列及其編碼的氨基酸序列Fig. 1 Modifi ed gene and amino acid sequence of β2AR

2.2 重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XbaⅠ對(duì)重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示，在4.8 kb和1.3 kb左右分別出現(xiàn)了pFastBac1載體條帶和目的基因條帶，與預(yù)期大小相符，將雙酶切鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與基因合成報(bào)告完全一致，將該重組質(zhì)粒命名為pFastBac1-β2AR’。

圖2 重組桿狀病毒質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig. 2 Identifi cation of recombinant plasmid by double restriction enzyme digestion

2.3 重組桿狀病毒的鑒定及轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞病變

采用病毒空斑試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度，結(jié)果顯示P1病毒株滴度為2×106PFU/mL，P2病毒株滴度為1×107PFU/mL。用重組桿狀病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，27 ℃潮濕條件下孵育，觀察細(xì)胞形態(tài)變化：轉(zhuǎn)染后24 h，細(xì)胞直徑逐漸增大且變圓；轉(zhuǎn)染后24～72 h，細(xì)胞停止增長(zhǎng)，細(xì)胞核顯著增大；轉(zhuǎn)染后72 h，細(xì)胞內(nèi)顆粒狀物增多，部分貼壁細(xì)胞脫落甚至消亡（圖3）；以上細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化證明重組桿狀病毒質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。

圖3 正常Sf9細(xì)胞（a）及轉(zhuǎn)染后72 h Sf9細(xì)胞（b）顯微鏡圖（×400）Fig. 3 Normal Sf9 cells and Sf9 cells at 72 h post transfection (× 400)

2.4 表達(dá)條件的優(yōu)化及產(chǎn)物鑒定

挑選兩個(gè)鑒定正確的重組桿粒在6 孔細(xì)胞板中轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，每個(gè)桿粒轉(zhuǎn)染2 個(gè)孔，表達(dá)測(cè)試結(jié)果如圖4、5所示。SDS-PAGE結(jié)果（圖4）顯示，由于檢測(cè)靈敏度等原因從圖中無法清晰地看到目的蛋白條帶。Western blot進(jìn)一步分析（圖5）得知，與正常的Sf9細(xì)胞相比，兩重組桿粒均在47 kD左右處出現(xiàn)了單一的特異性反應(yīng)條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，且2#桿粒表達(dá)產(chǎn)物（3、4泳道）條帶更加清晰，因此選擇2#桿粒擴(kuò)增得到的P3病毒株進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化試驗(yàn)。由圖6可知，第2泳道的蛋白條帶最為清晰濃重，因此篩選獲得的適宜表達(dá)條件為：MOI值5、感染后表達(dá)時(shí)間48 h。

圖4 Sf9細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 4 SDS-PAGE analysis of expression product from Sf9 cells

圖5 Sf9細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物的Western blot結(jié)果Fig. 5 Western blot analysis of expression product on Sf9 cells

圖6 表達(dá)條件優(yōu)化的Western blot鑒定Fig. 6 Western blot analysis under the optimized expression conditions

2.5 純化蛋白的Western blot鑒定

采用鎳離子親和層析法對(duì)帶有His標(biāo)簽的重組蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果如圖7所示，過柱后的洗滌液在47 kD左右出現(xiàn)特異性條帶，但同時(shí)伴隨著彌散性雜蛋白，說明在洗滌過程中有部分目的蛋白被洗脫。洗脫液E1和E2出現(xiàn)了較為清晰的目的條帶，且?guī)缀鯚o雜蛋白污染，純度大于90%，將其收集后進(jìn)行活性鑒定。

圖7 表達(dá)條件優(yōu)化的Western blot鑒定結(jié)果Fig. 7 Western blot analysis of the purifi ed protein

2.6 純化蛋白的活性鑒定

以正常的Sf9細(xì)胞裂解蛋白為對(duì)照，按照已優(yōu)化的ELISA方法對(duì)純化蛋白進(jìn)行活性鑒定，結(jié)果如表1所示，純化得到的受體蛋白與鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺3 種β激動(dòng)劑的酶標(biāo)記物均能夠特異性吸附，OD值分別為0.983、0.947和0.912，表明純化后的重組受體蛋白仍然保持了特異性識(shí)別β激動(dòng)劑的生物活性。

表1 純化蛋白ELISA測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination of the purifi ed protein by ELISA

3 討 論

提高β2AR表達(dá)效果的策略有很多，如密碼子優(yōu)化、將疏水氨基酸突變?yōu)橛H水氨基酸、增加表達(dá)基因中的GC含量、摸索適宜的表達(dá)條件、不同蛋白標(biāo)簽的作用和有效終止子的使用等[27]。此外，定點(diǎn)突變也用于提高β2AR的表達(dá)水平和活性。如Warne等[28]在Sf9細(xì)胞中表達(dá)了截短的火雞β2AR，其去除了N端的糖基化位點(diǎn)，并將116位的半胱氨酸突變?yōu)榱涟彼幔_(dá)到了每升培養(yǎng)基生產(chǎn)0.5 mg粗蛋白的較高表達(dá)水平。本研究所采用的方法是將野生型β2AR基因按照昆蟲細(xì)胞的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，使其更適合于昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，同時(shí)在C端增加了組氨酸標(biāo)簽，這些操作均在一定程度上提高了蛋白表達(dá)水平，接近了每升毫克數(shù)量級(jí)的表達(dá)量，同時(shí)組氨酸標(biāo)簽的添加也為后續(xù)的純化操作提供了便利。

昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（Bac-to-Bac）具有人們所普遍接受的一些優(yōu)點(diǎn)[29]：可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄翻譯后的加工修飾，使重組蛋白的生物活性接近天然蛋白；表達(dá)水平高，可同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因；克隆容量大，能插入10 kb左右的外源基因；生物安全性好，在自然條件下桿狀病毒對(duì)脊椎動(dòng)物無致病性，也不能在脊椎動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制表達(dá)和融合，是遺傳學(xué)上最為安全的表達(dá)載體?；谝陨显颍摫磉_(dá)系統(tǒng)是一種非常理想的真核表達(dá)系統(tǒng)。由于昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在產(chǎn)量和生物活性方面的良好表現(xiàn)，因此它也是目前國(guó)內(nèi)外用于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）類膜蛋白體外表達(dá)最為常用的表達(dá)系統(tǒng)。本研究對(duì)影響表達(dá)水平最為顯著的兩個(gè)因素進(jìn)行了優(yōu)化，得到感染細(xì)胞使用的MOI最適為5，表明MOI過高或過低時(shí)均會(huì)對(duì)桿狀病毒的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制效應(yīng)。適宜的表達(dá)時(shí)間為感染后48 h，與Cheng Guyue等[24]所得的結(jié)果相同。

膜蛋白的純化一直以來都被認(rèn)為具有極大的挑戰(zhàn)性，β2AR受體具有GPCRs共有的7 次跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)，純化時(shí)面臨著蛋白生物活性喪失和回收率不高等難題。本研究依據(jù)重組蛋白上添加的6×His標(biāo)簽，采用近年來普遍使用的膜蛋白純化方法Ni2+親和層析法，并對(duì)純化蛋白進(jìn)行了Western blot檢測(cè)和直接ELISA活性鑒定。經(jīng)典的受體活性鑒定方法多采用以125I-CYP為放射性配基的檢測(cè)法，盡管靈敏性較高，但放射性配基價(jià)格昂貴，實(shí)驗(yàn)條件復(fù)雜，且對(duì)操作人員健康影響較大。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇由王迪[30]采用的ELISA活性鑒定方法，不僅簡(jiǎn)便安全，而且為后續(xù)建立基于受體的非放射性快速分析方法進(jìn)行了初步探索。

4 結(jié) 論

本研究利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在Sf9細(xì)胞中成功表達(dá)了密碼子優(yōu)化后的β2AR基因，篩選得到的適宜表達(dá)條件為：感染細(xì)胞使用的MOI值5、感染后表達(dá)時(shí)間48 h。Western blot分析可知在47 kD左右出現(xiàn)單一清晰的特異性條帶，與目的蛋白分子質(zhì)量大小一致。純化后所得受體蛋白純度大于90%，ELISA活性鑒定結(jié)果表明該受體蛋白對(duì)鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇及萊克多巴胺3 種β激動(dòng)劑的酶標(biāo)記物均呈特異性吸附，OD值依次為0.983、0.947和0.912。本實(shí)驗(yàn)為β2AR活性蛋白的大量制備及建立基于該受體的β激動(dòng)劑快速檢測(cè)方法提供了科學(xué)依據(jù)。

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Expression and Purifi cation of β2Adren ergic Receptor in Sf9 Cells

WANG Jian1,2, LIU Yuan1, ZHANG Junhua1, HAN Zhengzheng1, LAN Fengying1
(1. College of Agriculture and Forestry, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China;2. Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-products of CAAS, Key Laboratory of Agrifood Safety and Quality,Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China)

Codon optimization, construction of recombinant baculovirus system (Bac-to-Bac), screening of optimal expression conditions and Ni-chelating affi nity chromatography were used to develop an effi cient strategy for the expression and purifi cation of β2adrenergic receptor（β2AR）gene in Sf9 cells. The modifi ed β2AR gene was artifi cially synthesized and cloned to the transfer vector pFastBac1 to construct the recombinant baculovirus expression plasmid pFastBac1-β2AR′.Then Sf9 cells were transfected with the recombinant plasmid. The expression conditions were optimized. The expression product was purifi ed by Ni-NTA-affi nity chromatography and its ligand binding affi nity was determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The results showed that the optimal expression conditions were as follows: multiplicity of infection (MOI) of the infected ce lls, 5; and expression time, 48 h. In the Western blot analysis, a single band with an apparent molecular mass of 47 kD appeared as expected. After purifi cation, the recombinant protein was more than 90%pure. The ligand binding assay indicated that it could specifi cally bind to all three horseradish peroxidase (HRP)-β-agonists:clenbuterol, salbutamol, ractopamine, and the OD values obtained from ELISA were 0.983, 0.947 and 0.912, respectively.In this paper, the effi cient expression of β2AR in Sf9 cells was accomplished. Furthermore, the purifi ed receptor protein remained better binding affinity to β-agonists, laying a foundation for developing a rapid multi-residue assay for the determination of β-agonists with β2AR.

β2adrenergic receptor; baculovirus expression vector; Sf9 cells; expression; purifi cation

10.7506/spkx1002-6630-201720006

TS201.6

A

1002-6630（2017）20-0034-06

王健, 劉媛, 張俊花, 等. β2腎上腺素受體基因在Sf9細(xì)胞中的表達(dá)及純化[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(20): 34-39. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720006. http://www.spkx.net.cn

WANG Jian, LIU Yuan, ZHANG Junhua, et al. Expression and purifi cation of β2adrenergic receptor in Sf9 cells[J]. Food Science,2017, 38(20)∶ 34-39. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720006. http∶//www.spkx.net.cn

2016-09-24

河北北方學(xué)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（201706）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203094）

王?。?980—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩焖贆z測(cè)技術(shù)。E-mail：xuanyuanjian0228@126.com