HPLC-DAD-FLD同時測定柑橘果汁中12 種多甲氧基黃酮和香豆素類物質

李貴節，譚 祥，王 華,*，吳厚玖，Russell ROUSEFF

HPLC-DAD-FLD同時測定柑橘果汁中12 種多甲氧基黃酮和香豆素類物質

李貴節1,2,3,4，譚 祥1，王 華1,*，吳厚玖1，Russell ROUSEFF1

（1.西南大學柑桔研 究所，中國農業科學院柑桔研究所，重慶 400712；2.重慶第二師范學院，重慶市功能性食品協同創新中心，重慶市功能性食品工程技術研究中心，重慶 400067；3.西南大學食品科學學院，重慶 400715；4.重慶第二師范學院生物與化學工程學院，重慶 400067）

建立高效液相色譜-串聯二極管陣列檢測器和熒光檢測器（high performance liquid chromatography-diode array detector-fl uorescence detector，HPLC-DAD-FLD）同時檢測柑橘果汁中12 種多甲氧基黃酮、香豆素及呋喃香豆素類物質的方法。以0.01%磷酸、甲醇、乙腈組成三元流動相進行梯度洗脫，12 種物質在30 min內實現基線分離。利用DAD和FLD獲得各物質的紫外和熒光光譜信息，將柑橘果汁樣品組分的光譜與之比對，并結合色譜保留時間，實現樣品成分的定性分析。分別以320 nm和450 nm為紫外和熒光的檢測波長，研究該方法的定量性能。結果顯示：標準曲線線性關系良好；熒光定量限低至μg/L級，可作為紫外定量的重要補充手段；果汁回收率的紫外和熒光檢測值分別為95.2%～104.8%和94.5%～103.5%。該方法對樣品定性、定量分析準確，適合柑橘多甲氧基黃酮、香豆素等能發射熒光物質的檢測。

高效液相色譜；熒光檢測；柑橘果汁；多甲氧基黃酮；香豆素

柑橘是蕓香科柑橘屬植物的總稱，其果實是世界第一、我國第二大栽培水果[1]。柑橘果汁富含VC、鈣、磷、鉀、檸檬酸、類胡蘿卜素等成分，以其較高的營養價值和獨特的口感風味深受人們的喜愛[2]。柑橘果汁中還含有一大類氧雜環化合物，如多甲氧基黃酮（polymethoxyflavones，PMFs）和香豆素類（包括呋喃香豆素類），其氧雜環母核結構如圖1所示。它們都是柑橘的次生代謝產物，經由莽草酸途徑合成前體[3-4]，大都具有廣泛的生物活性[5]。

多甲氧基黃酮幾乎只天然存在于柑橘果實中，其定義為甲氧基數不小于4的一類黃酮[6]。PMFs具有較高的口服生物活性，有很強的抗過敏、抗氧化、抗炎癥、抑菌及抗癌抗腫瘤等有益作用[7-8]。對皮膚癌變如黑色素瘤細胞，PMFs在體外和體內實驗中均表現出良好的預防、抑制和抗增生作用[9-12]。此外，PMFs的種類和含量差異還能用于柑橘產品鑒偽、品種及原產地區分等領域[13-14]。

柑橘中的香豆素及其呋喃衍生物的積累則主要源于植株對外界不利因素的響應，這類物質常存在于檸檬、來檬、佛手柑等果實中[15]。有研究顯示，香豆素類物質具有抗氧化、抗微生物、護肝和預防腫瘤壞死等功能[16-19]。然而，部分呋喃香豆素對人體會產生不利作用，如香葉氧基呋喃香豆素二聚體導致葡萄柚汁抑制肝藥酶，從而影響藥物代謝[20]；佛手柑內酯等具有一定的光致敏性，可能誘發皮膚的光敏病變[21-22]。因此，對于香豆素類物質在柑橘果汁中分布的追蹤，對食源性疾病的預防具有一定的意義。

多甲氧基黃酮、香豆素及呋喃香豆素雖備受關注，但少有研究同時對三者在柑橘鮮果及產品中的分布進行研究[23-24]；對果汁中三者的定性和定量分析更是僅有一篇報道，且僅使用了紫外檢測器進行分析定量[25]。事實上，上述物質在激發狀態下大都能發射熒光，從而提供了另一條分析檢測的途徑。本研究采用高效液相色譜-串聯二極管陣列檢測器和熒光檢測器（high performance liquid chromatography-diode array detector-fluorescence detector，HPLC-DAD-FLD），通過對各物質的紫外和熒光特征光譜的獲取，確定儀器分析的最佳條件，并利用2 種檢測器分別定量，建立同時檢測柑橘果汁中12 種多甲氧基黃酮、香豆素及呋喃香豆素類物質的方法。

表1 標準對照物質信息Table 1 Information about standard references used in this study

圖1 多甲氧基黃酮、香豆素及呋喃香豆素類結構簡式Fig. 1 Schematic structures of polymethoxyfl avones, coumarins and furocoumarins

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘新鮮果實均采自西南大學柑桔研究所、中國農業科學院柑桔研究所柑橘圃。非濃縮（not from concentrate，NFC）橙汁取自西南大學柑桔研究所，NFC葡萄柚汁購自美國Florida’s Natural公司。

標準對照物質：川陳皮素、橘皮素、甜橙黃酮、七甲氧基黃酮、檸美內酯、異橙皮內酯、東莨菪亭、傘形花內酯、佛手柑素、佛手柑內酯、環氧佛手柑素、佛手酚；內標物質：補骨脂素、香豆素，詳細信息見圖1、表1。

磷酸、甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Sigma公司；乙酸乙酯（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Ultimate 3000 HPLC儀、DAD、FLD 德國Thermo Scientific公司；KQ5200DE超聲清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司；HN200多功能氮吹儀 山東濟南海能儀器股份有限公司；Milli-Q Reference超純水系統德國Merck-Millpore公司；MPZ9柑橘榨汁機 德國博朗公司；0.22 μm有機相微 孔濾頭 上海安譜科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對照標準品溶液的制備

準確稱取1～12號對照標準物質各5.00 mg，分別用甲醇（或乙腈）溶液溶解，并定容至5.00 mL，配成1.00 g/L的標準品母液備用。

對于內標物質，準確稱取補骨脂素和香豆素各10.00 mg，分別用甲醇溶液溶解，并定容至5.00 mL，配制成2.00 g/L的內標母液備用。

采用逐級稀釋法用甲醇將標準品母液配制成一系列質量濃度的混合標準品溶液。添加5 μL補骨脂素母液到混合標準品中，并隨混標一同稀釋。

1.3.2 樣品的制備

采用手動壓榨法制取新鮮柑橘果汁。量取10 mL鮮榨柑橘汁或NFC果汁，加入10 μL香豆素母液作內標，再加入10 mL乙酸乙酯振蕩萃取，靜置分層后收集上清液，水相再重復以10 mL乙酸乙酯萃取；共提取3次，合并有機相，用氮氣吹干，加入1 mL甲醇后超聲波處理重溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾，再加入5 μL補骨脂素母液后待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Thermo Scientific HyPURITY C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流動相：0.01%磷酸溶液、甲醇和乙腈，采用梯度洗脫；檢測器設置：DAD波長掃描范圍210～400 nm；FLD激發波長掃描范圍250～400 nm，發射波長掃描范圍340～560 nm。其他設置：柱溫30℃，流速1 mL/min，進樣量5.0 μL。以紫外吸收光譜掃描圖、熒光發射光譜掃描圖以及色譜峰保留時間三者結合進行定性判斷。采用外標法定量。

2 結果與分析

2.1 流動相的選擇和洗脫條件優化

對于12 種多甲氧基黃酮、香豆素和呋喃香豆素類物質而言，因其母環都含有苯并吡喃酮結構，性質較為相似，因此需采用梯度洗脫的方式進行分離。考慮傘形花內酯及佛手酚等物質含有易解離的酚羥基，故流動相需為弱酸性以改變峰形和限制拖尾。實驗發現，加入乙酸調節pH值時存在較強的基線干擾，故選用干擾較小的0.01%磷酸溶液。設置原始流動相洗脫程序為斜線梯度：洗脫開始時，0.01%磷酸-乙腈溶液（50∶50，V/V）；洗脫時間為30 min時，0.01%磷酸-乙腈溶液（10∶90，V/V）。實驗發現，通過加入少量的甲醇可微調檸美內酯、佛手柑內酯、甜橙黃酮和異橙皮內酯的相對位置，從而獲得最佳分離度。經最終優化后的洗脫程序見表2，在該條件下，得到12 種物質混合標準品（包含加入的內標物質1）的紫外和熒光響應色譜圖。如圖2所示，各物質峰形良好，在30 min內實現所有成分的基線分離；熒光信號以倒峰的形式呈現，以便與紫外信號更清晰地對應。除佛手酚和橘皮素外，其他物質都有熒光響應。

表2 流動相洗脫程序Table 2 Gradient elution program

圖2 12 種標準對照物質及內標物質的HPLC圖Fig. 2 HPLC chromatogram of mixture of twelve reference standards and internal standards

2.2 紫外、熒光光譜及其應用

圖3 多甲氧基黃酮（A）、香豆素（B）和呋喃香豆素（C）的紫外吸收光譜（210～400 nm）和熒光發射光譜（340～560 nm）Fig. 3 UV spectra (210–400 nm) and fl uorescence emission spectra(340–560 nm) of polymethoxyfl avones, coumarins and furocoumarins

如圖3所示，FLD亦可記錄熒光的激發光譜，但由于激發光譜常與紫外吸收光譜類似，故本方法僅考慮發射光譜。總體上，各物質的光譜信息具有特征性，故可據此將待分析樣品成分的光譜圖與標準物質的光譜圖進行對比，對待測成分進行準確判斷。

表3 12 種標準物質紫外和熒光檢測線性關系、LOD和LOQTable 3 Linear relationship, limit of detection and limit of quantitation of UV and fl uorescence examination for the twelve reference standards

國內大量關于柑橘成分分析的報道都是基于紫外光譜[26-30]。然而，受限于樣品濃度、儀器分辨率以及人為因素等，僅憑紫外光譜難免會有判斷誤差。如圖3所示，各組內物質紫外譜圖具有一定的相似性，如檸美內酯和異橙皮內酯的最大吸收波長相近（324 nm和322 nm），佛手柑素和環氧佛手柑素的譜圖非常類似，這無疑對復雜樣品的準確判斷提出了挑戰。熒光光譜的引入為解決這一問題提供了輔助手段。檸美內酯和異橙皮內酯的熒光峰值發射波長分別為437 nm和395 nm，佛手柑素和環氧佛手柑素波長分別為479 nm和431 nm，均有明顯的區別。

本研究采用相同色譜條件下的紫外、熒光光譜以及保留時間3種不同手段，為樣品成分的準確檢測設置三重保障。同時，利用光譜數據對定量分析的波長進行了折中選擇，最終確定為：紫外吸收波長320nm，熒光激發波長340 nm、發射波長450 nm。異橙皮內酯由于熒光最大發射波長與其他物質相差過大，故以波長395 nm單獨定量。

2.3 標準曲線、檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）結果

在上述色譜分析條件下，測定0.06～4500 mg/L系列質量濃度的混合標準溶液。以測得各物質積分峰面積為縱坐標，質量濃度（mg/L）為橫坐標，繪制標準曲線。12 種物質的回歸方程、相關系數、方法LOD和LOQ如表3所示。測定質量濃度范圍內，各物質質量濃度與峰面積呈現良好的線性關系，R2在0.9984以上。不同檢測方法所得LOD及LOQ各不相同，甜橙黃酮、檸美內酯、東莨菪亭和佛手柑素用熒光檢測更加靈敏，其中東莨菪亭的熒光LOQ為0.0009 mg/L，比紫外檢測的靈敏度高100倍以上。

混合標準溶液中加入內標物質補骨脂素，其目的是監測在逐級稀釋的過程中各對照標準品加入量是否正確。對被測標準物質而言，其校正因子為常數，公式如下：

校正因子=（被測物濃度×內標物峰面積）/（被測物峰面積×內標物濃度）

2.4 回收率結果

分別對混合柑橘果汁樣品進行80%、100%、120%3個水平的加標回收實驗，每個實驗做3 次重復，驗證整套方法的準確性。如表4所示，2 種方法檢測混合果汁中各成分的回收率所得結果相近，分別為紫外回收率95.2%～104.8%和熒光回收率94.5%～103.5%，相對標準偏差分別為0.8%～4.1%和0.7%～4.1%。該結果表明，本實驗方法準確度較高，利用紫外和熒光2 種方法同時定量分析PMFs、香豆素和呋喃香豆素具有高可信度。

表4 柑橘混合果汁加標回收率Table 4 Recovery of the analytes in spiked samples of mixed citrus juice

2.5 樣品分析

采用1.3.2節和1.3.3節方法對NFC錦橙汁、鮮榨椪柑汁和NFC紅葡萄柚汁3 個樣品中的PMFs、香豆素和呋喃香豆素進行定性和定量檢測。如圖4所示，各樣品的紫外和熒光色譜圖在5 min以后呈現出良好的分離度，1～5 min范圍內出現峰堆集情況，反映出乙酸乙酯提取了部分極性較強的成分。由圖4可見，不同品種的柑橘果汁中含有的PMFs、香豆素和呋喃香豆素差異較大，錦橙汁主要含PMFs以及少量的異橙皮內酯；椪柑汁主要含PMFs，但甜橙黃酮含量較錦橙汁低；紅葡萄柚汁則主要含呋喃香豆素，如佛手酚和佛手柑素，以及少量的香豆素和PMFs；這3 類柑橘汁都不含東莨菪亭、傘形花內酯和環氧佛手柑素。進一步定量分析，由表5可知，各物質含量的熒光和紫外測定值的差異范圍在-6.2%～9.7%以內，兩者吻合度較好。紅葡萄柚含有極微量的檸美內酯，其含量無法由紫外檢出，但可被熒光檢出并準確定量；反之，椪柑中的七甲氧基黃酮可被紫外檢出，卻低于熒光的定量限。因此，結合紫外、熒光信號共同進行定量檢測，有助于擴大含量分析的范圍，提高定量的精度。

圖4 3 種柑橘果汁樣品的HPLC圖Fig. 4 HPLC chromatograms of three citrus juice samples

表5 3 種柑橘果汁樣品中的多甲氧基黃酮、香豆素和呋喃香豆素含量Table 5 Contents of polymethoxyfl avones, coumarins and furocoumarins in three citrus juice samples determined by HPLC-DAD-FLD

3 結 論

本實驗建立了HPLC-DAD-FLD同時檢測柑橘果汁中的12 種多甲氧基黃酮、香豆素及呋喃香豆素類物質的方法，上述物質在30 min內實現基線分離。采用2 種不同的檢測器可同時獲得各物質的紫外和熒光光譜信息，提高檢測靈敏度，檢出限可低至μg/L級，能滿足柑橘果汁中該類氧雜環化合物的分析檢測要求。

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Simultaneous Determination of Twelve Compounds of Polymethoxyfl avones, Coumarins and Furocoumarins in Citrus Juices by Using HPLC-DAD-FLD

LI Guijie1,2,3,4, TAN Xiang1, WANG Hua1,*, WU Houjiu1, Russell ROUSEFF1
(1. Citrus Research Institute, Southwest University, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China;2. Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food, Chongqing Engineering Research Center of Functional Food,Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China;3. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;4. College of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China)

A method using high performance liquid chromatography with diode array detection and fl uorescence detection(HPLC-DAD-FLD) was developed to simultaneously analyze 12 compounds of polymethoxyfl avones (PMFs), coumarins and furocoumarins in citrus juice samples. Baseline separation of twelve compounds was achieved within 30 min using gradient elution with a ternary mobile phase composed of 0.01% phosphoric acid, methanol and acetonitrile. Qualitative identifi cation of the components in citrus juices was confi rmed by comparing their UV and fl uorescence (FL) spectra and retention times with those of the reference standards. Quantitative analysis of the juice components was operated at a UV wavelength of 320 nm (OD320nm) and a fl uorescence emission of 450 nm. The calibration curves showed good linearity.The limit of quantitation (LOQ) with FLD was at as low as μg/L level so that FLD could be an important complementary tool to UV detection. The recovery tests showed a good accuracy for both UV (95.2%–104.8%) and FL (94.5%–103.5%)examination. In general, this method is accurate and reliable for qualitative and quantitative analysis of citrus juice components, especially the ones having fl uorescence emission like PMFs and coumarins.

high performance liquid chromatography (HPLC); fl uorescence detection; citrus juice; polymethoxyfl avones; coumarins

TS207.3

A

1002-6630（2017）20-0112-07

2016-12-29

公益性行業（農業）科研專項（201503142-12）；重慶市功能性食品協同創新中心建設項目（167001）；

中央高校基本科研業務費專項（XDJK2016E048）；重慶市功能性食品協同創新中心科研項目（ccicff-rp-201604）；

重慶市統籌城鄉教師教育研究中心2015年工作室項目（JDGZS201507）；

重慶第二師范學院2016年校級大學生創新創業訓練計劃項目（201605）

李貴節（1983—），男，副教授，博士研究生，研究方向為食品化學與營養學及功能性食品學。E-mail：ligj@cque.edu.cn

*通信作者：王華（1963—），男，研究員，本科，研究方向為柑橘加工。E-mail：wanghua@cric.cn

李貴節, 譚祥, 王華, 等. HPLC-DAD-FLD同時測定柑橘果汁中12 種多甲氧基黃酮和香豆素類物質[J]. 食品科學, 2017,38(20): 112-118. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720016. http://www.spkx.net.cn

LI Guijie, TAN Xiang, WANG Hua, et al. Simultaneous determination of twelve compounds of polymethoxyflavones,coumarins and furocoumarins in citrus juices by using HPLC-DAD-FLD[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 112-118.(in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720016. http∶//www.spkx.net.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720016