響應面試驗優化超聲法提取橄欖果實游離氨基酸工藝

彭真汾，謝 倩，池毓斌，陳清西*

響應面試驗優化超聲法提取橄欖果實游離氨基酸工藝

彭真汾，謝 倩，池毓斌，陳清西*

（福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002）

為獲得橄欖果實游離氨基酸的最佳提取工藝，以橄欖果實為實驗材料，通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗和響應面試驗優化超聲法提取橄欖果實游離氨基酸的最佳工藝。結果表明：各因素對游離氨基酸提取量的影響力由高到低為料液比＞提取次數＞超聲時間＞超聲功率＞乙醇體積分數＞超聲溫度；響應面法得出的最佳提取工藝為超聲時間20 min、料液比1∶41（g/mL）、提取次數3、超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、乙醇體積分數60%，游離氨基酸的提取量實際值為79.88 mg/g，與預測值相對誤差為2.62%，表明此優化工藝具有實際應用價值。

橄欖；游離氨基酸；超聲法；響應面法；Plackett-Burman設計；Box-Behnken設計

氨基酸是構成蛋白質的基本單位，是人體正常代謝和生理活動的重要成分，具有抗菌[1]、保肝保腎[2]、降血脂[3]等作用。氨基酸可分為水解氨基酸和游離氨基酸，其中水解氨基酸以結合態形式存在于肽和蛋白質中，主要體現物質的營養狀況[4-5]；游離氨基酸以游離態存在，不僅可通過呈味氨基酸反映食物口感和風味，以藥用氨基酸反映藥用價值[4,6-7]，并通過參與美拉德反應、使酚類物質發生褐變等直接影響食物的感官品質[8-9]；且提取游離氨基酸獲得的天然氨基酸可作為某些食品呈味添加劑，豐富食物口感[10]。

橄欖（Canarium album（Lour.）Raeusch.），為橄欖科（Burseraceae）橄欖屬（Canarium）植物，又名青果、青欖、白欖，屬熱帶、亞熱帶果樹[11]，是福建省的名特優水果，果實營養價值高，富含VC和鈣[12-13]，具有生津止渴[11]、解酒保肝[14]等藥用功效。橄欖氨基酸種類豐富，含量較高[15]，接近世界糧農組織和衛生組織建議的理性參考模式值（40%和60%）[16]，表明橄欖氨基酸具有較高的營養價值。且氨基酸含量、種類和比例是評價橄欖營養價值優劣的主要指標之一，對橄欖營養品質和風味均有重要貢獻[17]。目前，在橄欖氨基酸上的研究多集中于水解氨基酸[12,18-20]，對游離氨基酸研究仍鮮見報道。

目前，國內外提取植物游離氨基酸主要采用加熱回流法[21]、超臨界流體萃取法[22]、超聲波提取法[23]、微波提取法[24]等。超聲波提取是一種物理方法，通過超聲過程中產生的空化作用和熱效應，使植物細胞壁破裂，有效成分溶出，達到在較短的提取時間內，提高提取效率的作用[25-26]，較其他方法有時間短、無需加熱、操作簡便等優點[27]。因此，本實驗利用超聲法對橄欖果實游離氨基酸進行提取，并通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗及最陡爬坡試驗與響應面法相結合，尋找超聲法提取橄欖果實游離氨基酸的最佳工藝，為進一步研究橄欖果實游離氨基酸提供理論依據和實際指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘長營’橄欖果實于2015年11月17日采自福建省閩侯縣城關農場；亮氨酸標準品、十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O）、茚三酮（苯駢戊三酮）、無水乙醇均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LGJ-25C型冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司；FW177型中草藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-300DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Allegra 64R型臺式高速冷凍離心機 貝克曼庫爾特（美國）有限公司；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設備有限公司；WinLab V6型紫外-可見分光光度計 鉑金埃爾默儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 橄欖果實粉末的制備

將新鮮采下的橄欖置于4 ℃保溫箱中帶回實驗室，立即用雙蒸水洗凈、晾干、取果肉，凍干并粉碎至過40目篩后保存于-40 ℃冰箱中備用。

1.3.2 橄欖果實游離氨基酸溶液的制備

參照朱玉婷[28]的方法稍作改進進行實驗設計。

準確稱取橄欖果實粉末0.5 g于50 mL離心管中，按料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 （g/mL））加入一定體積分數（30%、40%、50%、60%、70%）乙醇溶液，在一定超聲功率（180、210、240、270、300 W）、超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）、超聲時間（10、15、20、25、30 min）提取（1、2、3、4次），之后常溫10 000 r/min離心10 min，吸取一定量上清液（視具體情況而定）于20 mL具塞試管中，用蒸餾水稀釋至刻度，作為橄欖果實游離氨基酸溶液。

1.3.3 亮氨酸溶液標準曲線的繪制

根據前期預實驗結果進行標準曲線的制作。配制0.2 mg/mL亮氨酸標準品溶液，分別吸取0.2 mg/mL亮氨酸標準品1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25 mL和3.5 mL，并用蒸餾水分別補足至4.0 mL。吸取上述各溶液2.0 mL于20 mL具塞試管中，加入pH 6.6磷酸緩沖液0.5 mL和2 g/mL茚三酮溶液0.5 mL，搖勻，于100 ℃恒溫水浴鍋中加熱25 min，冷卻，蒸餾水定容至刻度，在568 nm波長下測定吸光度。以亮氨酸標準品溶液質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，所得回歸方程為：y=10.482x-0.494 7，R2=0.999 6。表明亮氨酸標準品溶液在0.05～0.175 mg/mL質量濃度范圍內線性關系良好。

1.3.4 橄欖果實游離氨基酸提取量的測定

吸取1.3.2節制備的橄欖果實游離氨基酸溶液2.0 mL代替1.3.3節中亮氨酸標準品溶液，并以2.0 mL蒸餾水作為空白對照，按1.3.3節的方法進行實驗，測定吸光度。游離氨基酸提取量的計算公式如下：

式中：c為游離氨基酸質量濃度/（mg/mL）；V為提取液總體積/mL；n為稀釋倍數；m為橄欖粉末質量/g。

1.3.5 超聲法提取橄欖果實游離氨基酸單因素試驗

按1.3.2節制備橄欖果實游離氨基酸溶液，后按1.3.4節進行實驗。每次只改變一個因素，且考察完一個因素，將其最佳條件作為下一個因素的固定條件，直至完成全部單因素試驗，試驗均重復3 次。

1.3.6 Plackett-Burman（PB）試驗設計

PB試驗能在較少的試驗次數下，從多因素試驗中篩選出顯著的影響因素[29-32]。在單因素試驗的基礎上，采用6 個因素和5 個虛擬因素進行n為12的PB設計，以游離氨基酸提取量為響應值，每個因素取高低2 個水平，高水平倍數不超過低水平2 倍，且因素之間間隔分布，試驗設計如表1所示。

表1 PB試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in Plackett-Burman design

1.3.7 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗是在PB試驗的基礎上，對篩選得出的顯著因子進行合理設計，從而獲得最佳工藝區域的方法，并將此結果作為響應面試驗的中心點展開試驗[33]。主要憑借PB試驗中顯著因素的正負效應進行設計合理步長和爬坡方向來達到試驗目的，其他因素的取值結合單因素試驗和PB試驗各因素的正負效應來確定。

1.3.8 響應面試驗設計

根據Box-Behnken試驗設計原理，在PB試驗和最陡爬坡試驗的基礎上，選擇超聲時間（C）、料液比（D）、提取次數（F）3 個因素作為響應面試驗的因素，其余因素條件固定為乙醇體積分數60%、超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W。響應面試驗設計如表2所示。

表2 Box-Behnken設計試驗因素與水平Table 2 Levels and codes of independent variables used for Box-Behnken dessiiggnn

1.4 數據處理

單因素試驗圖表的繪制采用Excel 2003完成，顯著性分析采用SPSS 17.0完成；PB試驗和響應面試驗設計和分析采用Design-Expert 8.05b完成。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲溫度對游離氨基酸提取量的影響

按料液比1∶30（g/mL）加入體積分數50%乙醇溶液，在超聲功率180 W時超聲20 min，提取1 次，由圖1可知，隨著超聲溫度的升高，游離氨基酸提取量先上升后下降，50 ℃時到達提取量最大值50.25 mg/g，且50 ℃與60 ℃之間達到顯著性差異（P＜0.05），60、70 ℃時已降到低值且基本穩定。這可能是由于隨著超聲溫度的增加，原本小分子游離氨基酸的溶出量會增加，但同時也會增加非游離氨基酸物質的溶出如水溶性色素，使提取液的顏色加深[34]，另外超聲溫度對超聲提取的空化效應具有一定影響，當溫度過高時會減少空化效應產生的高壓反而會弱化空化效應[35]，進而影響提取量。因此，超聲溫度應選擇50 ℃。

圖1 超聲溫度對游離氨基酸提取量的影響Fig. 1 Effect of temperatures on the extraction yield of free amino acids

2.1.2 超聲功率對游離氨基酸提取量的影響

圖2 超聲功率對游離氨基酸提取量的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of free amino acids

按料液比1∶30（g/mL）加入體積分數50%乙醇溶液，在超聲溫度50 ℃時超聲20 min提取1 次，由圖2可知，隨著超聲功率的增加，游離氨基酸提取量不斷增加，在270 W時達到最大值50.84 mg/g，繼續加大超聲功率至300 W，提取量下降且與270 W時達到顯著差異（P＜0.05），這可能是由于隨著超聲功率的增加，使超聲處理的熱效應和空化作用增強，有利于粉末中游離氨基酸溶出，但繼續增大超聲功率至300 W，有利于提高提取液的流速，造成粉末在超聲場中停留時間減少，導致破壁作用的減弱[36]，另外超聲功率增大至空化效應飽和后，繼續增大只會加強超聲波的散射和衰減，不利空化[35]，造成提取量下降，因此，選擇超聲功率為270 W。

2.1.3 超聲時間對游離氨基酸提取量的影響

按料液比1∶30（g/mL）加入體積分數50%乙醇溶液，固定超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、超聲提取1 次，由圖3可知，隨著超聲時間的延長，游離氨基酸的提取量先升高后稍微下降，在20 min時達到最大值，且20 min與15 min之間達到顯著差異（P＜0.05），而20 min與25 min差異不顯著（P＞0.05），表明超聲時間20 min時，橄欖粉末中的游離氨基酸已基本被提取出來，再繼續效果不明顯，且20 min與30 min時達到顯著差異（P＜0.05），表明繼續超聲，游離氨基酸的提取量反而顯著下降，可能是由于超聲時間的延長，原本被提取出來的游離氨基酸，特別是芳香族氨基酸，被空化效應產生的自由基所氧化[37]，從而影響提取效果，因此，超聲時間應選擇20 min為宜。

圖3 超聲時間對游離氨基酸提取量的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic irradiation time on the extraction yield of free amino acids

2.1.4 料液比對游離氨基酸提取量的影響

圖4 料液比對游離氨基酸提取量的影響Fig. 4 Effect of liquid/solid ratio on the extraction yield of free amino acids

用體積分數50%乙醇溶液提取橄欖粉末，固定超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、超聲20 min、提取1 次，由圖4可知，游離氨基酸提取量隨著溶劑用量的增加而增大，在1∶40（g/mL）時達到最大值，但料液比1∶30、1∶40和1∶50之間提取量沒有顯著差異（P＞0.05）。這可能是由于溶劑用量小時，溶液不足以完全提取粉末中的游離氨基酸，導致提取率低下，繼續增加溶劑用量，有利于游離氨基酸的充分提取，增大提取量，但當游離氨基酸已被基本提取完全時，再增加溶劑用量，對提取量的影響小，且易造成成本的增加，結合經濟角度的考慮，選擇料液比1∶30（g/mL）。

2.1.5 乙醇體積分數對游離氨基酸提取量的影響

固定料液比1∶30（g/mL）、超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、超聲20 min、提取1 次，由圖5可知，隨著乙醇體積分數的增大，提取量逐漸增大，到60%時達到最大值62.24 mg/g，隨后降低，且與70%之間達到顯著差異（P＜0.05）。一方面可能是由于溶劑與物質的相似相溶原理，乙醇體積分數與游離氨基酸的極性越接近，越有利于其溶出[38]；另一方面可能是改變乙醇體積分數的同時，其他醇溶性的物質也被隨即溶出，從而導致了提取量降低，綜合考慮，選擇體積分數60%乙醇溶液。

圖5 乙醇體積分數對游離氨基酸提取量的影響Fig. 5 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of free amino acids

2.1.6 提取次數對游離氨基酸提取量的影響

圖6 提取次數對游離氨基酸提取量的影響Fig. 6 Effect of number of extraction cycles on the extraction yield of free amino acids

按料液比1∶30（g/mL）加入體積分數60%乙醇溶液，超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、超聲20 min，由圖6可知，隨著提取次數的增加，游離氨基酸的提取量不斷增大，在提取3 次時基本達到穩定，提取3 次與4 次無顯著性差異（P＞0.05）。這是由于提取1、2 次時，還未將粉末中的游離氨基酸提取完全，提取3 次已基本將粉末中的游離氨基酸提取完全，再增加提取次數對增加游離氨基酸含量影響小，且造成成本的提高和工時的拖長，因此，選擇提取3 次最佳。

2.2 PB試驗設計及結果

利用Design-Expert 8.05b進行PB試驗的設計以及結果的分析，PB試驗設計與結果如表3所示。從表4可知，PB試驗的模型P值為0.003 4，小于0.01，達到極顯著水平，表明模型具有統計學意義。從各個因素的P值可知，各因素對游離氨基酸提取量的影響水平為料液比＞提取次數＞超聲時間＞超聲功率＞乙醇體積分數＞超聲溫度，其中料液比和提取次數達到極顯著水平（P＜0.01），且從參數估計值可知此2 個因素對提取量呈正效應影響，其他因素均不顯著（P＞0.05）并均為負效應影響，但考慮若選擇中心組合試驗設計，則需對提取次數進行1.414倍水平處理[39]，不符合實際操作的可行性；選擇Box-Behnken試驗設計時至少需要3 個因素[29]，因此，結合各因素影響水平的排名情況選擇料液比、提取次數和超聲時間3 個因素進行最陡爬坡試驗。

表3 PB試驗設計與結果Table 3 Plackett-Burman design with experimental results

表4 PB試驗設計效應分析Table 4 Statistical analysis of Plackett-Burman design

2.3 最陡爬坡試驗結果

表5 最陡爬坡試驗設計與結果Table 5 Experimental design and results of steepest ascent path

由PB試驗可知，料液比和提取次數為正效應，超聲時間為負效應，則適當的提高料液比和提取次數，減小超聲時間有利于提高提取率，但考慮到隨著提取次數的增加，游離氨基酸提取量也將增加，其提取量的顯著增加易掩蓋其他因素對提取量造成的影響，因此固定提取次數為1次，另外2個因素由其正負效應，確定爬坡方向和合理的步長，同時改變因素水平，達到快速逼近最佳區域的目的。由表5可知最佳的組合為試驗組2，因此以試驗組2條件為Box-Behnken試驗設計的中心值。

2.4 響應面試驗結果

2.4.1 Box-Behnken試驗設計結果及方差分析

表6 Box-Behnken試驗設計及結果Table 6 Box-Behnken design with experimental results

表7 響應面試驗方差分析Table 7 Analysis of variance of response surface regression model

在PB試驗與最陡爬坡試驗的基礎上，利用Design-Expert 8.05b軟件進行Box-Behnken試驗設計，并得到結果如表6所示，同時進行方差分析如表7所示。對試驗結果進行多元回歸擬合，得到回歸方程：游離氨基酸提取量/（mg/g）=77.02-0.59C+2.10D+3.85F-1.00CD+0.88CF+0.057DF-7.56C2-6.21D2-5.86F2。從表7可知，模型P值小于0.000 1，達到極顯著（P＜0.01）水平，失擬項P為0.666 0，大于0.05，不顯著，表明模型對本試驗的擬合度良好，R2=0.977 5，表明模型擬合度良好，R2Adj=0.948 5，表明該模型能解釋94.85%響應值的變化，則用該模型能代替真實試驗點對超聲法提取橄欖果實游離氨基酸提取量的分析和預測。從表7中各因素的P值可知，回歸模型中D、F、C2、D2和F2極顯著（P＜0.01），而一次項C、交互項CD、CF、DF均不顯著（P＞0.05），表明各因素對游離氨基酸提取量的影響不同，調整不同因素將達到不同提取效果。

2.4.2 響應面分析

圖7 各因素交互作用對游離氨基酸提取量影響的響應面與等高線圖Fig. 7 Contour plots and response surface showing the interactive effects of various factors on the extraction yield of free amino acids

通過Design-Expert 8.05b軟件對響應面試驗結果進行分析，得到了各因素交互作用對游離氨基酸提取量影響的等高線圖和響應面圖，可以更加直觀看出各因素之間交互作用的影響。從圖7可以看出，兩兩因素交互作用的響應面圖都較平緩，等高線圖的橢圓形狀都較明顯，表明各因素之間交互作用不顯著[40-42]，與上述顯著性結果一致；圖7顯示隨著超聲時間、料液比和提取次數水平的增加，游離氨基酸提取量表現出先增加后下降的趨勢，均能找到其最佳值。

2.4.3 最佳工藝的確定與驗證實驗

通過Design-Expert 8.05b軟件分析得出超聲法提取橄欖果實游離氨基酸的最佳工藝條件：超聲時間19.84 min、料液比1∶40.87（g/mL）、提取次數3.33、超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、乙醇體積分數60%。在此條件下，預測的游離氨基酸提取量為77.84 mg/g。考慮到實際操作的可能性，將條件定為超聲時間20 min、料液比1∶41（g/mL）、提取次數3、超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、乙醇體積分數60%，平行實驗3 次，得到的游離氨基酸提取量為79.88 mg/g，與預測值的相對誤差為2.62%，與中心點存在顯著性差異（P=0.037＜0.05），表明通過響應面試驗優化超聲法提取橄欖果實游離氨基酸的提取工藝是可行的，具有實際意義。

3 討論與結論

保存植物組織的方法有許多種，如超低溫保存[43]、低溫保存[44]、干燥保存[45]等。不同保存方法對植物體內各物質的含量和變化趨勢有一定的影響。王子飛等[46]通過比較不同保存方法對植物葉片色素降解的影響，發現短期保存中以液氮保存最佳，硅膠干燥法次之。何嘉琦等[47]探討不同保存方法對秋石斛葉片抗寒生理指標的影響，發現不同指標影響不同，其中脯氨酸在-20 ℃保存2 d時與鮮葉最為接近。楊琴等[48]通過4 種保存方法保存牡丹花瓣，發現通過干燥箱后密封避光保存對花瓣中的色素影響最小。本實驗橄欖粉末的保存方法為干燥低溫保存，所測得的橄欖果實游離氨基酸含量可能與鮮樣或其他保存方法測定的含量存在一定差異。

采用超聲法提取植物中游離氨基酸，提取劑不同，提取量也存在一定的差異。Arnáiz等[22]采用超聲法比較水和體積分數70%甲醇溶液2 種提取劑對花椰菜葉片中游離氨基酸提取效果的影響，表現出在個別氨基酸和氨基酸總量上存在差異。吳月娜[49]通過超聲法比較水、體積分數75%乙醇溶液和體積分數50%乙醇溶液作為提取劑對青天葵藥材游離氨基酸提取效果的影響，發現水作為提取劑，其游離氨基酸的浸出量大，但其純度相對低于75%乙醇溶液和50%乙醇溶液。馬戎等[50]等采用超聲法提取煙草中游離氨基酸后用液相色譜串聯質譜法測定出20 種游離氨基酸，通過比較體積分數0.1%鹽酸和體積分數80%乙醇溶液提取劑的提取效果，發現除個別氨基酸外，鹽酸超聲提取的氨基酸含量高于乙醇、變異系數小于乙醇。綜上可知不同的提取劑對超聲法提取游離氨基酸含量的方法具有不同的效果，本實驗以乙醇溶液作為提取劑，比較了體積分數30%、40%、50%、60%和70%乙醇溶液的提取效果，發現60%乙醇溶液提取效果最佳，對橄欖果實游離氨基酸的提取進行初步的探索，為后續研究橄欖果實游離氨基酸的提取提供一定的理論參考。

本實驗采用超聲法提取橄欖果實中的游離氨基酸，考察各因素之間的相互作用對游離氨基酸提取量的影響，并憑借響 應面方法得到最佳組合。首先通過單因素試驗得出各因素的適宜范圍，在單因素試驗基礎上確定PB試驗因 素范圍，篩選出顯著（P＜0.05）影響因素為料液比和提取次數，得出各因素之間對游離氨基酸提取量影響主次順序為料液比＞提取次數＞超聲時間＞超聲功率＞乙醇體積分數＞超聲溫度，結合單因素試驗和PB試驗結果設計最陡爬坡試驗來確定中心組，進而進行響應面試驗，得出超聲法提取橄欖果實游離氨基酸的最優組合為超聲時間20 min、料 液比1∶41（g/mL）、提取次數3、超聲溫度50 ℃、超聲功率270 W、乙醇體積分數60%，游離氨基酸提 取量實際值為79.88 mg/g，與預測值相對誤差為2.62%，表明此模型能為今后橄欖果實游離氨基酸的提取提供一定的理論支持。

[1] 陳月開, 徐軍, 曲運波, 等. 氨基酸的抑菌作用研究[J]. 中國生化藥物雜志, 2001, 22(1)∶ 29-30.

[2] 陸麗虹, 繆長虹, 張荃, 等. 老年胃腸道腫瘤患者術中輸注氨基酸對術后肝腎功能的影響[J]. 中國癌癥雜志, 2015, 25(8)∶ 614-618.DOI∶10.3969/j.issn.1007-3969.2015.08.009.

[3] 李俊明, 賀強, 袁超, 等. 蘇氨酸的營養生理功能及其在畜禽日糧中的應用[J]. 中國飼料, 201 4(11)∶ 35-38. DOI∶10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.2014.11.009.

[4] 王齊, 朱偉偉, 蘇丹, 等. 蒲桃中氨基酸組成與含量對其營養與風味的影響[J]. 食品科學, 2012, 33(16)∶ 204-207.

[5] 魯敏, 安華明, 趙小紅. 無籽刺梨與刺梨果實中氨基酸分析[J]. 食品科學, 2015, 36(14)∶ 118-121. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-2015140023.

[6] PRIPIS-NICOLAU L, DE R G, BERTRA ND A, et al. Formation of flavor components by the r eaction of amino Acid and carbonyl Compounds in mild conditi ons[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 4 8(9)∶ 3761-3766. DOI∶10.1021/jf991024w.

[7] CHEN G, LI J, SUN Z, et al. Rapid and sensitive ultrasonic-assisted derivatisation microextraction (UDME) technique for bi tter taste-free amino acids (FAA) study by HPLC-FLD[J]. Food Chemistry, 2014,143∶ 97-105. DOI∶10.1016/j.fo odchem.2013.07.099.

[8] 黃翠芳. 影響雞肉中游離氨基酸和肽類因素的研究[D]. 長沙∶ 湖南農業大學, 2006∶ 1-2.

[9] SILVA B M, CAS AL S, ANDRADE P B, et al. Free amino acid composition of quince (cydonia oblonga miller) fruit (pulp and peel)and jam[J]. Agricultural and Food Science, 2004, 52(5)∶ 1201-1206.DOI∶10.1021/jf030564x.

[10] LEE M, SMITH G M, EITEMAN M A, et al. Aerobic production of alanine by Escherichia coli aceF ldhA mutants expressing the Bacillus sphaericus alad gene[J]. Applide Microbiology and Biotechnology,2004, 65(1)∶ 56-60. DOI∶10.1007/s00253-004-1560-3.

[11] 林聰. 閩江流域橄欖(Canavium album Raeusch.)生產與產業化對策研究[D]. 福州∶ 福建農林大學, 2011∶ 1-5.

[12] 林玉芳. 福建橄欖(Canarium album (Lour.) Raeusch.)若干功能成分和品質相關指標的研究[D]. 福州∶ 福建農林大學, 2012∶ 1-4.

[13] 謝倩. 橄欖(Canarium album (Lour.) Rae usch.)果實發育成熟過程多酚及相關酶活性研究[D]. 福州∶ 福建農林大學, 201 4∶ 1-7.

[14] 彭勃, 苗明三, 王穎芳, 等. 橄欖解酒飲對大鼠急性酒精性肝損傷肝組織病理形態的影響[J]. 中國醫藥學報, 2004, 19(8)∶ 468-470.

[15] 楊月欣, 王光亞, 潘興昌. 中國食物成分表2002[Z]. 北京∶ 北京大學醫學出版社, 2002∶ 82-97.

[16] WHO, FAO. Report of FAO Nutritional Meeting Series No 52∶ Energy and protein requirements[J]. Rome, 1973∶ 40-73.

[17] 葉發榮, 韓秀梅, 肖鈞, 等. ‘紅陽’獼猴桃果實氨基酸含量及組成分析[J]. 中國園藝文摘, 2015, 28(5)∶ 1-3.

[18] 萬繼鋒, 吳如健, 韋曉霞, 等. 橄欖果實中糖和氨基酸組成與含量分析[J]. 福建農業學報, 2013, 28(5)∶ 472-477.

[19] 謝曉瓊. 橄欖(Canarium album (Lour.) Raeusch.)果實若干生理生化指標的研究[D]. 福州∶ 福建農林大學, 2007∶ 25-28.

[20] 何志勇. 橄欖酚類化合物的分離純化和結構研究[D]. 無錫∶ 江南大學, 2007∶ 22.

[21] 王加黨, 李艷玲, 賀永梅, 等. 影響美洲大蠊藥材中游離氨基酸測定的因素研究[J]. 大理學院學報, 2011, 10( 12)∶ 12-15.

[22] ARNáIZ E, BERNAL J, MARTíN M T, et al. Supercritical fluid extraction o f free amino acids from broccoli leaves[J].Journal of Chrom atography A, 2012, 1250∶ 49-53. DOI∶10.1016/j.chroma.2012.04.066.

[23] 郭俊國, 解孝鋒, 畢宏生. PITC柱前衍生HPLC法測定茺蔚子中游離和水解氨基酸的含量[J]. 中華中醫藥雜志, 2015, 30(1)∶ 91-94.

[24] 王雅玲, 代玲玲, 馬堃, 等. HPLC-ELSD法測定蛹蟲草中6 種游離氨基酸的 含量[J]. 分析測試學報, 2010, 29(10)∶ 1091-1094.DOI∶10.3969/j.iss n.1004-4957.2010.10.020.

[25] PRAKASH M J, MANIKANDAN S, THIRUGNANASAMBANDH AM K, et al. Box-Behnken design based statistical modeling for ultrasou ndassisted e xtraction of corn silk polysaccharide[J]. Carbohydrate Polym ers,2013, 92(1)∶ 604-611. DOI∶10.101 6/j.carbpol.20 12.09.020.

[26] WANG J M, GENG Y, HU F, et al. Optimization of ultrasoundassisted extraction procedure to determine total isofl avones in Chinese soybean cheese by Box-Beh nken design[J]. Food Analytical Methods,2013, 6( 1)∶ 221-226. DOI∶10.1007/s12161-012-9434-2.

[27] ADAMI R, OSSEO L S, REVERCH ON E. Micronization of lysozyme by supercritical assisted atomization[J]. Bio technology and Bioengineering, 2009, 104(6)∶ 116 2-1170. DOI∶10.1002/bit.22470.

[28] 朱玉婷. 鹿藥游離氨基酸的提取及在化妝品中的應用[D]. 長春∶吉林農業大學, 2014∶ 15-23.

[29] 黃新仁. 響應面法在生物過程優化中的應用[D]. 長沙∶ 湖南大學,2011∶ 1-6.

[30] El-SHEEKH M M, KHAIRY H M, GHEDA S F, et al. Application of Plackett-Burman design for the high production of some valuable metabolites in marine alga Nannochloropsis oculata[J]. The Egyptian Journal of Aquatic Research, 2016, 42(1)∶ 57-64. DOI∶10.1016/j.ejar.2015.10.001.

[31] JABEEN H, IQBAL S, ANWAR S, et al. Optimization of profenofos degradation by a novel bacterial consortium PBAC using response surface methodology[J]. International B iodeterioration &Biodegradation, 2015, 100∶ 89-97. DOI∶10.1016/j.ibiod.2015.02.022.

[32] LAKSHMIKANDAN M, SIVARAMAN K, ELAIYA R S, et al.Biodegradation of acrylamide by acrylamidase from Stenotrophomonas acidaminiphila MSU12 and analysis of degradation products by MALDI-TOF and HPLC[J]. International Biodeterioration &Biodegradation, 2014, 94∶ 214-221. DOI∶10.1016/j.ibiod.2014.07.014.

[33] JOYCE A P, LEUNG S S. Use of response surface methods and path of steepest ascent to optimize ligand-binding assay sensitivity[J].Journal of Immunological Methods, 2013, 392(1/2)∶ 12-23.DOI∶10.1016/j.jim.2013.02.019.

[34] 趙蓓, 王承明, 張沙沙. 菜籽粕中 清蛋白的超聲輔助提取及氨基酸組成研究[J]. 中國糧油學報, 2015, 30(10)∶ 32-36.

[35] 王涓, 潘忠禮, 馬海樂, 等. 超聲波的空化作用及其對多酚穩定性的影響[J]. 食品工業科技, 2014, 35(19)∶ 388-391. DOI∶10.13386/j.issn1002-0306.2014.19.076.

[36] 范三紅, 原超, 劉艷榮, 等. 超聲波輔助提取南瓜籽油及其脂肪酸組成研究[J]. 食品科學, 2010, 31(24)∶ 107-110. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201024022.

[37] 郭志峰, 馬瑞欣, 李國俊, 等. 氣質聯用測定超聲波降解廢水中的苯酚含量及機理研究[J]. 河北大學學報(自然科學版), 2005, 25(3)∶290-294.

[38] CHEVAUX K A, JACKSON L, ELENA V M, et al. Proximate,mineral and procyanidin content of certain foods and be verages consumed by the Kuna Amerinds of Panama[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2001, 14(6)∶ 553-563. DOI∶10.1006/jfca.2001.1027.

[39] 張楨, 楊賢慶, 馬海霞. Plackett-Burman法和中心組合法優化羅非魚下腳料酶解工藝[J]. 食品科學, 2011, 32(18)∶ 1-5.

[40] 李佳橋, 余修亮, 曾林暉, 等. 響應面試驗優 化超聲波輔助提取蓮房原花青素工藝[J]. 食品科學, 2016, 37(12)∶ 40-45. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201612007.

[41] 張爽, 任亞梅, 劉春利, 等. 響應面試驗優化蘋果渣總三萜超聲提取工藝[J]. 食品科學, 2015, 36(16)∶ 44-50.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201516008.

[42] 曲昊楊, 朱文學, 劉琛, 等. 蘋果渣果膠提取工藝優化及堿法降酯效果評價[J]. 食品科學, 2014, 35(14)∶ 87-92.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201414017.

[43] 常維霞, 姚小華, 龍偉. 山茶屬3 種植物花藥超低溫保存研究[J].中國油料作物學報, 2016, 38(1)∶ 52-57.

[44] 段乃彬, 李群, 田茜, 等. 低溫保存對4 種作物種子ATP含量與種子活力的影響[J]. 山東農業科學, 2016, 48(2)∶ 112-114.

[45] WANG L, SHIRAISHI A, HASHIMOTO F, et al. Analysis of petal anthocyanins to investigate fl ower coloration of Zhongyuan (Chinese)and Daikon island (Japanese) tree peony cultivars[J]. Journal of Plant Research, 2001, 114(1)∶ 33-43.

[46] 王子飛, 熊源新, 羅睿. 不同植物葉片保存方法對色素降解的影響[J].貴州科學, 2013, 31(2)∶ 65-68.

[47] 何嘉琦, 張東雪, 尹俊梅, 等. 不同保存方法對秋石斛葉片抗寒生理指標的影響[J]. 黑龍江農業科學, 2016(9)∶ 72-75. DOI∶10.11942/j.issn1002-2767.2016.09.0072.

[48] 楊琴, 袁濤, 孫湘濱. 不同保存方法對牡丹花瓣中花青素和黃酮含量的影響[J]. 食品工業科技, 2015, 36(17)∶ 90-95. DOI∶10.13386/j.issn1002-0306.2015.17.010.

[49] 吳月娜. 青天葵中總氨基酸的提取純化工藝及指紋圖譜研究[D].廣州∶ 廣州中醫藥大學, 2011∶ 30-31.

[50] 馬戎, 鮑峰偉, 馮文寧, 等. 液相色譜串聯質譜法測定煙草中的游離氨基酸[J]. 中國測試, 2013, 39(2)∶ 34-37.

Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Free Amino Acids from the Flesh of Canarium album Fruits by Response Surface Methodology

PENG Zhenfen, XIE Qian, CHI Yubin, CHEN Qingxi*
(College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)

This study aimed to obtain the optimum conditions for the extraction of free amino acids from the flesh of Canarium album fruits by the combined use of one-factor-at-a-time method, Plackett-Burman design, steepest ascent design and response surface methodology. The results showed that the effects of factors on the extraction yield of free amino acids were in the descending order of solid-to-liquid ratio ＞ number of extraction cycles ＞ ultrasonication time ＞ ultrasonic power ＞ethanol concentration ＞ temperature, and the optimum levels of these variables were determined to be 20 min, 1∶41 (g/mL),3, 50 ℃, 270 W and 60%, respectively. Under these conditions, the predicted extraction yield of free amino acids was 77.84 mg/g while the actual value was 79.88 mg/g. The relative error was 2.62%, indicating that the optimized extraction method was reliable.

Canarium album; free amino acids; ultrasonic-assisted extraction; response surface methodology; Plackett-Burman design; Box-Behnken design

S667.5

A

1002-6630（2017）20-0146-08

彭真汾, 謝倩, 池毓斌, 等. 響應面試驗優化超聲法提取橄欖果實游離氨基酸工藝[J]. 食品科學, 2017, 38(20)∶ 146-153.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720021. http∶//www.spkx.net.cn

PENG Zhenfen, XIE Qian, CHI Yubin, et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of free amino acids from the fl esh of Canarium album fruits by response surface methodology[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 146-153. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720021. http∶//www.spkx.net.cn

2016-12-29

“十一五”國家科技支撐計劃項目（20 07BAD07B01）；福建省自然科學基金項目（2012D085）；

福州市科技計劃項目（2009-N-55）；福建省重大科技專項（2013NZ0002-4）

彭真汾（1992—），女，碩士研究生，主要從事果樹生理與生態研究。E-mail：390689340@qq.com

*通信作者：陳清西（1964—），男，教授，博士，主要從事園藝植物栽培與生理研究。E-mail：cqx0246@fafu.edu.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720021