微波輔助分步酶解紫蘇餅粕蛋白制備鮮味肽

李 榮，于 君，姜子濤*，黃 賢勇

微波輔助分步酶解紫蘇餅粕蛋白制備鮮味肽

李 榮，于 君，姜子濤*，黃 賢勇

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

在微波輔助的條件下，利用堿性蛋白酶和風味蛋白酶分步對紫蘇餅粕蛋白進行水解，應用正交試驗確定了最佳的酶解條件。通過Sephadex G-15凝膠層析、反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法和電子舌技術對酶解液成分與鮮味的變化進行了表征。結果表明，在微波功率400 W條件下，第1步堿性蛋白酶最佳酶解條件為酶添加量1 600 U/g、pH 10.0、 微波溫度60 ℃、微波時間35 min；第2步風味蛋白酶的最佳酶解條件為酶添加量1 600 U/g、pH 6.5、微波溫度65 ℃、微波時間40 min，分步酶解最終水解度為44.86%。最后通過凝膠層析、RP-HPLC與電子舌表征，證明微波輔助分步酶解法快速、高效，且與單獨酶解所得產物相比，其產物鮮味改善明顯。

分步酶解；微波；凝膠層析；RP-HPLC；電子舌；鮮味肽

肽作為蛋白質的水解產物，不僅具有與蛋白質幾乎一致的氨基酸組成，而且更容易被人體消化吸收，同時還具有良好的加工特性、營養功能和生理活性，在食品的呈味中具有重要作用。鮮味肽亦稱為風味提升肽，是一類補充或增強食品原有風味的呈味肽類物質。鮮味肽具有增強鮮味或產生鮮味的作用[1]，且不影響食品的其他味覺（酸、甜、苦、咸），因此在各種蔬菜、肉類、乳類、水產類乃至酒類增味方面都有良好的效果[2]。蛋白經酶水解得到的水解產物是由多種肽類化合物（或氨基酸）構成的混合物，利用凝膠體積 排阻色譜的原理，可以將待分離的混合肽溶液按相對分子質量大小篩分開[3-5]。由于肽的滋味主要與肽鏈長度、氨基酸的組成與順序有關[6-7]，因此利用凝膠色譜層析不僅能夠表征酶解前后分子質量大小的變化，還能夠分離純化混合肽，如Su Guowan等[8]將花生蛋白水解后產生的肽通過凝膠層析后，使用反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法與基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜鑒定出一個鮮味肽和一個鮮味增強肽。Zhang Meixiu等[9]從河豚魚（暗紋東方鲀）的肉中提取了風味肽。Toelstede等[10]發現含有谷氨酸片段的呈味肽成分使豪達奶酪的口味更具有奶酪的濃厚感。Aristoy等[11]的研究表明，一些小分子肽具有一 定的鮮味。

紫蘇餅粕是紫蘇榨油后的副產品，其富含蛋白質，且氣味芳香，適口性好，其中鮮味氨基酸在紫蘇蛋白的組成中含量較高[12]，是制備鮮味肽的優質蛋白質資源。目前對于紫蘇肽的研究，僅見有單酶水解[13]和制備高F值低聚肽方面的報道[14]，而對于應用微波輔助進行分步酶解制備紫蘇鮮味肽，進而分離純化的研究鮮見報道。本研究以紫蘇餅粕蛋白作為底物，采用堿性蛋白酶與風味蛋白酶的分步酶解，利用微波輔助技術代替常規水浴加熱，大大地縮短了蛋白質的酶解時間，提高了酶解效率[15-16]。應用凝膠層析、RP-HPLC表征酶解成分的變化，且為進一步驗證分步酶解對制備紫蘇鮮味肽的積極作用，利用電子舌技術對制備出的紫蘇肽呈鮮味的效果進行對比，以期為肽類在食品調味料的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇餅粕 天津東方雷格工貿有限公司；紫蘇餅粕蛋白（純度為質量分數91.74%） 本實驗室自制[17]；堿性蛋白酶、風味蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；Sephadex G-15 美國Pharmacia公司；甲醛溶液 天津贏達稀貴化學試劑廠；乙腈（色譜純） 天津市科密歐化學試劑有限公司；純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 儀器與設備

Multi SYNTH微波合成儀 意大利Milestone公司；ASTREE電子舌 法國Alpha MOS公司；1100系列高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；Vydac-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美國Grace公司；80-1離心機 上海醫療設備（集團）有限公司手術器械廠；LGJ-10型冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；HD-5型核酸蛋白檢測儀 南京大學普陽科學儀器研究所；FA1104N型電子天平 上海精密儀器有限公司；RE52-86A型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 分步酶解工藝流程

將紫蘇餅粕蛋白溶于水中制成質量濃度3g/100 mL的溶液，加入適量的NaOH調節至溶液的pH值為10，之后加入1 600 U/g的堿性蛋白酶，在70 ℃、微波400 W的條件下進行酶水解25 min。滅酶后利用HCl調節水解液的pH值為6.5，然后再加入1 200 U/g的風味蛋白酶，在65 ℃、微波400 W的條件下繼續進行酶水解30 min，滅酶后將水解混合物迅速冷卻，經冷凍干燥后即可得到混合紫蘇肽的材料。

1.3.2 酶活性的測定

參照GB/T 23527—2009 《蛋白酶制劑》方法測定。

1.3.3 堿性蛋白酶水解度測定

按照pH-stat法測定堿性蛋白酶的水解度[18]，見公式（1）。由于在酶解過程中pH值迅速下降，使酶活力降低，所以應每隔5 min加入已標定的0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值至實驗值。

式（1）中：V為NaOH溶液的體積/mL；c為NaOH溶液的濃度/（mol/L）；α為α-氨基的離解常數；mp為底物中蛋白質的質量/g；htot為每克原料蛋白中肽鍵的毫摩爾數/（mmol/g），本實驗取7.219。

1.3.4 風味蛋白酶水解度測定

采用甲醛滴定法測定風味蛋白酶水解度[19-20]。由于風味蛋白酶的最適pH值介于中性與弱酸性之間；而在酸性環境下，肽鍵斷裂時產生的—NH3上的質子無法游離出來，不可用pH-stat法測定水解度，因此本研究采用甲醛滴定法測定蛋白的水解度，計算如式（2）所示：

式（2）中：c為NaOH溶液的濃度/（mol/L）；V1為滴定樣品時所消耗的NaOH溶液體積/mL；V2為空白試驗時所消耗NaOH溶液體積/mL；htot為每克原料蛋白中肽鍵的毫摩爾數/（mmol/g），本實驗取7.219；V為所取水解液的體積/mL；m為未水解時蛋白質的質量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 酶解條件的確定

以水解度為指標，對酶添加量、pH值、溫度、微波時間、微波功率在合適的范圍值內進行單因素試驗，在單因素試驗的基礎上選擇L9（34）表進行正交試驗。堿性蛋白酶和風味蛋白酶酶解條件正交試驗因素及水平見表1和表2。

表1 堿性蛋白酶酶解條件L9（34）正交試驗因素與水平設計Table 1 Factors and their coded and actual levels used in L9(34))orthogonal array design for the optimization of alcalase hydrolysis

表2 風味蛋白酶酶解條件L9（34）正交試驗因素與水平設計Table 2 Factors and their coded and actual levels used in L9(34))orthogonal array design for the optimization of fl avourzyme hydrolysis

1.3.6 Sephadex G-15柱層析分離純化

將活化后的Sephadex G-15裝柱（1.2 cm×60 cm），經藍色葡聚糖基準物測定，空水體積為26.2 mL。水解液樣品用超純水配制為質量濃度20 mg/mL的溶液，上樣量為1 mL。以超純水作為洗脫液，流速為0.5 mL/min，檢測器波長為220 nm，收集各洗脫峰組分。

1.3.7 RP-HPLC分析條件

流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫條件：0～5 min，體積分數3% A；5～10 min，體積分數5% A；10～15 min，體積分數7% A；15～25 min，體積分數40% A。進樣量5 μL；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測器波長220 nm。

1.3.8 電子舌滋味測定

將堿性蛋白酶單酶水解液、風味蛋白酶單酶水解液、分步酶解水解液經冷凍干燥后，分別取0.50 g，溶解在100 mL去離子水中，完全溶解后過濾。取25 mL溶解后的樣品于進樣燒杯中，編輯進樣序列。傳感器經預平衡、校準、診斷后測樣。

2 結果與分析

2.1 堿性蛋白酶酶解條件的優化

2.1.1 微波時間、酶添加量、pH值及微波功率對水解度的影響

微波通過高頻變化的電場使分子內部極性分子進行劇烈運動，短時間內即可產生大量的熱，使體系達到酶解反應溫度，因此微波法與傳統的水浴加熱法有著明顯的不同。在紫蘇分離蛋白的底物質量分數為3%的條件下，分別測定了不同微波時間、堿性蛋白酶添加量、pH值及微波功率對紫蘇分離蛋白水解度的影響，結果見圖1。

圖1 微波時間、酶添加量、pH值及微波功率對水解度的影響（堿性蛋白酶）Fig. 1 Effects of microwave irradiation time, enzyme dosage, pH and microwave power on degree of hydrolysis with alcalase

由圖1A可知，微波時間在5～25 min之間時，蛋白 的水解度快速提升，蛋白質底物濃度不斷降低；當微波時間達到25 min以上時，酶水解速率變緩，水解度僅有微弱的上升；可見在微波25 min條件下，紫蘇餅粕分離蛋白的酶水解已基本完全，而繼續延長水解時間是不經濟的。因此，選擇微波時間為25 min。

隨著堿性蛋白酶添加量的增加（圖1B），水解度不斷增大；而1 600 U/g的酶添加量與2 000 U/g的添加量 相比，水解度趨于穩定，僅有微弱幅度增長。這是因為隨著酶添加量的增加，使得蛋白質分子中肽鍵與酶的接觸幾率增加，在一定時間內被水解的肽鍵數不斷增加，但當酶添加量達到一定值后，酶與底 物的接觸幾乎達到飽和，因此 水解度增長的趨勢漸緩。因此，選定堿性蛋白酶的最佳添加量為1 600 U/g。

堿性蛋白酶對溶液的pH值十分敏感，其最適pH值范圍為9～12。由圖1C可知，在微波的作用下，當pH值為10時水解度達到最大值。因此，選定堿性蛋白酶的水解紫蘇蛋白的最適pH值為10。

如圖1D所示，微波功率的大小對紫蘇蛋白的水解度有一定的影響；此外，微波功率的大小直接影響達到水解溫度所用的時間。綜合考慮蛋白的水解度和微波時間，選擇最佳微波功率為400 W。

2.1.2 微波溫度對水解度的影響

溫度對酶促反應速率的影響表現在兩個方面，一方面是當溫度升高時，與一般化學反應一樣，反應 速率加快。另一方面由于酶是蛋白質，隨著溫度升高，使酶蛋白逐漸變性而失活，引起酶反應速率下降。因此酶所表現的最適溫度是這兩種影響的綜合結果。最適溫度隨著酶促作用時間的長短而改變，由于溫度使酶蛋白變性是隨時間累加的。一般來說反應時間長，酶的最適溫度低，反應時間短則最適溫度就高[21-23]。如圖2所示，在微波短時間作用下堿性蛋白酶作用的最適溫度高至70 ℃，隨后在80 ℃時酶活力開始大幅降低，到90 ℃時接近失活，水解度迅速降低，而普通水浴的最適溫度為50～60 ℃左右[6]，從而充分證明了微波輔助酶解能夠極大的縮短酶解時間，提高酶解效率。

圖2 微波溫度對水解度的影響Fig. 2 Effect of temperature on degree of hydrolysis with alcalase

2.1.3 堿性蛋白酶酶解條件的正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，對影響水解度的4 個因素酶添加量、pH值、溫度、微波時間進行L9（34）正交試驗，確定最佳的酶解條件，并進行方差分析。由表3和表4可知，各因素對微波酶解效果影響程度的大小順序為D＞C＞A＞B，最佳工藝條件為A2B2C1D3。即在酶添加量1 600 U/g、微波溫度60 ℃、pH 10.0、微波時間35 min條件下，微波輔助堿性蛋白酶酶解紫蘇餅粕分離蛋白水解度最高為31.79%。

表3 堿性蛋白酶酶解條件優化正交試驗結果Table 3 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of alcalase hydrolysis

表4 堿性蛋白酶酶解條件優化正交試驗方差分析結果Table 4 Analysis of variance for degree of hydrolysis with alcalase as a function of operating parameters

2.2 風味蛋白酶酶解條件的優化

2.2.1 微波時間、酶添加量、pH值及溫度對水解度的影響

利用堿性蛋白酶水解蛋白時，能夠將蛋白中的一些疏水性氨基酸暴露出來，水解產物常常帶有異味或苦味[11]。而外切酶能夠將蛋白質或多肽分子末端的氨基酸肽鍵水解，從而使這些疏水性氨基酸從蛋白或多肽的末端斷掉。利用風味蛋白酶中含有外切酶對水解產物進一步水解，不但可以提高蛋白的水解度，同時還可以降低異味，并通過協同作用增加水解液的風味[24-26]。

按1.3.5節方法進行酶解，固定其他條件，先采用堿性蛋白酶最佳酶解條件酶解后，再加入一定量風味蛋白酶，分別測定在不同微波時間、酶添加量、pH值及溫度下蛋白質的水解度。

圖3 微波時間、酶添加量、pH值及溫度對水解度的影響（風味蛋白酶）Fig. 3 Effects of microwave irradiation time, enzyme dosage, pH and temperature on degree of hydrolysis with fl avourzyme

由圖3可知，在反應時間為10～30 min之間時，水解度不斷上升。當反應時間在30 min以上時，酶解速率減緩，水解度增長微弱，因此從高效節能的角度考慮，選取微波時間為30 min為反應最佳時間。隨著酶添加量的增加，水解度不斷增大，當酶添加量大于1 200 U/g時，酶與底物的接觸幾乎達到飽和，因此可選擇1 200 U/g的酶添加量為最佳條件。水解度受到pH值的影響，呈現先增加后降低的趨勢，因此選擇pH值為6.5為最適條件。在微波短時間作用下，風味蛋白酶的最適溫度為65 ℃，隨后在70 ℃時酶活力大幅下降，水解度迅速降低。

2.2.2 風味蛋白酶酶解條件優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，對影響水解度的4 個因素微波時間、酶添加量、pH值、溫度進行L9（34）正交試驗，確定最佳的酶解條件，并對正交試驗結果做極差分析與方差分析，結果見表5和表6。

由表5和表6可知，各因素對微波酶解效果影響程度的大小順序為B＞C＞A＞D，最佳工藝條件為A3B2C2D3。即在酶添加量1 600 U/g、溫度65 ℃、pH 6.5、微波時間40 min條件下，微波輔助分步酶解紫蘇餅粕分離蛋白水解度為44.86%。

表5 風味蛋白酶酶解條件優化正交試驗設計及結果Table 5 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of fl avorzyme hydrolysis

表6 風味蛋白酶酶解條件優化正交試驗方差分析結果Table 6 Analysis of variance for degree of hydrolysis with fl avorzyme as a function of operating parameters

2.3 紫蘇肽的分離純化與表征

2.3.1 凝膠層析分離酶解液

圖4 堿性蛋白酶與分步酶解水解液的Sephadex G-15凝膠色譜洗脫圖Fig. 4 Elution profi les of hydrolysatses produced by sequential enzymatic hydrolysis and with alcalase alone by Sephadex G-15 gel permeation chromatography

由圖4A可知，單酶酶解結束后的洗脫峰分成5 個組分，分別編號Ⅰ～Ⅴ，洗脫總體積約為90 mL。跟其他組分相比，組分Ⅰ的吸收峰強度最大，為分子質量最大的部分，組分Ⅱ分子質量其次，組分Ⅲ和Ⅳ的保留時間表現出很小的差異，由此可以推斷這兩部分分子質量差異不大，第Ⅴ組分分離效果最好，分子質量為最小。由圖4B可知，分步酶解的水解液洗脫峰主要包含3 個組分，分別編號為Ⅰ’、Ⅱ’和Ⅴ’，洗脫總體積約為120 mL。不同于單酶洗脫圖譜的是，分步酶解中分子質量處于中間位置的洗脫峰Ⅲ和Ⅳ消失，分子質量較小的組分Ⅴ’含量大幅增加，證明了分步酶解將肽分解為更小的肽段，且分離出的3 個組分可進一步鑒定鮮味肽。

2.3.2 RP-HPLC對酶解前后成分變化的表征

圖5 酶解前后成分變化在RP-HPLC中的表征Fig. 5 RP-HPLC chromatograms of hydrolysatses produced by sequential enzymatic hydrolysis and with alcalase alone

如圖5所示，相同樣品濃度下，紫蘇蛋白在保留時間為1.59、2.52、17.59、19.54 min有4 個較強的吸收峰，分別將其標記為1、2、3和4號化合物。經過堿性蛋白酶酶解后，1和4號化合物吸收峰明顯降低，3號化合物吸收峰略有降低，2號化合物吸收峰升高，在風味蛋白酶進行第2步酶解后，2號化合物明顯升高，而1、3和4號化合物較第1步水解后又明顯降低了，說明經過分步酶解，蛋白含量降低，分子質量較小的肽段含量增加，水解程度增大。

這個結果與圖4凝膠色譜表征的酶解效果，即分步酶解水解液相比于堿性蛋白酶水解液的Ⅴ號化合物峰明顯增強相對應。將二者比較可得，第2步酶解中風味蛋白酶將第1步水解液水解為更小的肽段，且效果較為明顯，充分證明了微波輔助分步酶解紫蘇餅粕分離蛋白是快速且有效的。

2.3.3 單酶酶解物與分步酶解物的呈味特性

從圖6可以看出，第1主成分與第2主成分的貢獻率分別為91.611%、8.084%，二者之和達到了99.695%，故能夠代表樣品本身絕大部分的信息并能很好地反映樣品的實際情況。且3 種樣品的主成分分析的識別指數為97，說明3 種樣品在滋味間存在差異，并通過電子舌能夠很好地區分開來。樣品A在右側，與在左側的樣品B、C距離較遠，說明滋味差別比較大。

圖6 單酶酶解物與分步酶解物主成分分析Fig. 6 PCA plots for hydrolysatses produced by sequential enzymatic hydrolysis and with alcalase alone

圖7 單酶酶解物與分步酶解物滋味雷達圖譜Fig. 7 Radar charts showing taste profi les of hydrolysatses produced by sequential enzymatic hydrolysis and with alcalase alone

圖7 為樣品A（風味蛋白酶酶解物）、B（堿性蛋白酶酶解物）、C（分步酶解物）3 種紫蘇肽處理樣品在電子舌第5套傳感器上各種滋味的相對強度，電子舌通過軟件對信號值的分析，能夠在0～12的刻度上比較不同樣品間的各種滋味的相對強度，而圖中給出的數值為相對強度值。從圖7中可以直觀地看出鮮味、咸味與酸味的相對強度大小順序，其余4 根傳感器數值為不同側重的綜合滋味大小。其中鮮味的大小順序為：C＞A＞B，且B的鮮味明顯小于其余二者，證明了第1步堿性蛋白酶酶解達到深度水解目的的同時，產生了較差的風味，通過第2步風 味蛋白酶將氨基或羧基末端的肽鍵剪切下來，明顯改善堿性蛋白酶酶解后的鮮味，且2 種酶合作使用的效果均大于單獨使用時的鮮味，因此證明了利用分步酶解水解紫蘇蛋白制備鮮味肽是可行且有效的。

3 結 論

利用微波輔助分步酶解的方法以紫蘇餅粕蛋白為原料制備紫蘇肽，第1步使用堿性蛋白酶水解時間為35 min，第2步酶解使用風味蛋白酶水解時間為40 min，與文獻[13-14]所報道的水解時間4 h相比，使用微波輔助分步酶解的方法制備紫蘇肽可使水解時間縮短大約3.3 h，且紫蘇蛋白水解度分別為38.75%和34.8%，而本實驗利用微波輔助分步酶解方法水解度達到44.86%。蛋白酶的水解產物具有非常明顯的鮮味，經過凝膠層析對酶水解液中不同分子質量肽段進行分離純化，結合RPHPLC表征，最后應用電子舌測定鮮味大小，優化了紫蘇鮮味肽的最佳工藝條件，證明了微波輔助分步酶解相比于單酶水解是一種快速且有效的方法[27-30]，本研究為獲得高品質、高產率、水解度較高和成本較低的鮮味肽提供了較充分的理論依據。

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Preparation of Umami Peptide by Microwave-Assisted Stepwise Enzymatic Hydrolysis of Perilla Seed Meal Protein

LI Rong, YU Jun, JIANG Zitao*, HUANG Xianyong
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Umami peptide was prepa red by microwave-assisted sequential enzymatic hydrolysis of perilla seed meal prote in with alcalase followed by fl avorzyme. Optimization of the hydrolysis conditions was performed using an orthogonal array design. Sephadex G-15 gel permeation chromatography, reversed phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC)and electronic tongue were applied to characterize the changes in peptide composition and umami taste during the hydrolysis process. The results showed that the optimum conditions for alcalase hydrolysis were as follows∶ microwave power, 400 W;enzyme dosage, 1 600 U/g; pH, 10.0; temperature, 60 ℃; and hydrolysis time, 35 min, and the optimum conditions for fl avorzyme hydrolysis were as follows∶ enzyme dosage, 1 600 U/g; pH, 6.5; temperature, 65 ℃; and hydrolysis time, 40 min.A degree of hydrolysis of 44.86% was obtained under the optimized conditions. Compared with single enzymatic hydrolysis,the microwave-assisted stepwise enzymatic hydrolysis was quicker and more effi cient and show ed improved taste.

step-wise enzymatic hydrolysis; microwave; gel permeation chromatography; RP-HPLC; electronic tongue;umami peptide

TS229

A

1002-6630（2017）20-0169-07

李榮, 于君, 姜子濤, 等. 微波輔助分步酶解紫蘇餅粕蛋白制備鮮味肽[J]. 食品科學, 2017, 38(20)∶ 169-175.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720024. http∶//www.spkx.net.cn

LI Rong, YU Jun, JIANG Zitao, et al. Preparation of umami peptide by microwave-assisted stepwise enzymatic hydrolysis of perilla seed meal protein[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 169-175. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720024. http∶//www.spkx.net.cn

2016-12-02

天津市自然科學基金項目（12JCZDJC34100；13JCYBJC18700）

李榮（1962—），女，教授，學士，研究方向為分析化學與食品分析。E-mail：lirong@tjcu.edu.cn

*通信作者：姜子濤（1956—），男，教授，博士，研究方向為食品添加劑。E-mail：ztjiang@tjcu.edu.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720024