響應面試驗優化亞臨界水提取核桃粕蛋白工藝及其氨基酸分析

汪正興，韓 強，郜海燕,*，陳杭君，房祥軍，穆宏磊

響應面試驗優化亞臨界水提取核桃粕蛋白工藝及其氨基酸分析

汪正興1,2，韓 強1，郜海燕1,*，陳杭君1，房祥軍1，穆宏磊1

（1.浙江省農業科學院食品科學研究所，農業部果品產后處理重點實驗室，浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，中國輕工業果蔬保鮮與加工重點實驗室，浙江 杭州 310021；2.安徽農業大學茶與食品科技學院，安徽 合肥 230036）

本研究以新疆核桃粕為實驗原料，利用亞臨界水輔助提取核桃粕蛋白，分別以提取時間、料液比、提取溫度、pH值為單因素研究對蛋白提取率的影響。通過單因素試驗確定合適的因素水平，以響應面優化分析得到核桃粕蛋白提取的最佳條件。結果表明：核桃粕的最佳提取工藝為pH 9.0、料液比1∶25（g/mL）、提取溫度133 ℃，此條件下的蛋白提取率可達到75.01%。氨基酸的結果分析表明：氨基酸種類齊全，谷氨酸、精氨酸、天冬氨酸3 種含量最高，共占氨基酸總量的59.7%，必需氨基酸占20.03%。亞臨界水提取蛋白的提取率較高，操作方便，適用于核桃粕蛋白提取。

核桃粕；亞臨界水；蛋白提??；響應面；氨基酸分析

核桃（Juglans regia L.）又稱胡桃，羌桃，為胡桃科植物。與扁桃、腰果、榛子并稱為世界著名的“四大干果”[1]。我國是核桃生產和消費 大國，占世界核桃出口總量的45.6%，主產區主要分布在新疆、四川、云南以及西北等地區，其中，新疆由于優越的自然條件，其生產的核桃皮薄、仁多、顆粒大而被人熟知，近年來，由于國家政策的支持，新疆地區種植核桃面積逐漸增大，核桃產量穩步提升，受到國內外消費者的青睞[2]。我國的核桃產品主要集中于生產糧油，炒制以及作為輔料等，相比于發達國家，我國的核桃加工規模小、產品種類少、起步較晚，遠遠落后于發達國家的核桃產品加工業?，F階段，對于核桃的加工利用主要用于核桃油壓榨，得到可食用的核桃油產品，除此之外還有核桃營養粉和乳飲料及一些休閑食品[3]。

核桃油是核桃的主要成分，且是一種高級食用油，在加工的過程會產生附加產物核桃粕，其蛋白含量高達30%左右[4]，核桃粕含有豐富的蛋白質、淀粉、油脂、維生素和礦物質且含有18 種氨基酸，滿足人體需要的8 種氨基酸，其中精氨酸和谷氨酸含量十分豐富[5-6]。但在實際的生產中核桃粕作為飼料或直接遺棄，原料未能充分利用，多種營養物質也隨之流失造成浪費。同時，因其高蛋白含量，直接遺棄對環境也帶來了較大的負面影響，易造成土壤和水資源的富營養化污染。因此，對核桃粕進行精深加工和有效利用具有十分重要的意義。

目前，核桃粕蛋白提取的方法主要有堿溶酸沉法、膜分離法和離子交換法、物理輔助法[7]。堿溶酸沉法工藝簡單，但酸堿消耗過大，成本過高[8]。膜分離法耗能低、操作簡單、無污染，但超濾膜易污染，會影響蛋白性能的改變[9]。離子交換法的優點在于得到的蛋白純度較高，但生產周期長。物理輔助法有超聲波法、微波法以及亞臨界水萃取法等。

亞臨界水萃取法是將水作為提取劑，通過改變壓力，使水的溫度達到100～374 ℃范圍，此時水仍然是液態[10-11]。與常溫水相比有更強的分解能力和溶解有機物的特性，類似于有機溶劑[12-13]。亞臨界萃取技術是新興發展起來的一項變革性技術，亞臨界水相比于其他的輔助方法，其提取時間短、提取效率高、對環境友好等特點[14]。同時亞臨界水提取在核桃粕蛋白提取上鮮有報道，本研究采用亞臨界水提取蛋白，通過工藝條件優化，為核桃粕蛋白提取提供新型方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆核桃粕（油壓冷榨后得到）、牛血清蛋白南京建成生物工程研究所有限公司；氫氧化鈉、鹽酸南通凱瑞化工有限公司；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Cintra 20紫外-可見分光光度計 澳大利亞GBC公司；KQ5200 DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司；LABCONCO低溫冷凍干燥機 上海澤權儀器設備有限公司；CEM MARS6高通量密閉微波消解系統 美國培安科技公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃蛋白提取工藝

參考王豐俊等[15]的方法：選取色澤較好沒有霉爛的大核桃餅粕適量，用中藥粉碎機進行粉碎處理至細末狀后過80目篩，按照比例加入到先前配好的氫氧化鈉溶液中，搖勻，放入到微波消解儀中處理30 min，消解完成后靜置30 min，充分冷卻。將冷卻后的樣品離心后取上清液，按照考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白。

1.3.2 核桃蛋白提取率計算

本實驗中以蛋白提取率為指標[16]，按以下公式計算：

式中：Y為提取率/%；m1為提取液蛋白質量/g；m2為核桃粕蛋白質量/g。

1.3.3 單因素試驗設計

在提取時間30 min、料液比1∶20（g/mL）、pH 9的條件下，考察提取溫度（110、120、130、140、150、160 ℃）對蛋白提取率的影響。

在提取時間30 min、pH 9、提取溫度130 ℃的條件下，考察料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL））對核桃粕蛋白提取率的影響。

在提取時間30 min、料液比1∶20（g/mL）、提取溫度130 ℃的條件下，考察pH值（8、8.5、9、9.5、10.5）對核桃粕蛋白提取率的影響。

在料液比1∶20（g/mL）、提取溫度130 ℃、pH 9的條件下，考察提取時間（10、20、30、40、50、60 min）對核桃粕蛋白提取率的影響。

1.3.4 響應面優化試驗設計

根據單因素試驗結果，固定提取時間30 min不變，以提取溫度、pH值、料液比為試驗因素，并以-1、0、1 為自變量的低、中、高水平，以核桃粕的蛋白提取率為響應值，設計三因素三水平試驗，因素與水平設計見表1。

表1 響應面分析因素及水平Table 1 Coded levels of independent variables used for response surface methodology

1.3.5 游離氨基酸的組成分析

參考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定方法》[17]，使用氨基酸自動分析儀分析氨基酸組成[18]。

1.4 數據統計

每個實驗重復3 次，取平均值。響應面數據采用Design-Expert軟件進行統計分析[19]。其中P＜0.01表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 可溶性蛋白測定標準曲線

采用考馬斯亮藍方法[20]，以蛋白質量濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線得到線性方程：A=0.006 1X+0.007 8 ，標準曲線的相關系數R2為0.999 1，說明牛血清蛋白在0～100 μg/mL范圍內呈現良好的線性關系。

2.2 微波消解提取核桃粕蛋白單因素試驗

2.2.1 提取時間對核桃粕蛋白提取的影響

圖1 提取時間對蛋白提取率的影響Fig. 1 Effect of extraction time on the extraction effi ciency of protein

由圖1可知，隨著提取時間的延長，核桃粕的蛋白提取率逐漸增加，這與王琳等[21]的研究結果相似，提取時間20～30 min，蛋白的提取率顯著提高，隨著時間的延長，蛋白提取率趨于平衡，開始時蛋白沒有完全溶解，提取率較低，當蛋白溶出量達到一定量后只有很少一部分溶解，從節約時間和提取率角度考慮，提取時間控制在30 min較好，因此選30 min為提取蛋白的最佳時間。

2.2.2 pH值對核桃粕蛋白提取率的影響

圖2 pH值對蛋白提取率的影響Fig. 2 Effect of pH on the extraction effi ciency of protein

由圖2可知，核桃粕蛋白提取率隨著pH值的升高，蛋白提取率逐漸增大，當pH值在低范圍內，蛋白的提取效率較低，與范方宇[22]和Yuan Yingjin[23]等研究結果一致。實驗中發現，隨著pH值的升高，蛋白質的顏色會越來越深，當pH值達到9時，蛋白的提取率逐漸下降，可能因為蛋白的基本結構中含有氨基和羧基2 種官能團，不同的pH值環境會影響其存在方式，進而改變溶出效果[24]。因此選擇pH值為8.5、9.0、9.5這3 個水平進行響應面試驗。

2.2.3 料液比對核桃粕蛋白提取率的影響

圖3 料液比對蛋白提取率的影響Fig. 3 Effect of solid-to-solvent ratio on the extraction effi ciency of protein

由圖3可知，隨著溶劑用量的增大，核桃粕的蛋白提取率逐漸增大，與Venkatachalam等[25]研究結果一致，當料液比達到1∶20（g/mL）時，蛋白提取率增大逐漸緩慢，這是由于蛋白的溶解度達到飽和狀態，繼續增加溶劑不再溶解[26]，選取料液比1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）3 個水平進行響應面試驗。

2.2.4 提取溫度對核桃粕蛋白提取率的影響

圖4 提取溫度對蛋白提取率的影響Fig. 4 Effect of temperature on the extraction effi ciency of protein

由圖4可知，隨著提取溫度的升高，核桃粕蛋白提取率隨著溫度的增大而減小，與Wiboonsirikul[27]和Sereewatthanawut[28]等研究結果一致。提取溫度在140 ℃時，蛋白提取率出現最大值。當溫度高于140 ℃以后，蛋白的提取率開始逐漸下降。溫度較高時，水發生了解離現象，轉化為H+和OH-離子，Sereewatthanawut等[28]利用色譜分析也證明了水的解離現象，與此同時，在高溫的條件下蛋白質會發生降解，轉化為多肽和氨基酸等一些小分子物質[28]。所以130 ℃為提取蛋白的較優條件，選取120、130、140 ℃作為響應面試驗的3 個水平。

2.3 響應面優化試驗結果

2.3.1 響應面優化試驗結果與分析

綜合單因素試驗結果，選取提取溫度、料液比、pH值3 個因素，在單因素試驗基礎上采用三因素三水平利用Design-Expert 8.0軟件按照Box-Behnken原理進行響應面設計，根據試驗設計確定的試驗方案對核桃粕蛋白提取進行優化，試驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

2.3.2 回歸方程方差分析

根據相應的試驗表進行分析，得到料液比、pH值、料液比的二次多項回歸方程：Y=76.16+2.19A+1.00B+2.76C-0.62AB-0.84AC-0.035BC-2.62A2-6.21B2-3.81C2。

表3 回歸方差分析Table 3 Analysis of variance for the fi tted regression model

由表3可知，回歸模型極顯著，R2=0.981 2＞0.9，說明模型的相關度很好。模型的失擬項不顯著，表明模型選擇合適，方程的一次項對蛋白提取率的影響均顯著。

2.3.3 響應面交互分析與結果優化

為了進一步研究相關變量之間的作用以及確定最優點，通過Design-Expert軟件繪制響應面圖來進行可視化分析，圖5～7分別顯示3 組以蛋白提取率為響應值的趨勢圖。趨勢圖中等高線直觀地反映兩變量交互作用的顯著程度，橢圓表示兩因素交互作用顯著，而圓形與之相反[25]。響應面的坡度平緩表示兩因素的交互作用不顯著，坡度較陡表示兩因素交互作用顯著。

圖5 料液比和pH值對蛋白提取率影響的響應面及等高線圖Fig. 5 Three-dimensional response and contour plots showing the interactive effects of solid-to-solvent ratio and pH on the extraction effi ciency of protein

由圖5可見，等高線成橢圓形，響應面坡度較陡，說明料液比與pH值之間的交互作用明顯；料液比相同，隨著pH值的增大，蛋白提取率增大，pH值進一步增加，蛋白提取率反而下降，這是由于蛋白質以離子狀態的形式溶解出來，繼續提高pH值會破壞蛋白質的二級結構，造成蛋白提取率降低[29]。實驗中發現，pH值的變化會引起蛋白質溶液顏色的改變，pH值越大其顏色也會越來越深。在pH值一定的條件下，隨著溶劑用量的不斷增加，其蛋白提取率先逐漸增加后增加緩慢，這是由于蛋白質具有一定的溶解度，當蛋白質達到飽和時，其不再溶解。

圖6 料液比和提取溫度對蛋白提取率影響的響應面及等高線圖Fig. 6 Three-dimensional response and contour plots showing the interactive effects of solid-to-solvent ratio and temperature on the extraction effi ciency of protein

由圖6可知，料液比和提取溫度對蛋白提取率的響應面圖，等高線成橢圓形，響應面坡度較陡，說明料液比與提取溫度之間的交互作用明顯。料液比一定時，隨著提取溫度的升高，蛋白提取率先增大后減小，這是由于溫度升高，部分蛋白質的空間結構可能遭到破壞，溶解度降低。當提取溫度一定時，隨著溶劑用量的增大蛋白提取率先逐漸增大后增加緩慢。

圖7 pH值和提取溫度對蛋白提取率影響的響應面及等高線圖Fig. 7 Three-dimensional response and contour plots showing the interactive effects of pH and temperature on the extraction effi ciency of protein

由圖7可見，等高線成橢圓形，響應面坡度較為平緩，說明pH值與提取溫度之間的交互作用不明顯。pH值一定時，隨著提取溫度的升高，蛋白提取率先增加后減少。當提取溫度一定時，pH值增大，蛋白提取率呈現相同的趨勢變化。

綜上所述，蛋白提取率與料液比、pH值、提取溫度有著很強的顯著性，經過軟件分析得到最佳工藝條件為料液比1∶25、pH 9.02、提取溫度132.5 ℃，預測的最大提取率為75.43%。

2.4 驗證實驗結果

為了檢驗模型預測的準確性，采用響應面優化的工藝條件進行核桃粕蛋白提取實驗，考慮實際操作的便利，將工藝條件修正為提取溫度133 ℃、pH 9、料液比1∶25（g/mL），實驗重復3 次，所得的核桃粕蛋白提取率分別為74.89% 、75.23%、74.91%，平均值為75.01%，與預測值75.43%較為接近，說明模型可以很好地預測蛋白提取情況。

2.5 核桃蛋白氨基酸成分分析結果

表4 核桃蛋白氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of walnut protein

如表4所示，檢測到核桃蛋白中共17 種氨基酸，種類較為齊全，未檢測到色氨酸，可能是因為在堿性條件下水解。核桃蛋白包含人體必需氨基酸7 種（色氨酸除外），其占總量的20.03%，蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、賴氨酸、酪氨酸、半胱氨酸含量較少，但是精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸含量較高，分別占氨基酸總量的19.7%、15.2%、24.8%，這與張慶祝等[5]報道的結果相似。高含量的谷氨酸是表征核桃蛋白的一個重要特性，它可以促進機體生物代謝，提高大腦思維活躍水平，可以用于治療神經衰弱和記憶力減退[30]。

3 結 論

在單因素試驗的基礎上，通過三因素三水平響應面試驗對核桃粕中蛋白提取工藝進行優化。結果表明，響應面法優化后的最佳亞臨界水提取工藝為提取溫度133 ℃、料液比1∶25（g/mL）、堿溶pH 9.0，核桃粕蛋白的提取率為75.43%。響應面法優化方法得到各因素對蛋白提取率的影響順序由大到小為提取溫度＞液料比＞pH值。利用響應面分析方法對亞臨界水提取核桃粕蛋白提取工藝條件進行優化，可以獲得最佳的工藝參數，同時，氨基酸的組成分析結果表明，核桃蛋白的氨基酸種類較為齊全，含量合理，必需氨基酸含量較高，同時精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸含量豐富，因此核桃粕中提取的蛋白質可以作為優質的蛋白資源，為進一步的實驗研究提供依據。

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Optimization of Subcritical Water Extraction of Walnut Meal Protein by Response Surface Methodology and Amino Acid Analysis

WANG Zhengxing1,2, HAN Qiang1, GAO Haiyan1,*, CHEN Hangjun1, FANG Xiangjun1, MU Honglei1
(1. Key Laboratory of Postharvest Preservation and Processing of Fruits and Vegetables, China National Light Industry,Key Laboratory of Fruits and Vegetables Postharvest and Processing Technology Research of Zhejiang Province,Key Laboratory of Post-Harvest Handing of Fruits, Ministry of Agriculture, Institute of Food Science, Zhejiang Academy of Agricultural Science,Hangzhou 310021, China; 2. College of Tea and Food Science Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China)

The subcritical water extraction of walnut meal protein was optimized by response surface methodology. The variables optimized were extraction time, solid-to-solvent ratio, extraction temperature and pH. The response was the extraction yield of protein. One-factor-at-a-time method was used to determine the appropriate levels of independent variables for further optimization by response surface methodology. The results showed that the optimal conditions were as follows: pH, 9.0; solid-to-solvent ratio, 1:25 (g/mL); and temperature, 133 ℃. Under these conditions, the extraction yield was up to 75.01%. The results of amino acid analysis indicated that the walnut protein contained almost all kinds of amino acids with glutamic acid, arginine, and aspartate being the predominant amino acids, accounting for 59.7% of the total amino acids. Essential amino acids accounted for 20.03%. Sub critical water extraction could be considered as convenient and effi cient method for the extraction of walnut protein.

walnut meal; subcritical water; protein extraction; response surface methodology; amino acid analysis

10.7506/spkx1002-6630-201720027

TS201.1

A

1002-6630（2017）20-0191-06

汪正興, 韓強, 郜海燕, 等. 響應面試驗優化亞臨界水提取核桃粕蛋白工藝及其氨基酸分析[J]. 食品科學, 2017, 38(20):191-196. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720027. http://www.spkx.net.cn

WANG Zhengxing, HAN Qiang, GAO Haiyan, et al. Optimization of subcritical water extraction of walnut meal protein by response surface methodology and amino acid analysis[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 191-196. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720027. http∶//www.spkx.net.cn

2016-12-27

浙江省科技廳援疆項目（2015C26006）；國家自然科學基金 面上項目（31571907）；

浙江省公益技術研究農業項目（2015C32032）

汪正興（1990—），男，碩士研究生，主要從事食品物流保鮮與質量控制研究。E-mail：18858114583@163.com

*通信作者：郜海燕（1958—），女，研究員，博士，主要從事食品物流保鮮與質量控制研究。 E-mail：spsghy@163.com