不同誘導條件下的VBNC狀態副溶血弧菌的PMA-qPCR定量檢測及其呼吸活性分析

劉羽霏，方 祥，廖振林，王 麗，鐘青萍*

不同誘導條件下的VBNC狀態副溶血弧菌的PMA-qPCR定量檢測及其呼吸活性分析

劉羽霏，方 祥，廖振林，王 麗，鐘青萍*

（華南農業大學食品學院，廣東省食品質量與安全重點實驗室，廣東 廣州 510642）

定量檢測不同誘導條件下的活的非可培養（viable but non-culturable，VBNC） 狀態副溶血弧菌的變化情況，并對VBNC菌的呼吸活性進行分析。采用疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）與熒光定量聚合酶鏈式反應（fl uorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）結合的技術（PMA-qPCR）定量檢測副溶血弧菌活菌數。結合激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細胞儀優化傳統CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）呼吸檢測法對VBNC狀態的副溶血弧菌進行分析。結 果表明PMA-qPCR檢測技術結合平板計數的方法，可用于定量檢測副溶血弧菌誘導過程中活菌數和可培養菌數的變化情況，并利用差值測定出VBNC細胞的濃度。在不同的溫度、NaCl含量和氯霉素含量的誘導條件下，副溶血弧菌在其中的7 種條件下在60 d內進入了VBNC狀態。VBNC細胞終濃度最低為5.75×102CFU/mL，最高為1.70×105CFU/mL。在細胞呼吸實驗中，采用CTC與4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）雙染法能在激光掃描共聚焦顯微鏡下清晰地觀察到VBNC細胞表面的紅色熒光，有效區分死活細胞。同時利用流式細胞儀能夠根據熒光強度快速區分呼吸活性呈陰性和陽性的細胞。本研究為VBNC細菌的檢測和生理特性的研究提供了新的思路和依據。

副溶血弧菌；活的非可培養（VBNC）狀態；PMA-qPCR；流式細胞儀；激光掃描共聚焦顯微鏡

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種革蘭氏陰性兼性厭氧菌，主要存在于海產品和鹽漬食品中。人食用了受該菌污染且未煮熟的海產品后，會出現腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐等癥狀，重癥患者還會脫水、休克昏迷，甚至死亡。該菌引起的食物中毒在我國境內[1-2]乃至全球多地均有報道[3-4]。

活的非可培養（vi able but non-culturable，VBNC）狀態是由Xu Huaishu等[5]通過對水環境中大腸桿菌（Escherichia coli）和霍亂弧菌（Vibrio cholera）的研究首次提出的概念。VBNC狀態是指細菌于常規條件下培養時，不生長繁殖，但仍具有代謝活性的活菌的一種“休眠狀態”[6-7]。研究發現細胞在處于極端溫度、營養缺乏、滲透壓沖擊、甚至是強烈的白光照射等環境壓力下，會進入VBNC狀態[8-10]。VBNC狀態的發現很快引起了微生物學界的重視，不斷有新的病原菌被發現能夠進入VBNC狀態[11]，這無疑對食品安全和人類健康構成了潛在威脅。

VBNC狀態細胞的檢測與鑒定一直受到研究者的廣泛關注。疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）與熒光定量聚合酶鏈式反應（fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）結合的技術（PMA-qPCR）是近幾年興起的一種能有效區分活細胞與死細胞的檢測技術[12-13]。利用PMA不能透過完整的細胞膜，能選擇性地與細胞膜破損的死細胞DNA分子結合從而阻斷DNA分子的PCR擴增的特點[14]，克服了傳統PCR不能區分死活細胞的缺點[15]。這種方法被證實可用于VBNC狀態細菌的檢測[16-17]，并且該技術具有準確定量的能力。呼吸檢測法是根據細胞新陳代謝過程中的氧化還原能力采取的檢測手段。CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是一種常用的細胞呼吸指示劑[18]，可用來檢測細菌的呼吸活性。但傳統的使用單一CTC染料的呼吸檢測法因結果不易被觀察易造成誤檢而受到應用上的限制[19]。4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）是一種核酸染劑，能透過細胞膜與DNA結合，發出藍色熒光，多應用于細胞定位[20]和計數[21]。采用CTC/DAPI雙染的方法能在顯微鏡下清晰地觀察到細胞位置及其呼吸活性。多種染料配合作用及結合激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細胞儀等新技術的應用，提高了呼吸檢測法的準確性，為VBNC檢測提供了新思路[22-23]。

本研究采用實驗室建立的PMA-qPCR方法對VBNC狀態的副溶血弧菌進行定量檢測，并采用與激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細胞儀結合的細胞呼吸檢測法對其生理特性進行分析。為VBNC狀態副溶血弧菌的檢測和生理特性的研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

本實驗所用標準菌株副溶血弧菌ATCC17802，購自廣東省菌種保藏中心，貯存于-80 ℃。

1.1.2 培養基

含質量分數3% NaCl的胰蛋白胨大豆肉湯液體培養基（TSB）：胰蛋白胨15 g/L，大豆蛋白胨5 g/L，氯化鈉30 g/L，最終pH值為7.3±0.2。在TSB中添加質量分數1.8%的瓊脂粉后即為質量分數3%胰蛋白胨大豆肉湯固體培養基（TSA），用于平板計數法測定細菌可培養數。

1.1.3 試劑

PMA 美國Biotium公司；qPCR反應試劑盒（SGExcel FastSYBR Mixture（Plus）） 上海生工生物工程股份有限公司；LIVE/DEAD細胞試劑盒 南京凱基生物科技發展有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒 北京索萊 寶生物技術股份有限公司；CTC日本同仁化學研究所；DAPI 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

生化培養箱 美國Thermo Scientifi c公司；臺式高速冷凍離心機 德國Eppe ndorf公司；CFX96 Touch? qPCR儀美國Bio-Rad公司；鹵鎢燈（650 W） 德國Osram公司；熒光顯微鏡 德國Leica公司；LSM 780激光共聚焦掃描顯微鏡 德國Zeiss公司；Fortessa X-20流式細胞儀美國BD公司。

1.3 方法

1.3.1 副溶血弧菌VBNC狀態的誘導

將細菌接種到含質 量分數3% NaCl的TSB培養基中，37 ℃、150 r/min搖床培養14 h至對數生長期。取對數生長期 的菌懸液，8 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用滅菌的3% NaCl溶液清洗菌體2 次，將菌體分成3 組，第1組用3% NaCl溶液稀釋菌體，誘導溫度分別為-20、4、28 ℃和56 ℃；第2組分別用質量分數0.5%、1%、10%和15%NaCl溶液稀釋菌體，誘導溫度為4 ℃；第3組用3%NaCl溶液稀釋菌體，加入一定量的氯霉素溶液使誘導液中氯霉素含量分別達到1/2 MIC、1 MIC、2 MIC和4 MIC（氯霉素MIC為0.625 μg/mL），誘導溫度為4 ℃。各誘導液中細菌初始濃度約為1×107CFU/mL。

1.3.2 PMA-qPCR定量檢測

1.3.2.1 PMA處理

用ddH2O配制20 mmol/L的PMA貯存液，-20 ℃避光保存。在1.5 mL離心管中加入0.5 mL菌液，加入終濃度為20 μmol/L的P MA，充分混勻，避光處理5 min。然后將離心管開蓋置于冰上，在650 W鹵鎢燈下曝光15 min，樣品距離燈管20 cm[24]。處理后的樣品12 000 r/min離心5 min并用0.01 mol/L 磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌除凈殘留的PMA。按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取DNA，進行qPCR檢測。

1.3.2.2 qPCR方法的建立

根據GenBank中已發表的副溶血弧菌ATCC 17802菌株的tlh基因序列（基因序列號JX262976.1），利用Primer 5.0 軟件設計一對引物。上游引 物：5’-TCGTGCGAAAGTGCTTGAGATG-3’，下游引物：5’-CGGTGAGTTGCTGTTGTTGGAT-3’，擴增產物長度為288 bp。優化后的qPCR反應體系為25 μL，含DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL（終濃度0.2 μmol/L），預混體系12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反應程序：95 ℃預變性3 min， 95 ℃變性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40 個循環，同時收集熒光，循環結束后72 ℃保持5 min。溶解曲線分析：65～95 ℃，每5 s升高0.5 ℃。

繪制標準曲線：按細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明提取副溶血弧菌的DNA，對其進行10～107倍梯度稀釋作為qPCR的模板。以循環數Ct值和細菌濃度（平板計數）繪制標準曲線。

1.3.3 VBNC狀態副溶血弧菌的確認

可培養菌數用平板計數法測定，活菌數用PMA-qPCR定量檢測。每隔一定時間對誘導樣品中的可培養菌數和活菌數進行計數。活菌數與可培養菌數的差值即為VBNC狀態菌數。當誘導至可培養菌數為0，而活菌數不為0時，即可認為細菌全部進入了VBNC狀態。最后用LIVE/DEAD細胞試劑盒染色后在熒光顯微鏡下觀察以確認細胞的死活狀態。

1.3.4 細胞 呼吸法分析副溶血弧菌的VBNC狀態

將樣品分成2 組，一組用于流式細胞儀分析，一組用于激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

根據產品使用說明，在1 mL樣品中加入CTC染料37 ℃孵育60 min。然后用500 μL PBS沖洗，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，去除上重懸液，用于流式細胞儀的分析。第2組在樣品染色離心后加入100 μL PBS重懸細胞，將10 μL細胞放至玻片上。在冰上靜置30 min，使細胞黏附于玻片上，然后用10 μL 4%多聚甲醛溶液在冰上固定30 min。用5 μL 5 μg/mL的DAPI給細胞DNA染色10 min，之后用PBS沖洗2 次，蓋上蓋玻片，用固封劑密封，用于激光掃描共聚焦顯微鏡的觀察。CTC和DAPI的激發波長/發射波長分別為488/650 nm和364/385～470 nm。

2 結果與分析

2.1 qPCR的標準曲線

在1.2×102～1.2×109CFU/mL的細菌濃度范圍內，熒光信號到達設定域值時所經歷 的循環數Ct（y）與細菌濃度（lg（CFU/mL））（x）呈現良好的線性關系，y=3.236 4x+45.189，R2=0.999 6，在此范圍內可用Ct值對樣品中的活菌數進行定量分析。

2.2 不同溫度誘導條件下副溶血弧菌的定量檢測

結合平板計數和PMA-qPCR的方法，對在不同溫度誘導條件下的副溶血弧菌的可培養菌數和活菌數的變化進行測定。樣品分別在4 種溫度（-20、4、28 ℃和56 ℃）條件下進行誘導。誘導60 d的情況如圖1所示。-20、4 ℃和56 ℃的樣品在60 d內進入VBN C狀態，可培養菌數為0時活菌數不為0，此時的所有活菌均進入VBNC狀態。誘導時間從短到長依次為56、-20、4 ℃，VBNC狀態細胞終濃度從多到少依次為4、56、-20 ℃。3 種誘導條件下VBNC狀態細胞終濃度均在5.75×102CFU/mL以上，其中4 ℃達到約1×105CFU/mL。在28 ℃誘導條件下，副溶血弧菌并未在60 d內進入VBNC狀態。其可培養菌數與活菌數的變化曲線幾乎一致，無明顯差異（P＞0.05）。

圖1 不同溫度誘導條件下副溶血弧菌可培養菌數和活菌數的變化Fig. 1 Quantitative detection of V. parahaemolyticus induced at different temperatures

2.3 不同NaCl含量誘導條件下副溶血弧菌的定量檢測

圖2 不同鹽濃度誘導條件下副溶血弧菌可培養菌數和活菌數的變化Fig. 2 Quantitative detection of V. parahaemolyticus induced by different salinities

如圖2所示，60 d內細胞進入VBNC狀態的誘導條件為質量分數0.5%、10%、15% NaCl。在0.5% NaCl的誘導條件下副溶血弧菌在第40天完全進入VBNC狀態，在10% NaCl和15% NaCl的誘導條件下誘導時間則縮短至5 d。3 種誘導條件下VBNC狀態細胞終濃度均達到約104CFU/mL，其中在15% NaCl條件下最高，為1.7×105CFU/mL。在1% NaCl誘導條件下，副溶血弧菌并未在60 d內全部進入VBNC狀態。但活菌數與可培養菌數間差異明顯（P＜0.05）。

2.4 不同氯霉素含量誘導條件下副溶血弧菌的定量檢測

圖3 不同氯霉素含量誘導條件下副溶血弧菌可培養菌數和活菌數的變化Fig. 3 Quantitative detection of V. parahaemolyticus induced by different concentrations of chloramphenicol

如圖3所示，60 d內細胞全部進入VBNC狀態的誘導條件只有4 MIC，誘導時間為50 d，VBNC狀態細胞終濃度為2.5×103CFU/mL。在1/2 MIC、1 MIC和2 MIC誘導條件下，副溶血弧菌均未在60 d內全部進入VBNC狀態。可培養菌數與活菌數的變化曲線幾乎一致，差異不明顯（P＞0.05）。

2.5 熒光顯微鏡觀察結果

利用LIVE/DEAD細胞試劑盒能在熒光顯微鏡下觀察染色后的細胞，確認細胞的死活狀態。在熒光顯微鏡中，不同波長激發光下，活細胞呈現綠色，死細胞呈現紅色。對副溶血弧菌的正常狀態、VBNC狀態和死亡狀態的觀察結果如圖4。正常狀態下的副溶血弧菌主要呈現綠色；死亡狀態下的副溶血弧菌呈現紅色。而處于VBNC狀態下的副溶血弧菌仍有大部分呈現綠色。可見完全處于VBNC狀態下的副溶血弧菌中仍存在相當多的活細胞，從而可以確認這些VBNC狀態的細胞具有活性。

圖4 熒光顯微鏡下不同狀態的副溶血弧菌Fig. 4 Morphological features of V. parahaemolyticus in different states under fl uorescence microscope

2.6 細胞呼吸活性檢測結果

CTC實驗能夠通過分析細胞的呼吸活性確定細胞的活力。本研究利用激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細胞儀共同分析了正常狀態、VBNC狀態和死亡狀態的副溶血弧菌的呼吸活性。

圖5 CTC/DAPI細胞雙染的激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結果Fig. 5 Confocal laser-scanning micrographs of the cells stained with CTC/DAPI

如圖5所示，通過呼吸活動中電子遞質的作用，CTC被還原成CTC甲臜，在細胞表面發出紅色熒光；DAPI能與DNA結合發出藍色熒光，確定細胞位置用于細胞計數。正常狀態下，細胞的電子傳遞活躍，細胞表面呈現較多紅色熒光，紅色熒光強度大；死亡狀態下，細胞電子傳遞停止，沒有紅色熒光生成。而處于VBNC狀態的細胞表面能夠觀察到明顯的紅色熒光，且紅色熒光強度較大，說明此時的細胞仍具有良好的呼吸活性。

流式細胞儀的分析結果與之相似（圖6）。正常狀態下，大部分細胞位于P2；死亡狀態下，細胞則集中在P1。而處于VBNC狀態的細胞中有9.27%分布于陽性區域，具有呼吸活性。

圖6 CTC細胞染色的流式細胞儀分析結果Fig. 6 Cytograms of the cells stained with CTC

3 討 論

VBNC狀態是一種細菌處于環境壓力下采取的生存機制。因具有不可培養的特點，對其檢測和鑒定方法的研究受到廣泛的關注。本研究采用PMA-qPCR的檢測技術結合平板計數的方法，定量監控副溶血弧菌 誘導過程中活菌數和可培養菌數的變化情況，同時測定出VBNC狀態細胞的濃度。研究設置了3 組共12 種條件誘導副溶血弧菌進入VBNC狀態，其中7 種條件下副溶血弧菌在60 d內進入了VBNC狀態。通過活菌數和可培養菌數的差值得出VBNC狀態細胞的濃度，7 種誘導條件中VBNC狀態細胞終濃度最低為5.75×102CFU/mL，最高為1.70×105CFU/mL。從活菌數和可培養菌數的差值也可看出，VBNC狀態的細胞在誘導過程中已經出現，而非等到全部細胞進入不可培養狀態時才出現[25]。另外有5 種條件在小于60 d內誘導副溶血弧菌進入VBNC狀態。其中，部分條件下可培養菌數與活菌數的曲線變化差異不明顯（P＞0.05），這些條件可能不足以使副溶血弧菌進入VBNC狀態；另一部分條件下可培養菌數與活菌數的曲線變化差異明顯（P＜0.05），說明在大于60 d的足夠誘導時間下這些條件可能使副溶血弧菌進入VBNC狀態[26]。

LIVE/DEAD細胞試劑盒能將死細胞和活細胞染上不同的顏色，在熒光顯微鏡下觀察染色后的細胞，可以確認細胞的死活狀態。這種方法常被用于確認VBNC狀態細胞的存在。在熒光 顯微鏡下可以看出大量VBNC狀態細胞發出綠色熒光，從而證實它們的活性。

根據細菌處于VBNC狀態下仍然具有代謝活性這一特點，本研究采用CTC染色結合激光掃描共聚焦顯微鏡觀察和流式細胞儀的方法，證實并分析了VBNC狀態副溶血弧菌的呼吸活性。在CTC/DAPI的雙染實驗中，在激光掃描共 聚焦顯微鏡下可以清晰地看出VBNC狀態細胞與死亡 細胞的差異。VBNC狀態細胞表面呈現明顯的紅色熒光，說明它們仍然具有較強呼吸活性。與傳統的CTC呼吸法相比，DAPI能幫助確定細胞的位置，更直觀和清晰地觀察具有呼吸活性的細胞[27]。在流式細胞儀的分析中，代表VBNC狀態的樣品中有9.27%的細胞處于陽性區域，而死細胞中處于陽性區域的細胞幾乎為零。這進一步證實處于VBNC狀態的副溶血弧菌仍然具有呼吸活 性。然而，實驗中所用的樣品是誘導后的菌液，故樣品中可能混有一定量的死細胞。若能采取進一步的措施將樣品中的死細胞與VBNC狀態細胞區分開，例如結合能區分死活細胞的染料的使用[28]，便可在利用流式細胞分析技術快速定量檢測VBNC細胞同時對其代謝活性進行測定[29-30]。

4 結 論

本研究應用PMA-qPCR技術定量檢測了副溶血弧菌在誘導過程中活菌數的變化情況，結合平板計數法定量檢測出處于VBNC狀態的細胞的濃度，證明該方法能夠快速準確地測定處于VBNC狀態的細菌。其次將CTC呼吸實驗結合激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細 胞分析技術證實了處于VBNC狀態的副溶血弧菌仍然具有呼吸活性，為VBNC狀態細菌的檢測和生理特性分析提供了新的思路和依據。

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Quantitative Detection of Viable but Non-Culturable (VBNC) Vibrio pa rahaemolyticus Cells Ind uced by Different Conditions Using PMA-q PCR and Respiratory Activity Analysis

LIU Yufei, FANG Xiang, LIAO Zhenlin, WANG Li, ZHONG Qingping*
(Guangdong Provincial Key Laboratory of Food Quality and Safety, College of Food Science,South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

The aims of the study were to quantitatively monitor viable but non-culturable (VBNC) cells of Vibrio parahae molyticus induced by different conditions and to analyze th eir respiratory activity. Fluo rescence quantitative PCR(qPCR) coupled with prop idium monoazide (PMA-qPCR) was used to quantify viable cells of V. parahaemolyticus. A new method combining confocal laser-scanning microscopy (CLSM) and fl ow cytometry with 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC) reduction was applied to detect the respiratory activity of VBNC cells. Results s howed that PMA-qPCR with culture-based method allo wed successful monitoring of the number of VBNC cells of V. parahaemolyticus and then the density of VBNC cells could be calculated. Seven of the tested conditions could entirely induce cells into VBNC state within 60 day. The minimum and maximum density of VBNC cells were 5.75 × 102and 1.70 × 105CFU/mL,respectively. In the respiration test, 5-cyano-2,3-ditol yl tetrazolium chloride/ 4’,6-diamidino-2-phenylindole (CTC/DAPI) staining allowed to clearly distinguish viable cells from dead cells under CLSM by fl uorescent formazan. Flow cytometry enabled rapid discrimination between respiratory active and non-active cells based on fl uorescence intensity.In summary, this study provided new methods for the detection of V. parahaemolyticus in VBNC state and for better understanding of their metabolism.

Vibrio parahaemolyticus; viable but non-culturable(VBNC); fluorescence quantitative PCR combined with propidium monoazide (PMA-qPCR); fl ow cytometry; confocal laser-scanning microscopy (CLSM)

TS201.3

A

1002-6630（2017）20-0215-07

2017-04-12

國家自然科學基金面上項目（31271956）；廣東省自然科學基金項目（2017A030313146）

劉羽霏（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：230742195@qq.com

*通信作者：鐘青萍（1967—），女，副教授，博士，研究方向為食品安全、食品微生物。E-mail：zhongqp@scau.edu.cn

劉羽霏 , 方祥, 廖振林, 等. 不同誘導條件下的VBNC狀態副溶血弧菌的PMA-qPCR定量檢測及其 呼吸活性分析[J].食品科學, 2017, 38(20): 215-221. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720031. http://www.spkx.net.cn

LIU Yufei, FANG Xiang, LIAO Zhenlin, et al. Quantitative detection of viable but non-culturable (VBNC) Vibrio parahaemolyticus cells induced by different conditions using PMA-qPCR and respiratory a ctivity analysis[J]. Food Science, 2017,38(20)∶ 215-221. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720031. http∶//www.spkx.net.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720031