基質輔助激光解析飛行質譜法檢測空腸彎曲菌及李斯特菌

屠博文，吉俊敏，杜 強，黎俊宏，唐宏兵，熊吉濱，韓曉冬

基質輔助激光解析飛行質譜法檢測空腸彎曲菌及李斯特菌

屠博文1，吉俊敏1，杜 強1，黎俊宏1，唐宏兵1，熊吉濱2，韓曉冬3

（1.常州市疾病預防控制中心，江蘇 常州 213022；2.泰州醫藥高新技術產業園區疫苗工程中心，江蘇 泰州 225300；3.南京大學醫學院，江蘇 南京 210093）

目的：通過VITEK MS微生物檢測系統對養殖場及市售活雞來源的空腸彎曲菌和單核細胞性李斯特菌進行激光解析飛行質譜鑒定，建立兩種致病菌的質譜鑒定方法。方法：從樣品中分離獲得疑似的空腸彎曲菌和單核細胞性李斯特菌，經不同配比的基質液處理后進行質譜鑒定。通過分析檢出菌特征峰及相對豐度差異來評價不同配比基質液對兩種致病菌檢測的影響。結果：空腸彎曲菌和李斯特菌對基質液配比要求具有明顯差異，前者不需要經過甲酸裂解，而對三氟乙酸含量敏感，后者鑒定結果受到甲酸裂解制約。基質液含水量控制在體積分數30%可以有效避免特征峰缺失并提高檢出率。結論：控制基質液的含水量、基質濃度和三氟乙酸含量可以增加空腸彎曲菌和李斯特菌的特征峰數量，增強相對豐度，提高致病菌檢出率。基質液配比優化研究有助于增強食源性致病菌快速鑒定能力，有助于提高疾病預防和食源性風險監測的時效性。

VITEK MS微生物檢測系統；空腸彎曲菌；單核細胞性李斯特菌；基質液配比；微生物質譜檢測方法

隨著食源性監測工作的全覆蓋，從食品中檢出的致病菌種類和數量增加，快速檢測技術運 用于食品風險評估工作成為食源性監測的亮點。基質輔助激光解析飛行質譜（matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）技術是微生物快速檢測技術的新成員，越來越多的生物標志物的發現使得質譜檢測技術更加準確和可靠[1-2]，核糖體蛋白是MALDI-TOF-MS的主要分子標志物[3-4]，此外酶、外膜蛋白及毒性蛋白等構成了物種水平特征峰標志物[5]。經大量實驗證明微生物質譜檢測的種水平識別能力在80%～100%[6-7]。

空腸彎曲菌是一種的重要食源性人獸共患病原菌[8-9]，很多動物可正常攜帶彎曲菌，通過食物鏈傳遞給人而致病。大量研究表明家禽是該菌重要的傳染源，禽肉食用與空腸彎曲菌的傳播緊密相關[10]。空腸彎曲菌感染后能夠引起急性腸炎、格林巴利綜合癥、反應性關節炎等多種疾病[11]。由于生物量少、培養條件苛刻、暴露在高氧環境后極易死亡，空腸彎曲菌在日常食源性風險監測工作中極難檢出。空腸彎曲菌在體外極易進入休眠態，需要通過活化培養方能檢出。空腸彎曲菌的食源性檢測是食源性風險監測工作中的難點。李斯特菌也是一種重要的人畜共患病原菌，低溫環境下仍極易污染食品，引起急性腹瀉、發熱、腦膜炎、敗血癥等疾病，死亡率極高[12]。由于單核細胞性李斯特菌是引起人李斯特菌病的元兇，在食品檢測過程中尤為受到關注。

目前，以上兩種致病菌臨床鑒定主要通過傳統培養法和PCR法檢測，使用質譜技術進行檢測的案例在國內外罕見[13-14]。VITEK MS微生物鑒定的準確性和檢測容量取決于質譜數據庫中該種微生物圖譜的完整性和兼容性[15-16]。分析并補充難培養和難檢測致病菌的圖譜數據有助于提高該種微生物的快速檢測效率。VITEK MS是一種全自動微生物快速鑒定系統，微生物檢出質量與菌種類別、培養條件、基質液配比及蛋白結晶化操作流程都有很大的關系。本研究對不同配方基質液作用下的空腸彎曲菌和李斯特菌進行MALDI-TOF-MS峰值分析，對比各自的質譜峰形差異，一方面以此尋找關鍵的生物標識峰，另一方面確定兩種微生物最適的基質液配比。研究不同配比基質液對質譜檢測的影響，有助于完善基于VITEK MS系統的食源性致病菌快速檢測方法，提高檢出效率并有效完成食源性致病菌快速檢測任務。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根據《中國人民共和國食品安全法》及《食品微生物及其致病因子監測工作手冊》的要求，對養殖場及市售活雞進行致病菌檢測；標準菌株大腸桿菌ATCC8739美國ATCC菌種保藏中心。

甲酸（批號：251364）、乙腈（批號：271004）、乙醇（批號：1012768）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA，批號：1C41k054） 美國Sigma公司；α-氰-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，α-CHCA，批號：16553） 法國生物梅里埃公司；營養瓊脂平板（批號：150422） 科瑪嘉生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

VITEK MS MALDI-TOF質譜儀、WGZ-200麥氏濁度儀 法國生物梅里埃公司；GNP-9160隔水式恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養及樣品制備

表1 不同實驗組的質譜基質液配比Table 1 Composition of matrix solutions for mass spectrometry

按照GB/T 4789.9—2014《食品微生物檢驗 空腸彎曲菌檢驗》方法分離純化獲得的空腸彎曲菌，接種至營養瓊脂，42 ℃培養48 h。按照GB/T 4789.30—2016《食品微生物檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》的方法分離純化獲得單核細胞性李斯特菌，接種至營養瓊脂，30 ℃培養24 h，各自獲得對應的菌落以便進行質譜鑒定。挑取兩種菌株單個純菌落，按照表1分組用0.85%生理鹽水稀釋成菌懸液，配成麥氏濁度3.0～3.5的菌懸液。吸取5.0 μL的菌懸液滴加至質譜靶板對應孔中，常溫干燥5 min。按照表1所示配方在C3、C4、L3和L4組樣品孔中滴加1.0 μL的甲酸溶液處理干燥10 min，隨后加入不同配比的基質液，干燥10 min待測。

1.3.2 VITEK MS鑒定

參數調整：激光強度47 Hz，每孔采樣率100 次，分子質量范圍2 000～20 000 D，有效檢測范圍3 000～16 000 D，峰值調整模式為線性。

質控校準：選取大腸桿菌ATCC8739作為質控菌。采用RUO軟件對采集的樣品圖譜進行比對分析，與Myla肽指紋數據庫中的對應標準菌株的超級圖譜和參考圖譜進行多重比對，以檢出率表示為鑒定結果。指紋圖譜對比分析調用Myla數據庫中的超級圖譜和參考圖譜與樣品質譜數據進行對比。

1.4 統計學處理

每組樣品菌進行3 次重復鑒定，將每組質譜峰圖荷質比及相對豐度分別統計，并計算同一個荷質比的平均豐度值及方差，通過SPSS統計軟件（14.0）計算不同實驗組之間的相似性，統計特征峰和缺失峰。

2 結果與分析

2.1 質譜分析結果

VITEK MS中以檢出率為檢測結果可靠性的評判標準。其中低于80.00%的認為檢出結果較不可靠，80.00%～90.00%為檢出結果較可靠，有待進一步判別，高于90.00%表示檢測結果可靠，高于99.00%則表示檢測結果極可靠。

通過不同配比的基質液處理待測菌，其質譜檢出率存在差異（表2）。檢出結果及檢出率可見，革蘭氏陰性菌空腸彎曲菌質譜鑒定結果受到基質液配比差異的影響較小，其中L1～L4組的乙醇、水及乙腈比例與空腸彎曲菌的檢出率和結果沒有明顯關聯，但C1、C2和C3組的TFA體積分數則與檢出率呈現正相關，TFA體積分數不小于0.5%時，檢出率達到99.99%。

表2 不同配比的基質液處理后鑒定結果及檢出率差異Table 2 Results of bacterial identifi cation and detections rates with different matrix solutions

而革蘭氏陽性菌李斯特菌的檢測則受到較大的影響。首先，甲酸處理與否直接影響檢出結果和檢出率，未處理導致只能檢出為李斯特菌屬而無法鑒定到種水平。L3和L4組結果可見，基質液含水可以顯著提高檢出率。檢測結果顯示其中C3及L4組的檢出率均大于99%，質譜檢測結果極可靠。

2.2 肽質量圖譜分析結果

經過質譜鑒定得到空腸彎曲菌（圖1）和單核細胞性李斯特菌的質量圖譜（圖2）。將所得質譜數據中的特征峰峰值（m/z）及相對豐度值（峰高）進行統計，同峰值的豐度值進行計算，得到不同基質液配比作用下特征峰及相對豐度值的質譜峰圖譜。

圖1 空腸彎曲菌經不同配比基質液處理后的質譜圖譜Fig. 1 Mass spectra for Campylobacter jejuni with different matrix solutions

圖2 單核細胞性李斯特菌經不同配比基質液處理后的質譜圖譜Fig. 2 Mass spectra for Listeria monocytogenes with different matrix solutions

圖3 不同配比基質液處理空腸彎曲菌后質量圖譜特征峰及相對豐度對比Fig. 3 Characteristic peaks and relative abundance for Campylobacter jejuni with different matrix solutions

空腸彎曲菌質譜數據分析顯示（圖3），各組的質譜峰圖譜極其相似，各組檢出峰未出現缺失現象。其中C3組特征峰m/z 4 365、4 776、6 158、7 035、7 082、8 461、9 553的相對峰強度較其他組更高，其中高峰值區的特征峰具有更高的峰強度，而低峰值區則沒有顯著的差異（P＜0.05）。基質液的含水量對空腸彎曲菌質譜峰形有一定的影響，C4組含水較高可能由此降低了高峰值特征峰的相對峰強度，使得檢出率小幅度下降。CHCA體積分數的高低對質譜結果的影響不明顯，而TFA體積分數達到0.5%可以增加空腸彎曲菌的檢出率，而TFA體積分數高于0.5%后檢出峰相對峰強度增強不明顯（結果未給出）。甲酸裂解處理后峰值強度沒有明顯增強，空腸彎曲菌不能通過甲酸裂解處理提高檢出。m/z 4 365、5 267、5 498、7 035的相對峰強度較高，可能是空腸彎曲菌的特異性生物標志峰。

圖4 不同配比基質液處理單核細胞性李斯特菌后質量圖譜特征峰及豐度值對比Fig. 4 Characteristic peaks and relative abundance for Listeria monocytogenes with different matrix solutions

單核細胞性李斯特菌的質譜峰圖譜與空腸彎曲菌不同（圖4）。所有組的圖譜呈現明顯的中高峰值區聚集現象，低峰值區的峰相對強度很低。L3和L4組的特征峰m/z 4 519、4 877、6 009、6 389、6 717、7 404和7 591的峰相對強度較高，峰形更突出，可見甲酸裂解后的實驗組其各特征峰峰強度均有顯著的提高，甲酸處理是革蘭氏陽性菌質譜鑒定的關鍵。L3組基質液無水，導致m/z 3 714、5 118和5 172等特征峰缺失，而L1組基質液中缺乏并未出現類似空腸彎曲菌的檢出率下降的現象，可見TFA體積分數對革蘭氏陽性李斯特菌的影響較低。m/z 4 324、4 877和9 755特征峰峰強度較高，可以作為單核細胞性李斯特菌質譜檢測的特異性生物標志。

以此配方對其他菌種進行了質譜分析（表3），發現檢出菌都呈現C3和L4組實驗組檢出率較高的現象。大部分革蘭氏陽性菌樣品未用甲酸處理都難以檢出。肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌及蠟樣芽孢桿菌使用改進后的基質液處理后，檢出率沒有得到顯著改善（表3）。

表3 革蘭氏陽性及陰性菌使用基質液配方與檢出率Table 3 Detection rates of Gram positive and negative bacteria using matrix solutions

3 討 論

傳統的微生物培養和鑒定是耗時又復雜的，由于不穩定的試劑、血清及培養條件的影響，鑒定結果往往具有顯著的人為差異。采用自動化鑒定技術及快速鑒定技術，可以有效的減少人為、環境和培養條件帶來的誤差，實現精準鑒定。李斯特菌和空腸彎曲菌感染是嚴重危害人類健康的食源性疾病之一。空腸彎曲菌致病性具有很強的隱蔽性，它通過正常攜帶不致病方式隱藏在禽類腸道等內臟中，能夠在厭氧條件生長，這些特征都極大的干擾了檢測工作[17-19]。單核細胞性李斯特菌的致病性很強，冷凍食品中的單增細胞性李斯特菌對與免疫力低下的病人具有很強的致病性病死率較高，是全球重點關注的食源性致病菌[20-23]。建立快速、準確的疑難致病菌檢測和鑒定方法，尤其是針對性的快速鑒定方法，對保證食品安全和人類健康具有重要意義。目前針對這兩種致病菌的方法很多，我國檢測領域目前常用的檢測技術有傳統表型鑒定、生化反應鑒定和特異性平板篩選等。但由于這兩種致病菌培養慢，條件苛刻，較難檢出，傳統微生物鑒定技術不具備明顯的優勢。

新型微生物質譜技術能在短時間內直接檢出單菌落種屬水平信息。文獻報道的VITEK MS微生物質譜分析的準確率在92.5%～99.0%之間，顯著高于API生化分析法（78.5%）、顯色培養鑒定法（59.3%）[24-26]。VITEK MS能快速、準確、高效地鑒定微生物。其中較為突出的是傳統方法很難鑒定到種的酵母菌和真菌。據報道通過VITEK MS檢測1058株酵母實驗中，只有3%未檢出，1%檢出錯誤，有12 株菌株信息在VITEK MS數據庫中缺失。通過ITS測序對比，發現VITEK MS的檢出率達到96%[27]。大部分實驗報道中，VITEK MS未能檢出微生物的原因主要是數據庫中圖譜較少或缺失。隨著該技術的廣泛推廣應用，質譜數據庫將得到不斷補充完善，鑒定結果更加準確和可靠[28-30]。

通過對空腸彎曲菌及李斯特菌質譜鑒定基質液的比較分析，本實驗發現菌株前處理優化對于微生物質譜分析至關重要。革蘭氏陽性菌李斯特菌及陰性菌空腸彎曲菌對基質液要求不同，李斯特菌需要甲酸破壁處理卻對TFA含量要求較低，而空腸彎曲菌的基質液則需要將TFA體積分數提高至0.5%以上方能顯著提高檢出，而無需甲酸破壁處理。質譜基質液含水量控制在30%能夠減少特征峰缺失，有效地提高檢出率。為了降低成本，質譜分析用空腸彎曲菌基質液最優配方為：V（乙醇）∶V（乙腈）∶ V（水）=1∶1.5∶1，2.5% CHCA，0.2%～0.5% TFA；李斯特菌基質液最優配方為：V（乙醇）∶V（乙腈）∶V（水）=1∶1∶1，1.0% CHCA。陽性菌：取麥氏濁度3.0～3.5的菌液1.0 μL置于10 μL離心管，加入0.5 μL甲酸溶液破壁5 min，吸出混合液涂布于點樣孔。加入1.0 μL的陽性菌基質液，25 ℃干燥10 min。陰性菌：取麥氏濁度1.0～1.5的菌液1.0 μL置于10 μL離心管直接涂布于點樣孔。加入1.5 μL的陰性菌基質液，25 ℃干燥10 min。制定待測菌株的質譜檢測處理流程（圖5），可以完善常見食源性致病菌快速檢測的平臺，更有效地應對突發公共衛生事件的處理。通過改進基質液，針對革蘭氏陰性和陽性菌進行區別處理，可以顯著提高食源性致病菌的檢出率。但是某些致病菌的質譜檢測依然困難，VITEK MS很難檢出志賀菌，同時肺炎克雷伯菌、肺炎鏈球菌和蠟樣芽孢桿菌的質譜檢測靈敏度較低。根據菌株特性推測，菌株的生長特征可能制約著質譜檢測的檢出。肺炎克雷伯菌具有很強的黏性，而CHCA基質液處理后結晶化程度較差，由此可能導致質譜檢測靈敏度下降。蠟樣芽孢桿菌和肺炎鏈球菌菌落干燥，且硬度較高，需要進行更有效的破壁處置。食源性致病菌在VITEK MS鑒定過程中對基質液的要求有差異，優化基質液配比和處理程序可以優化食源性致病菌質譜檢測效率，提高質譜微生物鑒定的優勢。進一步對不同食源性致病菌質譜鑒定過程中基質液的優化配比進行研究十分必要。

圖5 革蘭氏陽性和陰性菌VITEK MS檢測流程Fig. 5 Flow chart for VITEK MS detection process of Gram positive and negative bacteria

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Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry for the Detection of Campylobacter jejuni and Listeria monocytogenes

TU Bowen1, JI Junmin1, DU Qiang1, LI Junhong1, TANG Hongbing1, XIONG Jibin2, HAN Xiaodong3
(1. Changzhou Centers for Disease Control and Prevention, Changzhou 213022, China;2. The Vaccine Engineering Center of Taizhou Medical Hi-tech Industrial Park, Taizhou 225300, China;3. School of Medical, Nanjing University, Nanjing 210093, China)

Objective∶ To establish a matrix-assisted laser desorption ionization time of fl ight mass spectrometry (MALDITOF-MS) method to detect Campylobacter jejuni and Listeria monocytogenes in environmental samples from a chicken farm and samples from commercial live chickens using VITEK MS. Methods∶ The suspicious colonies of both bacteria were separated from the samples, and then suspended in matrix solutions consisting of mixtures of different proportions of ethanol, acetonitrile and water before identifi cation by MALDI-TOF-MS. The effect of matrix solution composition on the bacterial detection was evaluated by examining the differences in characteristic peak value and relative abundance. Results∶Signifi cantly different matrix solutions were needed for the detection of Campylobacter jejuni and Listeria monocy togenes;the former did not require cracking by formic acid and was sensitive to trifl uoroacetic acid (TFA), but the latter were just the opposite. A 30% water content in matrix solution (V/V) could avoid the lack of characteristic peak and enhance the detection rate. Conclusion∶ Control of the water content in matrix solution, TFA concentration and matrix concentration can enhance the number and relative abundance of characteristic peaks, and detection rate. The optimized matrix solution enables the rapid identifi cation of foodborne pathogens, which was able to improve the timeliness of disease prevention and food-borne risk monitoring.

VITEK MS microbe identification system; Campylobacter jejuni; Listeria monocytogenes; matrix solution composition; mass spectrometric detection of microbes

R446.5

A

1002-6630（2017）20-0262-06

2016-10-27

江蘇省自然科學基金項目（BK20150250）；江蘇省衛生計生委科研項目（Y2015016）；

常州市科技項目（CE20165042）

屠博文（1984—），男，助理研究員，博士，主要從事病原微生物質譜檢測和院內感染超級細菌的基因分型研究。

E-mail：tbwchangzhou@163.com

屠博文, 吉俊敏, 杜強, 等. 基質輔助激光解析飛行質譜法檢測空腸彎曲菌及李斯特菌[J]. 食品科學, 2017, 38(20):262-267. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720038. http://www.spkx.net.cn

TU Bowen, JI Junmin, DU Qiang, et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time of fl ight mass spectrometry for the detection of Campylobacter jejuni and Listeria monocytogenes[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 262-267. ( in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720038. http∶//www.spkx.net.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720038