阪崎克羅諾桿菌單克隆抗體的制備及其間接競爭-ELISA檢測方法

翟緒昭，曾海娟，王廣彬，董慶利，謝曼曼，丁承超，劉武康，王淑娟，李 杰，劉 箐,*

阪崎克羅諾桿菌單克隆抗體的制備及其間接競爭-ELISA檢測方法

翟緒昭1，曾海娟1，王廣彬2，董慶利1，謝曼曼1，丁承超1，劉武康1，王淑娟1，李 杰1，劉 箐1,*

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.徐州綠健乳品飲料有限公 司，江蘇 徐州 221006）

以阪崎克羅諾桿菌標準菌株ATCC 29004免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤細胞技術，經過兩次細胞融合共制備出7 株分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株（1E9、2A7、2D10、3E5、5B10、6E3、12A2）。其中2A7、2D10、3E5、12A2的效價達到了1∶256 000，6E3的效價為1∶128 000，5B10的效價為1∶64 000，1E9的效價為1∶32 000。亞型鑒定結果顯示1E9的亞型為IgG1，6E3的亞型為IgG2b，其余抗體2A7、2D10、3E5、5B10、12A2的亞型均為IgG2a。對7 株抗體進行特異性檢測結果顯示，2A7能與3 株阪崎克羅諾桿菌（ATCC 29004、ATCC 29544、ATCC 12868）都結合，1E9能與其中兩株（ATCC 29004、ATCC 12868）結合，且與其他11 株類似菌和常見致病菌交叉反應結果顯示7 個抗體均有良好的特異性。用2A7建立的間接競爭酶聯免疫吸附測定法對阪崎克羅諾桿菌的檢測靈敏度可達到106CFU/mL。

阪崎克羅諾桿菌；單克隆抗體；間接競爭ELISA

阪崎克羅諾桿菌原名阪崎腸桿菌（Cronobacter sakazakii，Cs），是一種革蘭氏陰性無芽孢桿菌，兼性厭氧，通過周生鞭毛運動，是腸道正常菌群的一種，屬于條件致病菌，嬰幼兒特別是低出生體質量的早產兒（出生體質量低于2 500 g）以及免疫缺陷的成年人和老人是其易感人群[1]。Cs感染的臨床癥狀包括壞死性小腸結腸炎、菌血癥、腦膜炎等，致死率高達40%～80%，并且一些幸存者可能遭受嚴重的神經系統并發癥[2-3]。Cs感染事件爆發的污染源主要包括嬰幼兒配方奶粉、動植物來源的原材料以及生鮮、冷凍食品等[4-5]。

目前，Cs的檢測主要依靠傳統的生化檢測和分子生物學檢測。現今通用的ISO-TS 22964-2006檢測方法得到檢測結果需要5～7 d[6]。法國梅里埃公司的API 20E、ID 32E等自動化檢測系統由于數據庫的限制也被證明檢測結果不夠準確[7]。實時聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）[8-9]、環介導等溫擴增技術[10]、熒光原位雜交[11]、變性高效液相色譜[12]等方法雖然特異性和靈敏度較好，但存在操作復雜，對操作人員技術要求較高，設備昂貴等問題，不易于推廣應用。

免疫分析技術主要是利用抗體能夠與相應抗原及半抗原發生自發、高選擇性的特異性結合這一性質，通過將特定抗體（或抗原）作為選擇性試劑來對相應待測抗原（或抗體）進行分析測定的方法，具有分析時間短、靈敏度高、特異性好的優點[13-14]。用于Cs檢測的免疫學方法主要包括酶聯免疫[15]、膠體金試紙條[16]、免疫磁珠[17]等，這些方法的靈敏度和特異性依賴于所使用抗體的性能。基于高性能單克隆抗體的免疫分析技術為快速準確檢測Cs提供了可能。本實驗擬制備親和力高，特異性好的抗Cs單克隆抗體，并在此基礎上設計一種間接競爭酶聯免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測定法用于Cs的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 菌種

Cs標準菌株（ATCC 29004、ATCC 29544、ATCC 12868）、產氣腸桿菌（ATCC 13048）、甲型副傷寒沙門菌（CMCC（B）50093）、乙型副傷寒沙門菌（CMCC（B）50094）、肺炎克雷伯菌（CMCC（B）46117）、蠟樣芽孢桿菌（CMCC（B）63303）、副溶血性弧菌（ATCC 17802）、鮑氏志賀菌（ATCC 9207）、宋氏志賀菌（ATCC 25931）、腸出血性大腸埃希菌O157:H7（ATCC 43895）、單核細胞性李斯特菌（ATCC 19114）、小腸結腸炎耶爾森菌（ATCC 23715）為上海理工大學有害微生物危害與控制研究所保存。

1.1.2 實驗動物

小鼠骨髓瘤細胞SP2/0為上海理工大學有害微生物危害與控制研究所保存；6～8 周齡雌性BALB/c小鼠購自第二軍醫大學動物中心。

1.1.3 試劑

液體石蠟、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、HAT（50×）培養基、HT（50×）培養基、HRP標記羊抗鼠IgG抗體 美國Sigma公司；Taq DNA聚合酶及其他PCR試劑 上海生工生物工程有限公司；DMEM高糖培養基 美國Gibco公司；胎牛血清 上海Biosun公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、青鏈霉素混合液（雙抗） 美國Hyclone公司；單克隆抗體亞類鑒定二抗 洛陽佰奧通實驗材料中心；Protein G親和層析柱 美國GE Healthcare公司；25 mL細胞培養瓶、細胞凍存管、酶標板 無錫耐思生物科技有限公司；96 孔細胞培養板、24 孔細胞培養板美國Costar公司；其余常規試劑均為國產分析純。

1.1.4 儀器與設備

PCR儀 美國Applied Biosystems公司；凝膠成像儀英國Syngene公司；CO2恒溫培養箱 美國Thermo公司；多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司；Mini-power電泳儀、蛋白純化儀、Mini-PROTEAN Tetra電泳儀 美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原準備

將3 株Cs復蘇劃平板，挑選典型單個菌落進行PCR鑒定，PCR鑒定引物由生工生物工程股份有限公司合成，其核苷酸序列為WFB1：GGG TTG TCT GCG AAA GCG AA；WFB2：GTC TTC GTG CTG CGA GTT TG。確定菌株的準確性后將細菌養至飽和，測定3 株菌的飽和菌液在600 nm波長處的OD值，選取OD值最高的一株菌用0.3%甲醛溶液進行滅活處理，滅活后將細菌用PBS洗滌3 次，調整菌液濃度至OD600nm為0.6。

1.2.2 小鼠免疫

選用6 只狀態良好的6～8 周齡雌性BALB/c小鼠用制備好的菌液進行全菌免疫，采用腹腔注射的方式，按免疫劑量分為3 組，每組2 只，免疫劑量分別為0.2、0.3、0.4 mL。初次免疫過后分別于第14天、第28天、第42天進行加強免疫，第4次免疫過后第7天進行斷尾取血，收集小鼠血清，將小鼠血清分別倍比稀釋400、800、1 600、3 200、6 400、12 800、25 600、51 200 倍用間接ELISA方法進行血清效價測定，以實驗組OD450nm/陰性對照組OD450nm大于等于2.1判定為陽性，以結果為陽性的最大稀釋倍數為小鼠血清效價。選取效價最高的一組小鼠分別于融合前72 h進行沖擊免疫，免疫劑量適當增加。

1.2.3 細胞融合及篩選

融合前30 d進行小鼠骨髓瘤細胞SP2/0的復壯篩選。融合前1 d，取正常BALB/c小鼠的腹腔巨噬細胞為飼養層細胞。將超免3 d后的小鼠脊椎脫臼致死后摘取脾臟，沖洗研磨出脾細胞，將SP2/0和脾細胞按1∶5的比例用50%的PEG作為融合劑進行細胞融合，融合后按1×105個/孔鋪于已鋪飼養層細胞的96 孔板中，放置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。用含HAT的培養基進行雜交瘤細胞的篩選，待細胞鋪滿50%孔底的時候，用間接ELASA法對細胞上清液進行效價測定，選取陽性孔用有限稀釋法進行亞克隆。亞克隆過程中改用HT培養基對雜交瘤細胞進行進一步的篩選，共進行兩次以上亞克隆，每次克隆的陽性孔細胞都擴大培養并凍存。

1.2.4 單克隆抗體腹水的制備

采用動物體內誘生法[18]，選用狀態良好8 周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟。7 d后，將擴大培養的雜交瘤細胞用生理鹽水重懸后，按106個/只腹腔注射小鼠，待小鼠腹部明顯膨大后，收集腹水，4 000 r/min離心5 min，取上清液。腹水用飽和硫酸銨法粗提后，用Protien G柱親和層析進行純化，純化后的抗體用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）進行純度分析。

1.2.5 抗體亞型測定

采用間接ELISA方法，按照抗體亞型（IgA、IgG 1、IgG 2a、IgG 2b、IgG 3、IgM）測定試劑盒說明書進行抗體亞型的測定。

1.2.6 抗體效價測定

將純化后的抗體倍比稀釋1 000、2 000、4 000、8 000、16 000、32 000、64 000、128 000、256 000 倍用間接ELISA法進行抗體效價的測定，結果以陽性的最大稀釋倍數為抗體的效價。

1.2.7 抗體特異性測定

采用間接ELISA方法，測定抗體與3 株Cs（ATCC 29004、ATCC 29213、ATCC 29544）以及產氣腸桿菌、甲型副傷寒沙門菌、乙型副傷寒沙門菌、副溶血性弧菌、鮑氏志賀菌、宋氏志賀菌、腸出血性大腸埃希菌O157:H7、單核細胞性李斯特菌等共14 株菌是否有交叉反應。

1.2.8 間接競爭ELISA檢測方法的建立

間接競爭ELISA的過程為飽和Cs 100 μL/孔包被96 孔板，37 ℃孵育2 h，用磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered saline with Tween 20，PBST）洗3 次，然后用3%脫脂奶粉封閉1 h，將待測樣品與一抗混合，37 ℃孵育1 h，PBST洗3 次，加入HRP標記的羊抗鼠二抗，孵育1 h后用PBST洗3 次，3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）顯色液顯色15 min，加入終止液后測定OD450nm值。選用兩塊96 孔板A、B進行包被，A板為實驗組，B板為對照組，以實驗組OD450nm值/對照組OD450nm值為0.5時對應的菌濃度為IC50值。本實驗選用對照組OD450nm值為1.0時一抗的稀釋倍數為一抗的工作濃度，因而結果判定以OD450nm值低于0.5時判定為陽性。

2 結果與分析

2.1 抗原鑒定

選用Cs標準菌株（ATCC 29004、ATCC 29544、ATCC 12868）復蘇劃平板，挑選典型單個菌落進行PCR鑒定，鑒定結果如圖1所示，3 株Cs標準菌株均在282 bp處出現明顯電泳條帶，與Cs特異性基因條帶大小一致，說明3 株菌株均為Cs。

圖1 克羅諾菌株PCR鑒定Fig. 1 PCR identifi cation of Cronobater sakazakii

2.2 小鼠血清效價

表1 小鼠血清效價（OD450 nm）Table 1 Serum antibody titers of mice (OD450 nm)

第4次免疫后，小鼠血清效價測定結果如表1所示，陰性對照OD450nm為0.070 35，1～6號小鼠的血清效價分別為1∶51 200、1∶51 200、1∶25 600、1∶25 600、1∶25 600、1∶25 600，免疫劑量為0.2 mL的一組小鼠血清效價最高，因而選用該組小鼠進行雜交瘤細胞融合。

2.3 單克隆抗體純化效果分析

如圖2所示，經飽和硫酸銨沉淀和Protien G柱親和層析后，7 個抗體SDS-PAGE圖均在25 kD左右出現一條輕鏈，在50～60 kD左右出現一條重鏈，且無明顯雜帶，這表明7 個抗體純化效果較好，純化后的抗體純度較高。

Fig. 2 SDS-PAGE patterns of monocolonal antibodies from serum of mice

2.4 抗體亞型鑒定結果

表2 抗體亞型測定結果（OD450 nm）Table 2 Identifi cation of antibody subtypes (OD450 nm)

7 個抗體亞型鑒定結果如表2所示，1E9的亞型為IgG1，6E3的亞型為IgG2b，其余5 個抗體2A7、2D10、3E5、5B10、12A2的亞型均為IgG2a。

2.5 抗體效價測定結果

如圖3所示，7 個抗體中2A7、2D10、3E5、12A2的效價達到了1∶256 000，6E3的效價為1∶128 000，5B10的效價為1∶64 000，1E9的效價為1∶32 000。

2.6 抗體特異性測定結果

7 個抗體分別與3 株Cs以及產氣腸桿菌、腸出血性大腸埃希菌O157∶H7、肺炎克雷伯菌等11 株菌交叉反應的結果如表3所示，其中2A7能夠和3 株Cs都交叉，1E9能夠和Cs ATCC 29004以及Cs ATCC 12868兩株克羅諾桿菌結合，且7 個抗體均有較好的特異性。鑒于2A7能夠實現對3 株Cs的全檢，因而選用2A7進行間接競爭ELISA檢測方法的建立。

表3 抗體的特異性分析Table 3 Specifi city of antibodies

2.7 間接競爭ELISA檢測方法的建立

采用2A7進行間接競爭ELISA檢測方法的建立，當抗體稀釋倍數為16 000時，OD450nm值為1.0，因而選用1∶16 000為一抗的工作濃度，即抗體用量為12.5 ng。靈敏度檢測結果如圖4所示，可知對Cs的檢測靈敏度可達到106CFU/mL。

圖4 間接競爭ELISA方法的檢測限分析Fig. 4 Detection limit of indirect-competitive ELISA

3 討 論

克羅諾桿菌是污染嬰幼兒配方奶粉的主要致病菌，是一種較低致病劑量的致病菌，關于克羅諾桿菌的檢測一直是全世界研究的熱點[19-20]。免疫學檢測方法是檢測致病菌的一種快速、有效的方法，主要包括酶聯免疫技術、量子點熒光免疫技術、放射免疫技術、熒光偏振免疫技術、膠體金免疫層析技術、蛋白芯片技術等。由于免疫分析技術是以抗原抗體的特異性結合為 基礎的，因而制備性能良好的抗體是免疫分析技術應用于克羅諾桿菌檢測的關鍵。除了傳統的雜交瘤細胞技術外，近年來出現了多種新的單克隆抗體制備技術，如嵌合單克隆抗體技術[21]、轉基因小鼠技術[22-23]、噬菌體展示技術[24-25]、核糖體展示技術[26]、共價展示技術[27]等，但由于這些技術尚未發展成熟，并且傳統的雜交瘤細胞技術具有易于操作、成本低等優點，因而本實驗仍然選用傳統雜交瘤技術。

關于克羅諾桿菌抗體的制備之前已有研究，周鶴峰[28]和汪琳[29]等由于實驗中篩選所用抗原為單株抗原，所得到的抗體并沒有檢測能否實現多株抗原覆蓋。Ishikawa等[30]在制備多抗的過程中，以ATCC 29544免疫新西蘭白兔，檢測所得抗體與ATCC 29544和其他12 株分離菌株的交叉反應性，結果抗體只與免疫菌株和另外1 株分離菌株結合。袁成剛等[31]嘗試用混合免疫的方法進行克羅諾桿菌單克隆抗體的制備，結果所得抗體雖然與多株克羅諾桿菌結合，但也與其他所有陰性菌株有交叉反應。

本實驗首先通過OD600nm比較3 株Cs的生長快慢，選取生長狀態最好的一株菌株免疫小鼠。然后通過不同的免疫劑量優化免疫條件，實驗發現免疫劑量為0.2 mL的一組小鼠反而血清效價最高，這可能是由于過高的免疫劑量會影響小鼠的生長狀態甚至導致小鼠死亡。經過兩次細胞融合之后進行雜交瘤細胞篩選，腹水制備，抗體純化共獲得7 個Cs單克隆抗體，其中2A7能夠和實驗室現有的3 株Cs全交叉，1E9能夠與其中兩株菌交叉。并且除了2A7與乙型副傷寒沙門菌（CMCC（B）50094）有微弱交叉外，7 個抗體與其他相似菌和常見致病菌都沒有交叉反應，這對于免疫分析技術應用于克羅諾桿菌的檢測意義重大。實驗最后還建立了一種間接競爭ELISA檢測方法用于Cs的快速檢測，其檢測限可達到106CFU/mL。

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Preparation of Monoclonal Antibodies against Cronobacter sakazakii and Development of an Indirect Competitive ELISA for Detection of This Bacterium

ZHAI Xuzhao1, ZENG Haijuan1, WANG Guangbin2, DONG Qingli1, XIE Manman1, DING Chengchao1,LIU Wukang1, WANG Shujuan1, LI Jie1, LIU Qing1,*
(1. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Sc ience and Technology, Shanghai 200093, China;2. Xuzhou Lüjian-Dairy Beverage Co. Ltd., Xuzhou 221006, Chi na)

BALB/c mice were immunized with Cronobacter sakazakii type strain ATCC 29004. Seven strains (1E9, 2A7,2D10, 3E5, 5B10, 6E3, and 12A2) of hybridoma cell lines that secreted monoclonal antibodies were prepared by two cycles of cell fusion using hybridoma technique. The titers of 2A7, 2D10, 3E5 and 12A2 reached 1∶256 000, the titer of 6E3 was 1∶128 000, the titer of 5B10 was 1∶64 000 and the titer of 1E9 was 1∶32 000. The results of subtype identifi cation showed that the subtype of 1E9 was IgG1, the subtype of 6E3 was IgG2b, and the subtypes of the other antibodies 2A7, 2D10, 3E5,5B10 and 12A2 were all IgG2a. 2A7 could specifi cally bind to 3 strains of Cronobacter sakazakii (ATCC 29004, ATCC 29544, and ATCC 12868), and 1E9 could specifi cally bind to two of them (ATCC 29004 and ATCC 12868). The results of crossreaction with 11 other similar pathogens showed that 7 antibodies had good specifi city. The sensitivity of indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) using 2A7 reached 106CFU/mL for the detection of Cronobacter sakazakii.

Cronobacter sakazakii; monoclonal antibodies; indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

TS207.4

A

1002-6630（2017）20-0268-05

翟緒昭, 曾海娟, 王廣彬, 等. 阪崎克羅諾桿菌單克隆抗體的制備及其間接競爭-ELISA檢測方法[J]. 食品科學, 2017,38(20): 268-272. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720039. http∶//www.spkx.net.cn

ZHAI Xuzhao, ZENG Haijuan, WANG Guangbin, et al. Preparation of monoclonal antibodies against Cronobacter sakazakii and development of an indirect competitive elisa for detection of this bacterium[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 268-272. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720039. http∶//www.spkx.net.cn

2016-11-03

上海市科委“科技創新行動計劃”長三角科技聯合攻關領域項目（15395810900）；

徐州綠健乳品飲料有限公司“乳制品生產體系致病菌快速檢測”項目（3A15308006）

翟緒昭（1992—），女，碩士研究生，研究方向為食源性致病菌的快速檢測。E-mail：huzhxzh@126.com

*通信作者：劉箐（1970—），男，教授，博士，研究方向為食源性致病菌致病機理、疫苗及快速檢測技術。E-mail：liuq@usst.edu.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720039