PCR法檢測魚及其制品中的魚源性成分

程月花，陸利霞,2,*，李 壹,2，熊曉輝,2，陳曉宇，張一青

PCR法檢測魚及其制品中的魚源性成分

程月花1，陸利霞1,2,*，李 壹1,2，熊曉輝1,2，陳曉宇1，張一青3

（1.南京工業大學食品與輕工學院，江蘇 南京 210009；2.江蘇省食品安全快速檢測公共技術服務中心，江蘇 南京 210009；3.蘇州市食品藥品監督管理局，江蘇 蘇州 215000）

目的：建立一種快速、特異、靈敏的魚源性成分聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測方法。方法：根據魚線粒體基因組12S rRNA中的保守序列設計魚源性特異性引物，進行PCR擴增，建立魚源性成分檢測方法；對24 種魚及雞、牛、羊、豬、鴨、蝦6 種常見的易混于魚制品的動物源性成分進行特異性檢測；將草魚肉混入其他動物肉中，混合均勻后提取DNA進行PCR擴增，確定肉樣水平的檢測靈敏度；將草魚DNA混入其他動物DNA中，以混合后的DNA為模板進行PCR擴增，確定DNA水平的檢測靈敏度。結果：該方法能特異性的對魚源性成分進行快速檢測，檢測靈敏度達0.5%。結論：該方法能對食品中是否含有魚源性成分進行初篩，到達快速檢測的目的，對防止食品摻假、維護消費者利益、規范市場秩序有重要意義。

聚合酶鏈式反應；12S rRNA基因；魚源性成分；檢測；食品

魚及其制品由于其營養價值和獨特的風味深受消費者的喜愛。近年來，我國魚及其制品的產量逐年增高，其中魚糜制品在水產品加工總量中的占比從2009年的5.74%上升至2014年的7.39%[1-2]。與此同時，一些不法商販在經濟利益的驅使下，“以次充好、以假亂真”，在制品中摻雜、摻假，這極大地損害消費者利益和健康，擾亂了市場秩序和發展。我國多部法律法規明文禁止食品的造假摻假行為，但是目前的檢測標準不能滿足實際需求，因此需要建立新的標準彌補不足。魚肉摻假檢測的現有方法大致可以分為5 種：顯微鏡觀察法[3]、免疫學方法[4-5]、紅外光譜方法[6-8]、色譜分析法[9-11]和分子生物學方法[12-19]。顯微鏡觀察法是在組織學特性的基礎上觀察樣品顆粒形態，檢出限低、假陽性率低且熱穩定性好，但是依賴于檢測人員的經驗及肉組織完整性[3]。免疫學方法基于抗原抗體特異性反應，具有靈敏度高、操作簡單、可以實現高通量的特點，但是蛋白質三級結構容易在食品加工過程中受破壞而影響抗體識別[20]。肉類中的蛋白質、碳水化合物、有機酸等化合物含有大量的帶氫基團，紅外光譜法利用帶氫基團在近、中紅外光譜上有倍頻和合頻吸收的性質對肉中的有機物的成分進行檢測，但是紅外光譜分析技術需要針對不同的摻假肉建立不同的模型，工作量大，使用范圍有局限[21]。色譜分析是目前應用最為廣泛的分離檢測技術。肉及其制品中存在的某些蛋白質、肽類和氨基酸因為物種來源不同而存在差異，通過色譜技術的定性、定量分析能夠反映肉類的摻假情況[22]。但是由于肉及其制品中蛋白質含量變化范圍廣、干擾因素多，導致該方法的靈敏度低、容易出現假陽性[23]。此外，該方法對設備、樣品前處理以及試劑的要求較高，限制了色譜技術在肉及其制品源性成分鑒定中的應用。DNA檢測的分子生物學方法是以動物種屬間遺傳信息的差異作為肉種鑒別的檢測靶點，具有特異性高、靈敏度高、不受組織類別限制等優點。相比于蛋白質，DNA的熱穩定性高，即使加工過程中有一定的降解，但是仍能滿足聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）等方法的要求[20]。草魚、鯽魚、鰱魚等常見的魚類占我國魚類總產量的50%以上且常用于魚制品的生產，但目前相關的檢測標準方法不能滿足要求。本實驗通過比對多種魚及多種非魚類動物的線粒體基因序列，選擇種內保守、種間特異的序列設計魚源性成分的特異性引物，旨在建立魚及其制品中魚源性成分PCR檢測方法，為魚及其制品的摻假檢測提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡水魚包括黑魚（Channa argus）、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）、鯽魚（Carassius auratus）、鯉魚（Cyprinus carpio）、鯰魚（Silurus asotus）、河鲀（Takifugu obscurus）、巴沙魚（Pangasius larnaudii）、鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）、鳙魚（Aristichthys nobilis）、羅非魚（Oreochromis niloticus），海水魚包括鮭魚（Salmo salar）、鱈魚（Gadus morhua）、鯧魚（Pampus argenteus）、青占魚（Scomber japonicus）、多寶魚（Psetta maxima）、小黃魚（Larimichthys polyactis）、鱸魚（Lateolabrax japonicus）、鮟鱇魚（Lophius litulon）、金槍魚（Thunnus thynnus）、石斑魚（Epinephelus akaara）、鰻魚（Anguilla japonica）、帶魚（Trichiurus lepturus）、黃蓋鰈魚（Pseudopleuronectes yokohamae）及雞肉、牛肉、羊肉、豬肉、鴨肉、蝦均購自南京當地農貿市場；魚片、魚丸、魚腸、魚罐頭、雞肉火腿腸、豬肉火腿腸等食品均購自南京當地超市。

High Pure PCR Template Preparation Kit 瑞士Roche公司；10×Reaction Buffer、BioReady rTaq、dNTP Mixture 杭州博日技術有限公司；溴化乙錠 國藥集團化學試劑有限公司；DL500 DNA Marker、6×Loading Buffer 寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物合成上海生工生物有限公司。

1.2 儀器與設備

1-14高速離心機 德國Sigma公司；Life Express Thermal Cycler PCR儀、GE-100凝膠電泳儀 杭州博日技術有限公司；Biophotometer D30核酸蛋白測定儀 德國Eppendorf公司；JS-680B全自動凝膠成像儀 上海培清科技有限公司；HH-6數字恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

參照High Pure PCR Template Preparation Kit試劑盒的說明書提取基因組DNA。將提取好的DNA置于-20 ℃保存，待后續PCR擴增使用。

1.3.2 DNA質量濃度及純度的測定

用核酸蛋白測定儀檢測提取的DNA純度（A260nm/A280nm、A260nm/A230nm）及制成質量濃度[24]。純凈的DNA A260nm/A280nm比值在1.8；比值大于1.8考慮為RNA污染，DNA變性或降解；比值小于1.7考慮為蛋白質、酚污染[25]。實驗中所用到的DNA質量濃度在25.1～77.2 ng/μL之間，A260nm/A280nm在1.6～1.8之間。

1.3.3 引物設計

在GenBank中查找我國產量高且常見魚的線粒體基因序列，通過DNAMAN軟件進行序列同源性比較分析，以NC-010288.1為參考序列，選擇同源性較高部分用Primer Premier 5.0設計引物，將設計的各組引物所擴增的目標序列分別與牛、豬、羊等常見畜肉以及雞、鴨、鵝、鴿等常見禽肉已發表的線粒體全基因序列進行比較，選擇種內保守、種間特異的一對引物，同時通過BLAST驗證引物的特異性。

1.3.4 PCR條件和體系

PCR條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；67 ℃退火30 s；72 ℃延伸20 s，共35 個循環；72 ℃延伸5 min；PCR體系（共25 μL）：10×Reaction Buffer 2.5 μL、dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）2 μL、BioReady rTaq 0.2 μL（1 U）、上下游引物（10 μmol/L）各2 μL、模板DNA 5 μL，雙蒸水補足至25 μL。

1.3.5 PCR擴增產物電泳檢測

取6.5 μL PCR擴增產物，加1 μL 6×上樣緩沖液點樣進行瓊脂糖凝膠電泳。電泳所用的瓊脂糖質量分數為1.5%。

1.3.6 基因測序

利用設計的引物進行PCR擴增，將目的片段回收后，送大連寶生物工程有限公司測序。

1.3.7 特異性實驗

選取11 種淡水魚、13 種海水魚及雞、牛、羊、豬、鴨、蝦6 種常見的易混入魚制品的動物肉作為樣品，提取DNA后以此為模板采用建立的PCR方法進行擴增，驗證該方法的特異性。

1.3.8 靈敏度實驗

分別制備DNA水平和肉樣水平混合樣品進行檢測，以考察所建立方法的檢測靈敏度。

1.3.8.1 魚肉樣檢出限

將草魚肉分別與雞、牛、羊、豬、鴨肉混合，制成含魚肉10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%的混合樣后分成兩份，一份新鮮肉樣，一份經過121 ℃處理15 min。提取混合肉樣DNA后，以此為模板，進行PCR擴增。以確定本檢測方法對混合魚肉樣的檢出限。

1.3.8.2 DNA檢出限

將草魚及雞、牛、羊、豬、鴨肉的DNA稀釋到25 ng/μL，然后將草魚DNA分別與雞、牛、羊、豬、鴨的DNA混合，制成含草魚DNA 10%、1%、0.5%、0.1%、0.05%的混合DNA樣。以混合DNA樣為模板，進行PCR擴增，以確定本方法對不同物種混合DNA的檢出限。

1.3.9 市售食品中魚源性成分的檢測

購置市售的配料表中標明含有魚成分的食品樣品30 份；標明具體魚類的食品樣品18 份；配料表中不含魚成分的食品樣品20 份。使用所建立的PCR方法檢測其魚源性成分。

2 結果與分析

2.1 引物設計

通過對GenBank中部分魚線粒體基因序列的同源性比較分析，通過Primer Premier 5.0共設計了11 組引物（表1），將各組引物所擴增的目標序列分別與鴨（NC-022418.1）、鵝（KT427463.1）、雞（NC-007236.1）、蝦（NC-026834.1）、豬（NC-012095.1）、驢（NC-001788.1）、羊（NC-001941.1）、牛（AY526085.1）、鴿（NC-013978.1）和鷓鴣（NC-011817.1）的線粒體全基因序列進行比較，選取引物的3’端和魚源序列完全匹配而與其他非魚類的序列不能互補的一組引物（圖1）。該組引物針對擴增12S rRNA區的一段約98 bp的保守片段。上游引物NC-617/641F：CCTAGAGGAGCCTGTTCTAGAACCG，下游引物NC-693/714R：TTCACAGGGTAAGCTGACGACGG。

表1 本研究PCR的引物Table 1 PCR primer sequences used in this study

圖1 魚源性成分檢測引物NC-617/641F和NCC--669933/714R擴增片段與其他物種線粒體DNA相應片段的相似性比較Fig. 1 Identity comparison between sequences amplifi ed by fi sh specifi c primers (NC-617/641F and NC-693/714R) and corresponding region of mtDNA of other animals

2.2 引物特異性實驗結果

為驗證引物對于魚源性成分的特異性，將11 種淡水魚、13 種海水魚及雞、牛、羊、豬、鴨、蝦6 種常見的易混于魚制品的動物DNA作為模板進行擴增。從圖2可以看出，11 種淡水魚均有特異性擴增條帶，大小約98 bp，與預期大小相符，13 種海水魚中除鯧魚、鰻魚、帶魚外，其他10 種海水魚有特異擴增條帶。表明該引物對于少數魚類無法檢測，使用時具有一定的局限性。從圖3可以看出，雞、牛、羊、豬、鴨、蝦6 種非魚類DNA模板的PCR擴增均為陰性，表明該對引物特異性良好。

圖2 24 種魚類的魚源性成分特異性檢測電泳圖Fig. 2 Specifi c detection of fi sh-derived ingredients from 24 species of fi sh

圖3 6 種非魚類魚源性成分特異性檢測電泳圖Fig. 3 Specifi c detection of six non-fi sh-derived ingredients

2.3 PCR產物測序結果

將部分常見魚類的PCR擴增產物進行純化后送測序公司測序，結果見表2，測序結果進一步證明設計的引物特異性強、準確度高。

表2 部分魚PCR擴增產物測序結果Table 2 Sequencing results of PCR amplifi ed products of DNA extracted from several fi sh species

2.4 方法靈敏度實驗結果

為了確定該方法的混樣檢出限，分別從肉樣水平和DNA水平進行實驗確認。

2.4.1 魚肉樣品檢出限

將新鮮草魚肉按不同比例摻入其他動物肉中，混合后提取DNA進行PCR擴增。從圖4可以看出，草魚肉混合雞肉和牛肉時，該方法檢測魚源性成分的檢出限為0.5%，混合羊肉、豬肉、鴨肉時，該方法檢測魚源性成分的檢出限為0.1%。從圖5可以看出，在對混合肉樣高溫處理（121 ℃處理15 min）后提取DNA進行PCR擴增，其中混合羊肉的樣品檢出限為0.1%，混合雞、牛、豬、鴨的樣品檢出限為0.5%。因此，確定該方法用于混合肉樣檢測魚源性成分時的檢出限為0.5%。

圖4 新鮮肉樣混合水平靈敏性檢測結果Fig. 4 Sensitivity of PCR for detecting mixed fresh meat samples

圖5 經過高溫高壓處理的肉樣混合水平靈敏性檢測結果Fig. 5 Sensitivity of PCR for detecting mixed cooked meat samples

2.4.2 DNA檢出限實驗結果

草魚DNA混合不同動物DNA制成含魚DNA不同質量濃度梯度的DNA混合樣，從圖6可以看出，草魚DNA混合雞、牛、羊、豬、鴨DNA在0.5%水平時，能看到目的擴增條帶。在0.1%水平時，PCR擴增結果均為陰性。因此該方法對DNA混樣的檢出限為0.5%。

圖6 DNA混合水平靈敏性檢測結果Fig. 6 Sensitivity of PCR for detecting mixed DNA

2.5 市售食品中魚源性成分的檢測結果

表3 市售食品中魚源性成分的檢測結果Table 3 Detection of fi sh-derived ingredients in commercial foods

使用本研究建立的PCR方法對市售樣品中的魚源性成分進行檢測。從表3可以看出，在隨機采購的30 種配料表中標明含有魚成分的食品樣品中，27 個樣品檢出陽性，其中3 個標明含有海水魚成分的魚制品檢測結果為陰性，這與所建立的方法特異性實驗中部分海水魚不能檢出的結果一致。配料表中標明含某種魚類的18 個食品樣品均能檢出魚源性成分。配料表中不含魚成分的20 種食品樣品中均未檢出魚源性成分。所采購的食品樣品或出自大型食品制造商或具有完整的魚肉組織，一定程度上避免了食品的摻假，因此可以看出所建立的方法在實際產品的應用中只有少數魚類無法檢出，基本滿足在檢測中進行初篩的要求。

3 討 論

肉制品摻假是主要的食品摻假問題之一，利用PCR方法檢測牛、羊、豬等源性成分的研究已經很成熟[26-28]。然而，目前國內利用PCR方法檢測魚源性成分的研究較少，賀云霞等[29]建立的檢測飼料中魚源性成分的PCR方法能有效檢出鯉魚、鱈魚、鲅魚等10 種魚類，龐杰等[30]建立的檢測飼料中魚源性成分定量檢測的實時熒光PCR技術能有效檢出四大家魚（青魚、草魚、鰱魚、鳙魚）和鯉魚、鯽魚、框鯉、武昌魚、鯰魚，但對石斑魚、鱈魚、鱔魚等不能檢出。國外利用PCR方法檢測魚源性成分的研究主要是針對海洋魚類[31-32]。本研究建立的檢測魚及其制品中魚源性成分的PCR方法特異性強，能檢出的淡水魚類占我國淡水養殖總量的70%以上，能檢出的海水魚類占我國海水魚產量的15%以上[2]，不能檢出所有魚類，這是因為魚類所處的生態環境、繁殖方式各異，遺傳變異方式多樣，采用一對引物特異性檢測所有魚類具有一定的困難[33]，但是可以作為前人建立的PCR方法的補充，進一步擴大檢測魚的種類。我國為當今世界上淡水養殖最為發達的國家之一以及考慮到國人的飲食習慣，魚制品多采用產量高且廉價的淡水魚類，因此本方法適用于檢測大多數魚制品中的魚源性成分。

所建立的食品中魚源性成分PCR檢測方法的靈敏度較高，無論是肉樣混合還是DNA混合均可做到0.5%水平而SB/T 10379—2012《速凍調制食品》中規定魚類速凍調制食品的命名中應含主料不小于8%[34]，該方法的檢出限滿足要求，可對食品標簽的真實性進行監控，從而保障消費者的權益和健康，維護市場秩序，同時為魚制品中魚源性成分檢測方法的標準化提供了依據。

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Establishment of PCR Method for Detection of Fish-Derived Ingredients in Fish and Fish Products

CHENG Yuehua1, LU Lixia1,2,*, LI Yi1,2, XIONG Xiaohui1,2, CHEN Xiaoyu1, ZHANG Yiqing3
(1. College of Food Science and Light Industry, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, China;2. Jiangsu Public Technical Service Center for Rapid Detection of Food Safety, Nanjing 210009, China;3. Suzhou Food and Drug Administration, Suzhou 215000, China)

Objective∶ To establish a rapid, specifi c and sensitive polymerase chain reaction (PCR) method for the detection of fi sh-derived ingredients. Methods∶ A set of primers was used to selectively amplify a short DNA fragment of the fi sh mitochondrial 12S rRNA gene. The specificity was evaluated by analyzing 24 kinds of fish as well as meat, poultry and shrimp, commonly added in fish products. The sensitivity was evaluated by amplifying DNA extracted from grass carp mixed with meat from other animal species. Results∶ The method established could specifically detect fish-derived ingredients with a sensitivity of 0.5%. Conclusion∶ This PCR method is a rapid, sensitive and specifi c method for preliminary screening of fi sh-derived ingredients in foods, and is of important signifi cance to safeguard the interests of consumers and standardize the market order.

polymerase chain reaction (PCR); 12S rRNA gene; fi sh-derived ingredients; detection; food

Q789

A

1002-6630（2017）20-0279-07

程月花, 陸利霞, 李壹, 等. PCR法檢測魚及其制品中的魚源性成分[J]. 食品科學, 2017, 38(20)∶ 279-285. DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720041. http∶//www.spkx.net.cn

CHENG Yuehua, LU Lixia, LI Yi, et al. Establishment of PCR method for detection of fi sh-derived ingredients in fi sh and fi sh products[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 279-285. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720041. http∶//www.spkx.net.cn

2016-09-21

江蘇省科技廳重點研發計劃項目（BE20160803）；蘇州市科技支撐計劃項目（SS201427）

程月花（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：chengyuehua7@163.com

*通信作者：陸利霞（1972—），女，副教授，博士，研究方向為食品安全與檢測。E-mail：lixialu@njtech.edu.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720041