ELISA法在乙肝兩對(duì)半測(cè)定中的質(zhì)量控制分析

張艷秋

【摘要】 分析酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)乙型肝炎（乙肝）兩對(duì)半的檢驗(yàn)步驟， 總結(jié)檢測(cè)全程的相關(guān)影響因素。檢測(cè)前標(biāo)本的準(zhǔn)備、試劑盒的影響、檢驗(yàn)人員的業(yè)務(wù)水平、檢測(cè)過(guò)程中的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程、檢測(cè)結(jié)果的解讀等是ELISA法檢測(cè)乙肝兩對(duì)半的相關(guān)影響因素。ELISA法是檢測(cè)乙肝兩對(duì)半的靈敏方法， 嚴(yán)格遵循操作規(guī)程， 加強(qiáng)質(zhì)量控制， 可有效排除相關(guān)影響因素的干擾， 為乙肝的臨床診療提供有力依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 乙肝兩對(duì)半；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)；質(zhì)量控制

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.28.115

我國(guó)的乙肝病毒目前感染率大概占到總?cè)巳旱?0%～

70%， 這其中乙肝表面抗原攜帶人群占總?cè)丝诘?%左右， 以此計(jì)算， 全國(guó)約有9300萬(wàn)人攜帶乙肝病毒， 其中慢性乙肝患者約2000萬(wàn)例[1-3]。乙肝兩對(duì)半作為現(xiàn)階段臨床診斷、治療乙型病毒性肝炎及觀察療效的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)， 主要使用ELISA進(jìn)行檢測(cè)， 其靈敏度高， 但在其檢測(cè)過(guò)程中影響因素較多， 易導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果[4]。因此在實(shí)際工作中， 臨床實(shí)驗(yàn)診斷過(guò)程中需要加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)管理， 不斷強(qiáng)化檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)流程， 加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室診斷的質(zhì)量控制， 為患者提供準(zhǔn)確的檢驗(yàn)結(jié)果， 有利于疾病的早期診斷和治療， 同時(shí)減少醫(yī)患糾紛等問(wèn)題。

1 檢測(cè)前的質(zhì)量控制

1. 1 標(biāo)本的準(zhǔn)備 檢測(cè)前應(yīng)該保證標(biāo)本無(wú)溶血現(xiàn)象， 因?yàn)槿苎獙?dǎo)致紅細(xì)胞破裂后會(huì)將體內(nèi)過(guò)氧化物酶活性物質(zhì)釋放，這種過(guò)氧化物酶活性物質(zhì)會(huì)和顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)， 影響顯色比對(duì)；患者血塊完全收縮也可能致使待檢標(biāo)本中的非特異性活性物質(zhì)出現(xiàn)部分或者完全失活的情況發(fā)生[1]， 尤其是在血液標(biāo)本尚沒(méi)有完全凝固的狀態(tài)下， 若強(qiáng)行對(duì)血清進(jìn)行分離處理會(huì)導(dǎo)致纖維蛋白塊形成， 極易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性。此外患者基本信息的核對(duì)也是標(biāo)本準(zhǔn)備質(zhì)量控制中至關(guān)重要的一步。

1. 2 試劑盒的影響 選擇的試劑盒， 其質(zhì)量是保證實(shí)驗(yàn)診斷結(jié)果準(zhǔn)確性、特異性的必要前提。但需要臨床檢驗(yàn)人員注意的是， 目前市場(chǎng)上不同廠家的試劑盒在特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性以及特異性存在一定差異， 因此在實(shí)際操作過(guò)程中， 要求試劑盒保存在4℃左右的環(huán)境下， 并且需在測(cè)定前將試劑盒放置于室溫進(jìn)行平衡處理約0.5～1.0 h[5]。此外檢測(cè)結(jié)果也會(huì)因方法學(xué)不同而有所差異。例如實(shí)際工作中常存在用ELISA法檢測(cè)乙肝表面抗原（HBsAg）結(jié)果為陰性， 而電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。除方法學(xué)的靈敏度外，還存在使用單克隆或多克隆抗體試劑的差別。單抗對(duì)變異抗原或亞型乙肝標(biāo)志物檢測(cè)存在一定差異。

1. 3 檢驗(yàn)人員的業(yè)務(wù)水平 檢驗(yàn)人員的業(yè)務(wù)水平對(duì)檢測(cè)結(jié)果同樣會(huì)造成重大影響。實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員需要掌握并嚴(yán)格執(zhí)行乙肝兩對(duì)半檢測(cè)過(guò)程中的室內(nèi)、室間質(zhì)量控制方法， 以及失控處理原則。檢驗(yàn)人員同時(shí)還需要熟悉本實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)操作流程， 掌握乙肝兩對(duì)半各項(xiàng)指標(biāo)的臨床意義[2]， 同時(shí)需要學(xué)會(huì)正確使用加樣器和測(cè)定儀器等。

2 檢測(cè)過(guò)程中的質(zhì)量控制

2. 1 加樣 加樣槍的準(zhǔn)確性和吸頭清潔與否可以直接影響檢測(cè)結(jié)果， 所以檢測(cè)過(guò)程中必須嚴(yán)格按照操作規(guī)程執(zhí)行加樣。加樣器需經(jīng)常清洗， 定期校準(zhǔn)。放置溫育箱前， 必須使用振蕩器將所加樣本震蕩混勻>30 s[6]。

2. 2 溫育 標(biāo)本加入板孔后， 由于酶標(biāo)板周圍與內(nèi)部孔升降溫速率不同， 抗原抗體結(jié)合及酶促反應(yīng)都容易產(chǎn)生邊緣效應(yīng)， 導(dǎo)致檢測(cè)孔周邊與內(nèi)部結(jié)果出現(xiàn)差異。尤其實(shí)驗(yàn)室干育易出現(xiàn)周邊效應(yīng)， 反應(yīng)板周邊孔中間孔溫度出現(xiàn)差異， 這會(huì)使得檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性直接受升溫速度影響[3]。因此為了使反應(yīng)孔底部均勻升溫， 實(shí)際操作過(guò)程中常使用水育的方法， 并且盡量保證整版溫度快速地達(dá)到平衡，以此減少相應(yīng)的誤差。

2. 3 洗板 洗板作為ELISA法操作過(guò)程中一個(gè)重要環(huán)節(jié)， 其目的是將未結(jié)合的抗原或抗體、酶標(biāo)記物復(fù)合物中分離出來(lái)以保留抗原抗體復(fù)合物， 同時(shí)還能將非特異性吸附的纖維蛋白原、白蛋白、細(xì)菌中酶類物質(zhì)等干擾物除去。檢測(cè)中每一次均應(yīng)使用新鮮蒸餾水或去離子水來(lái)稀釋洗滌劑， 這樣可以防止因?yàn)橄礈煲何廴径霈F(xiàn)結(jié)果誤差[7]。此外洗板機(jī)針小孔極易由于血清中殘留的纖維蛋白或洗滌液析出的結(jié)晶導(dǎo)致阻塞， 使得未結(jié)合標(biāo)記酶不能徹底洗脫。所以在使用洗板機(jī)過(guò)程中需要定時(shí)觀察、檢查洗板機(jī)針孔通暢與否， 如出現(xiàn)堵塞時(shí)需及時(shí)糾正， 洗板機(jī)暫停工作時(shí)應(yīng)采用蒸餾水清冼數(shù)遍。

2. 4 顯色 顯色是采用ELISA法測(cè)定乙肝兩對(duì)半過(guò)程的最后一個(gè)步驟， 其原理是通過(guò)適當(dāng)溫育使反應(yīng)孔內(nèi)酶標(biāo)物質(zhì)催化底物生成有色產(chǎn)物， 以間接判定待測(cè)物含量。光線、溫度及溫育時(shí)間等均影響顯色效果。通常底物顯色在37℃、時(shí)間在10～40 min內(nèi)可以徹底完成[8]， 因?yàn)樵诠庹諚l件下底物液會(huì)自行變色， 所以最后的顯色反應(yīng)該在避光狀態(tài)下進(jìn)行。

3 檢測(cè)結(jié)果解讀的質(zhì)量控制

在終止液加入后10 min內(nèi)應(yīng)完成實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷，以避免反應(yīng)孔出現(xiàn)結(jié)晶反應(yīng)而影響酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果。臨床檢驗(yàn)人員需要有極高的責(zé)任心和對(duì)工作負(fù)責(zé)的態(tài)度，保證檢測(cè)試劑質(zhì)量、效期。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中， 外部質(zhì)控血清需要按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行嚴(yán)格管理， 所有復(fù)檢標(biāo)本均需詳細(xì)記錄復(fù)檢原因、時(shí)間、結(jié)果。

人體血清中含有非特異性干擾物質(zhì)，在不同程度地影響ELISA檢測(cè)結(jié)果， 如纖維蛋白原、補(bǔ)體、類風(fēng)濕因子、嗜異性抗體等。此外某些藥物也會(huì)對(duì)結(jié)果判讀造成一定誤差， 如高效價(jià)乙肝免疫球蛋白， 這種物質(zhì)會(huì)與HBsAg形成抗原抗體復(fù)合物， 導(dǎo)致HBsAg的檢出誤差[9]。

4 臨床意義

①檢測(cè)結(jié)果提示HBsAg陽(yáng)性， 提示該患者已經(jīng)感染乙肝病毒，但是這項(xiàng)結(jié)果并不反映病毒是否存在復(fù)制及病毒復(fù)制程度， 也無(wú)法提示是否存在傳染性。②乙肝病毒表面抗體 （HBsAb）是人體內(nèi)乙肝中和抗體的標(biāo)志，其陽(yáng)性提示患者對(duì)乙肝病毒存在抵抗， 可以防御乙肝感染。針對(duì)乙肝疫苗接種的檢查者，如果僅有HBsAb陽(yáng)性，應(yīng)作為乙肝疫苗接種后出現(xiàn)的正常現(xiàn)象。③乙肝病毒e抗原（HBeAg）是人體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制的標(biāo)志， 如果若HBeAg持續(xù)陽(yáng)性>3個(gè)月， 則表示疾病可能有慢性化趨勢(shì)， 應(yīng)該及時(shí)治療。④乙肝病毒e抗體（HBeAb）是乙肝病毒在體內(nèi)復(fù)制停止的標(biāo)志檢查，表示病毒復(fù)制在逐步減少，傳染性較弱。⑤乙肝病毒核心抗體（HBcAb），提示檢查者曾經(jīng)感染， 或正在感染乙肝病毒， 免疫球蛋白（Ig）M抗體， 提示患者新近感染或病毒正在復(fù)制，在患者感染后體內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生，對(duì)于乙肝臨床診斷的輔助檢查有一定意義。

臨床經(jīng)常使用的術(shù)語(yǔ)：大三陽(yáng)， 即：HBsAg、HBeAg、HBcAb出現(xiàn)陽(yáng)性， 往往提示患者體內(nèi)乙肝病毒復(fù)制活躍、存在一定傳染性， 但“大三陽(yáng)”是否會(huì)引起嚴(yán)重肝細(xì)胞損害， 還要視肝功能檢查、臨床體征而定， 諸多研究文獻(xiàn)都已經(jīng)證明“大三陽(yáng)”并非表示疾病很嚴(yán)重， 只是HBsAg、HBeAg、HBcAb指標(biāo)陽(yáng)性體現(xiàn)乙肝病毒在機(jī)體內(nèi)即時(shí)的免疫狀態(tài)[10]。另外一個(gè)臨床術(shù)語(yǔ)：小三陽(yáng)， 是指HBsAg、HBeAb、HBcAb出現(xiàn)陽(yáng)性， 當(dāng)出現(xiàn)“小三陽(yáng)”時(shí)， 還需要結(jié)合乙肝病毒復(fù)制情況進(jìn)行分析， 病毒陽(yáng)性小三陽(yáng)， 也會(huì)對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行損傷， 也需要進(jìn)行治療[11]。

乙肝是當(dāng)前嚴(yán)重危害人們身心健康的常見(jiàn)傳染病之一， 也是醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的一項(xiàng)難題，血清兩對(duì)半檢測(cè)對(duì)乙肝的臨床診斷、治療方案選擇、康復(fù)監(jiān)測(cè)及療效判定均能起到一定指導(dǎo)作用， 目前乙肝兩對(duì)半的常用檢測(cè)方法為 ELISA法[4]。但在檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)本前處理、加樣、洗板及顯色等都可以影響ELISA法測(cè)定結(jié)果，如不注意， 極易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果， 影響患者疾病診斷和病情進(jìn)展。因此在實(shí)際操作過(guò)程中， 檢驗(yàn)人員應(yīng)嚴(yán)格按照操作程序，保證檢測(cè)系統(tǒng)在控， 以及實(shí)驗(yàn)室濕度、溫度符合檢測(cè)要求， 設(shè)立陰陽(yáng)對(duì)照及臨界值，以嚴(yán)謹(jǐn)、認(rèn)真、負(fù)責(zé)的工作態(tài)度對(duì)待每一份標(biāo)本，對(duì)檢測(cè)結(jié)果存有疑議的標(biāo)本應(yīng)予以復(fù)查并做詳細(xì)記錄，杜絕假陽(yáng)性及假陰性結(jié)果的產(chǎn)生， 保證檢測(cè)質(zhì)量，為患者提供準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果。

參考文獻(xiàn)

[1] 岳化葵.酶聯(lián)免疫吸附法與定量聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)乙肝兩對(duì)半測(cè)定的比較分析. 臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2008， 7（11）：73.

[2] 劉燦， 陳靜， 李雯. 化學(xué)發(fā)光法與ELISA法對(duì)乙肝兩對(duì)半少見(jiàn)模式測(cè)定的比較分析. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)， 2007， 11（12）：1680- 1681.

[3] 解殿清， 瞿靜. ELISA法乙肝兩對(duì)半定性檢測(cè)影響因素探討. 中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用， 2010， 4（11）：74-75.

[4] 黃波，廖常貴.乙肝兩對(duì)半兩種檢測(cè)方法的比較.國(guó)際檢驗(yàn)學(xué)雜志， 2009， 30（2）：165-167.

[5] 黃波， 張國(guó)元. ELISA法檢測(cè)乙肝兩對(duì)半中兩種判斷結(jié)果的探討. 川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2003， 18（1）：112-113.

[6] 石伍華， 王海清， 許艾明，等. 熒光定量PCR檢測(cè)HBV-DNA與ELISA方法測(cè)定乙肝五項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性分析. 臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志， 2009， 8（1）：87-88.

[7] 黃道連. ELISA法檢測(cè)乙型肝炎兩對(duì)半影響因素分析與對(duì)策. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床， 2007， 4（8）：758-759.

[8] 羅通行， 李萍， 嚴(yán)可寧. ELISA法與MEIA法測(cè)定人血清乙肝五項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果分析. 華西醫(yī)學(xué)， 2003， 18（2）：238.

[9] 韋平宣. TRFIA與ELISA法檢測(cè)乙肝病毒血清學(xué)標(biāo)志物的分析與比較. 廣西醫(yī)學(xué)， 2006， 28（8）：1173-1175.

[10] 楊笑瓊， 何海洪， 楊秀珠，等. ELISA法和MEIA法測(cè)定乙肝病毒血清標(biāo)志物的比較研究. 北方藥學(xué)， 2014（2）：16-17.

[11] 薛春楊， 周建波. ELISA法乙肝兩對(duì)半檢測(cè)影響因素分析和臨床意義. 中國(guó)誤診學(xué)雜志， 2011， 11（16）：3913-3914.

[收稿日期：2017-06-06]