基于SNAP-25表達的腎虛質大鼠突觸可塑性實驗研究?

孫理軍，孫耀光，孫瑜嬬，張 琪，劉熙如，柏云飛

(陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046)

【實驗研究】

基于SNAP-25表達的腎虛質大鼠突觸可塑性實驗研究?

孫理軍，孫耀光，孫瑜嬬，張 琪，劉熙如，柏云飛

(陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046)

目的：通過大鼠海馬突觸相關蛋白-25(SNAP-25)的表達，揭示腎虛質致突觸可塑性降低的分子生物學機制。方法：通過“貓嚇鼠”造模法恐嚇受孕母鼠，待產子后繼續恐嚇仔鼠，從而建立先天不足、后天失養復合型腎虛質仔鼠模型。補腎藥物左、右歸丸治療3個月后，Morris水迷宮檢測仔鼠學習記憶能力，ELISA法測定海馬單胺類神經遞質去甲腎上腺素(NE)含量，免疫組化法檢測SNAP-25蛋白表達。結果：Morris水迷宮：模型組潛伏期、總路程、首次穿越目標區時間較空白組長，左、右歸丸組較模型組改善；NE含量：模型組較空白組降低，左、右歸丸組較模型組升高；SNAP-25表達，模型組較空白組降低，左、右歸丸組較模型組上調。結論：腎虛質仔鼠突觸可塑性能力減退與SNAP-25表達相關，補腎藥物左、右歸丸具有改善和提高作用。

腎虛質；SNAP-25；突出可塑性

腎虛體質以腎中精氣虛損、臟腑機能低下為主要特征，是臨床常見的體質類型之一。中醫理論認為“腎藏志”(《素問·宣明五氣》)、腎“在志為恐”(《素問·陰陽應象大論》)、“腎虛則智不足”(《醫學新悟》)，驚恐可致腎精虧虛、學習記憶能力減退。大量研究表明[1-4]，學習記憶能力的獲取與鞏固與突觸可塑性相關。SNAP-25是突觸前膜蛋白，參與神經遞質的調節與釋放、囊泡與細胞膜的融合對接，并具有選擇性剪接異構體的能力，是構成及改變突觸可塑性的關鍵蛋白。本實驗選取SNAP-25作為研究目標，從而探討腎虛質與突觸可塑性能力降低的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級12周齡SD大鼠雄性5只，雌性10只(體質量300～350 g)，購于西安第四軍醫大學實驗動物研究中心(生產許可證SCXK(陜)2014-001)，標準飼料進食及飲水、室溫喂養。3月齡雄性土貓1只鮮活小鼠喂養。

1.2 實驗材料

左歸丸(河南宛西制藥股份有限公司，國藥準字Z41020696)、右歸丸(河南宛西制藥股份有限公司，國藥準字Z41022170)；Morris水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所)；大鼠NE ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；SABC免疫組化SNAP-25兔抗試劑盒、生物素化羊抗兔二抗、DBA顯色試劑盒、PBS磷酸鹽緩沖液(均購自博士德生物)；OCT包埋劑、水合氯醛、多聚甲醛、液氮(均購自勇毅試劑公司)；電子天平、高速勻漿器(XHF-D)、酶標儀(美國Molecular Devices公司SpectraMax5)、冰凍切片機、顯微鏡、特質鼠籠、貓籠等。

2 方法

2.1 分組與造模[5]

大鼠適應性飼養1周，10只雌鼠隨機分成恐嚇組6只、正常組4只，分別與雄鼠合籠交配。成功受孕后恐嚇組孕鼠置于特質鼠籠，每日早9∶00至晚21∶00于貓籠旁被恐嚇，同時在貓籠內放置鮮活小鼠令其捕食，使孕鼠在旁觀望并處于恐慌狀態直至產子；正常組孕鼠不予恐嚇自然分娩。待2組所產仔鼠4周齡時，將正常組孕鼠所產仔鼠隨機8只作為空白組，將恐嚇組母鼠所產仔鼠隨機24只分為腎虛質組、腎虛質左歸丸干預組(以下簡稱“左歸丸組”)、腎虛質右歸丸干預組(以下簡稱“右歸丸組”)，每組各8只，繼對此3組仔鼠繼續進行土貓恐嚇，持續4周。

2.2 給藥及計量

按文獻折算[6]，大鼠用藥量約為成人的6.25倍。左歸丸成人服生藥量18 g/d，則大鼠生藥量為1.875 g/kg/d，蒸餾水配置成1.875 g/mL混懸液備用。右歸丸成人服生藥量9 g/d，則大鼠生藥量為0.9 375 g/kg/d，蒸餾水配制成0.9 375 g/mL混懸液備用。對仔鼠恐嚇同時開始灌胃，藥物組給予制備好的混懸液，空白組給予等量生理鹽水10 mL/kg/d，每日1次，每周用藥5 d停2 d，連續3個月。

2.3 水迷宮訓練

圖1 各組仔鼠游動搜索策略統計結果(單位：次)

各組仔鼠8周齡時進行Morris水迷宮訓練，歷時7 d，每日下午15∶00進行。第1天仔鼠自由游動120 s適應環境；第2～6天學習訓練：仔鼠在水中尋找平臺并停留15 s；若120 s 后仍未找到平臺則引導登臺并停留15 s；訓練完成后迅速將小鼠擦干放回鼠籠；每日訓練4次，每次間隔30 min。第7天測試，檢測并記錄各組仔鼠4次游泳的平均路程(cm)、潛伏期(s)、首次穿越目標區時間(s)。

2.4 神經遞質含量測定

末次給藥1 h后斷頭處死，冰上迅速剝離海馬，4 ℃生理鹽水沖洗、濾紙吸干水分，稱重后置液氮凍存。制備10%海馬組織勻漿，3000 r/min 離心5 min取上清，參照ELISA試劑說明書，酶標儀450 nm處測定NE含量。

2.5 免疫組化檢測

末次灌胃結束后禁食12 h稱重，7%水合氯醛腹腔麻醉(0.5 ml/100 g)，4%多聚甲醛灌注固定，冰上取海馬PBS沖洗5 min×5次，30%蔗糖溶液4 ℃冰箱脫水過夜PBS沖洗5 min×5次，OCT包埋、過液氮，冰凍切片(切片厚度為30 μm)室溫靜置1 h；切片置入甲醇新鮮配置0.3%雙氧水室溫封閉20 min， PBS沖洗5 min×3次；滴加5%BSA封閉液，室溫避光孵育30 min；棄液滴加稀釋的一抗4 ℃冰箱過夜，次日取出復溫后PBS沖洗5 min×5次；滴加二抗，室溫孵育2 h， PBS沖洗5 min×3次；避光滴加DAB顯色，室溫避光顯色30 min，PBS沖洗5 min×3次，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，干燥后光鏡下拍照。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 仔鼠學習記憶能力變化

表1顯示,潛伏期、總路程、首次穿越目標區時間方面，腎虛質組長于空白組和左、右歸丸組(P<0.01)；與腎虛質組比較，左、右歸丸組潛伏期、總路程、首次穿越目標區時間降低(P<0.01)；左、右歸丸2組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組仔鼠Morris水迷宮參數比較

注：與空白組比較:△P<0.05,△△P<0.01；與腎虛質組比較:*P<0.05,**P<0.01

圖1顯示，游動搜索策略統計結果顯示，腎虛質組隨機性搜索策略遠高于空白組、左歸丸組和右歸丸組，提示腎虛質仔鼠游動時目標性不明確，常出現無目的徘徊；而在目的明確、方向定位較高級的邊緣性、直線性、趨向性搜索策略中，腎虛質組均低于其余3組。

3.2 海馬NE含量與SNAP-25表達變化

表2顯示，NE含量腎虛質組較空白組下降(P<0.05)，左、右歸丸組較腎虛質組升高(P<0.05)，左、右組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。分析比較各組仔鼠海馬區SNAP-25光密度值發現，腎虛質組表達低于空白組和左、右歸丸組(P<0.01)，空白組略高于左、右歸丸組，但3組間比較差異不明顯(P>0.05)。

圖2顯示，光鏡下觀察，空白組仔鼠海馬錐體層神經元細胞數目多，免疫組化染色深，細胞排列整齊、緊密；腎虛質組神經元細胞數目減少，細胞染色淺，細胞排列疏松、紊亂，細胞間隙增大；左歸丸組與右歸丸組神經元細胞較腎虛質組數目增多，染色較深，細胞變化趨于空白組。

表2 各組仔鼠NE含量與SNAP-25表達比較

注：與空白組比較:△P<0.05，△△P<0.01；與腎虛質組比較:*P<0.05，**P<0.01

圖2 各組仔鼠SNAP-25蛋白表達(免疫組化染色 ×200)

4 討論

學習和記憶過程由大腦控制完成，以神經元間的信息傳導為基礎，以突觸的可塑性為表現形式。突觸的可塑性已被公認為是構成學習與記憶的重要神經化學基礎，而不斷地學習和記憶行為又可形成新的神經回路，從而反向增強突觸的可塑性。通過對大鼠進行水迷宮學習記憶訓練，使其海馬內突觸數量、突觸小泡數量或體積增加、突觸活性區膜面積增大等一系列形態化學變化，構建加強其腦內神經突觸的可塑性及大腦皮層的發達度。

腎藏精、精生髓、腦由髓聚，故腦髓的生成與發育依賴于腎中精氣的充盈[7]，只有保證腦有所養、元神精湛，才能學習不止、記憶不怠。臨床上，學習記憶能力的減退是腎虛質的主要表現，也是中醫腎藏志理論的重要體現[8]。本實驗基于腎虛體質的生理病理特點，結合大量實驗研究，以中醫“腎藏志、在志為恐”為理論指導，從分子機制角度探究腎虛質與突觸可塑性的相關性。

SNAP-25(Synaptosomal-associated protein 25 kDa)作為突觸相關蛋白，參與組成神經突觸囊泡，與樹突、軸突、突觸小體的發育密切相關[9-11]。同時，SNAP-25還可通過提高突觸小泡蛋白與突觸融合蛋白間的親和力，增強突觸末梢神經遞質的釋放能力[12-15]，從而進一步加強突觸的可塑性，提高學習記憶能力。單胺類神經遞質NE對學習記憶具有維持作用，能增強腦內突觸的傳入，從而促進信息的存儲和再現，因此腦內NE含量的變化可直觀反映出學習記憶物質基礎的改變。

實驗結果顯示，Morris水迷宮訓練中，腎虛質大鼠潛伏期、總路程、首次穿越目標區時間較其他各組延長滯后，較其他各組游動緩慢，常出現無目的的徘徊游動，甚者120 s內無法完成登錄水中平臺任務；游動搜索策略統計結果顯示，腎虛質組更傾向采用隨機性搜索，而空白組及左、右歸丸組則較多采用目的明確、方向定位較高級的直線型、邊緣性、趨向性搜索策略。同時，腎虛質組腦NE含量較正常組降低，腦海馬SNAP-25含量亦顯著低于其他各組。通過補腎藥物左、右歸丸干預治療后，腎虛質仔鼠學習記憶能力明顯上調，腦內NE含量與SNAP-25表達均有所增加。實驗結果證明，腎虛質造成突觸可塑性表達降低的分子機制與腦內SNAP-25的含量變化密切相關；補腎藥物具有改善和提高的作用，且2種補腎藥物效果平齊，均對腎虛體質具有正面調節作用，進一步說明腎虛質主要表現為腎精虛的生理狀態。

此次實驗證明，先天不足、后天失養的復合型腎虛質模型符合中醫情志致病的病因學原理和中醫腎藏象理論，具有操作的可行性，同時為腎虛體質差異性的生物學基礎提供了實驗依據，且為臨床干預亞健康狀態的形成以及臨床治療記憶行為能力障礙性疾病，尤其是老年性疾病的發生提供了科學有效的理論依據。

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ExperimentalStudyonSynapticPlasticityinRatswithKidneyDeficiencyBasedonSNAP-25expression

SUN Li-jun, SUN Yao-guang, SUN Yu-ru, ZHANG Qi, LIU Xi-ru, BAI Yun-fei

(ShaanxiUniversityofTCM,Shaani,Xianyang712046,China)

Object: Through the experimental study about expression of hippocampal synapse associatec protein-25 of rats with kidney-deficiency constitution, to discuss the molecular biology mechanism of decreased synaptic plasticity due to kidney-deficiency constitution. Method: Used the way of “cat scare rat” to scare pregnat rats. After they gave birth to a child, their offsprings got on being scared to built composite ratesl with deficiency and acquired dystrophy. Then kidney reinforcing drugs gave treatment for 3 months, Morris water maze tested offsprings’ study and learning capacity and immunohistochemical method tested their expression of SNAP-25.Results: Morris water maze test: The incubation period, total distance and the first time through target area of model group were longer than blank group, while in ZuoGui pill and YouGui pill groups, these indexes were better than model group;The change of neurotransmitter NE content: Compared with the blank group, the NE content in model group was reduced. Compared with the model group, the NE content in ZuoGui pill and YouGui pill group was increased;Expression of SNAP-25: The expression in model group decreased than blank group; but compared with model group, it increased when kidney reinforcing drugs was given.Conclusion: The decreased synaptic plasticity is related with the expression of SNAP-25, and it can be improved by the kidney reinforcing drugs.

Kidney-deficiency constitution; SNAP-25; Synaptic plasticity

R285.5

B

1006-3250(2017)09-1217-03

陜西省重點實驗室研究項目(15JS026)-基于腎藏志理論的腎虛體質大鼠海馬區學習記憶蛋白Caveolin-1表達的研究

孫理軍(1961-)，女，陜西咸陽人，教授，醫學碩士，碩士研究生導師，從事中醫體質理論的實驗及臨床應用研究。

2017-03-19