翻白草對大鼠潰瘍性結腸炎的藥效及作用機制研究?

裴玲燕，張純芳，劉偉志，柯愈詩，王 琳

(中央民族大學中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學研究院，北京 100081)

【實驗研究】

翻白草對大鼠潰瘍性結腸炎的藥效及作用機制研究?

裴玲燕，張純芳，劉偉志△，柯愈詩，王 琳

(中央民族大學中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學研究院，北京 100081)

目的：研究翻白草對大鼠潰瘍性結腸炎的藥效作用，并探討翻白草治療UC的可能分子機制。方法：采用三硝基苯磺酸-乙醇灌腸法復制潰瘍性結腸炎(UC)大鼠模型，實驗分為空白對照組、模型對照組、柳氮磺吡啶組、翻白草低、中、高劑量組6組。連續(xù)給藥14 d后水合氯醛麻醉，取病變結腸組織石蠟包埋、切片、染色后鏡下觀察，剩余結腸組織采用western blot方法分別檢測TLR4及NF-κBP65。結果：DAI指數(shù)及病理形態(tài)變化表明，與空白組比較模型組差異有統(tǒng)計學意義，翻白草低劑量組治療效果最佳；與空白組比較模型組大鼠結腸組織NF-κBP65表達水平顯著增加，翻白草給藥組均能下調NF-κBP65的表達水平。結論：翻白草能通過調控NF-κBP65表達水平以發(fā)揮對UC的治愈作用。

翻白草；潰瘍性結腸炎；藥效；TLR4；NF-κBP65

翻白草(PotentilladiscolorBunge)通常生長于海拔800～1850 m的荒地、山谷、溝邊、山坡草地、草甸及樹林，屬于薔薇科多年生草本植物，主要分布于云南、四川、陜西、東北、華北、華東和中南等地。翻白草是涼山彝族人民長期使用的一種常用藥物，在當?shù)匾驼Z稱之為“瓦子納子”。翻白草味甘、微苦、性平，歸肝、胃、大腸經(jīng)，具有清火解毒、祛風除濕、消腫止痛、涼血止血的功效，彝醫(yī)將其用于治療急慢性腹瀉、瘧疾、痢疾、瀉痢便血、風濕痛等疾病[1]。本實驗通過觀察翻白草對大鼠潰瘍性結腸炎的藥效作用及對大鼠結腸組織TLR4、NF-κBP65表達水平的影響，為研究翻白草抗?jié)冃越Y腸炎的機制提供基礎實驗數(shù)據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠，體質量(200±10) g，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心(許可證號SCXK-(軍)2012-0004)，常規(guī)飲食，適應性飼養(yǎng)7 d。

1.2 藥材與試劑

翻白草采自四川涼山彝族自治州，經(jīng)中央民族大學中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學研究院朱丹教授鑒定為薔薇科翻白草(PotentilladiscolorBunge)全草；柳氮磺吡啶(上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號09130714)；TLR4-antibody(Santa公司，貨號sc-293072);NF-κBP65-antibody(Immunoway公司，貨號YM3111)；GAPDH鼠單抗(Immunoway公司，貨號YM3029)；三硝基苯橫酸(TNBS，sigma公司)。

1.3 實驗儀器

酶標儀(BIO-TEK公司)，Elx800洗板機(BIO-TEK公司，Elx50)；高速離心機(上海安亭科學儀器廠，TGL-16B干燥箱(日本三洋，MIR-153型)；低溫冰箱(日本三洋，MDF-382E型)；恒溫水浴箱(江蘇太倉醫(yī)用儀器廠，DSHZ-300型)；分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司，AL104型)。

2 方法

2.1 分組與模型制備

選取Wistar大鼠80只，體質量(190～210) g，雌雄各半。腹腔注射10%水合氯醛(0.2 ml/100 g)將大鼠麻醉、固定。將外徑2.0 mm、長約15 cm的輸液管(輸液管先用液體石蠟油潤滑)，從大鼠肛門逆行插入結腸內深約8.0 cm處，一次性將100 mg/kg TNBS和50%乙醇的TNBS/乙醇液0.25 ml注入大鼠結腸內，用棉簽堵住大鼠肛門，輕揉大鼠腹部l min，使TNBS/乙醇液均勻地與大鼠結腸黏膜接觸。對照組用同樣方法，0.25 ml生理鹽水灌腸。3 d后隨機選取5只大鼠處死剪取直腸和結腸組織，清洗后肉眼觀察結腸組織，并取腸段(10%甲醛溶液中固定)做組織切片以確定造模是否成功。

2.2 分組及給藥

實驗分為空白組、模型組、柳氮磺吡啶組、翻白草水煎劑高、中、低劑量組，造模成功后給予灌胃治療14 d，換算成大鼠體質量后每日給藥量分別為翻白草水煎劑低劑量組1.6 g/kg、中劑量組3.2 g/kg、高劑量組6.4 g/kg、柳氮磺吡啶組3.6 g/kg，空白組及模型組給予溶媒灌胃。表1顯示，給藥期間對大鼠疾病活動指數(shù)(Disease active index，DAI)進行評分。

表1 DAI評分標準

2.3 大鼠結腸組織病理切片制作

末次給藥后次日10%水合氯醛腹腔注射麻醉，取病變部位結腸組織用4%甲醛溶液固定、脫水、石蠟包埋、切片，厚度為5 μm，然后進行脫蠟和復水及蘇木精伊紅(HE)染色。

2.4 大鼠結腸組織TLR4、NF-κBP65蛋白表達檢測

動物常規(guī)處死解剖取結腸，剪取新鮮潰瘍組織加入RIPA裂解液，低溫環(huán)境下研磨成組織勻漿液；低溫下，利用超聲波粉碎儀對組織勻漿液進行超聲，工作10 s，間隔 30 s，30 個循環(huán)；4 ℃、10000 r·min-1離心 20 min取上清。BCA 法進行蛋白定量后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｖ苽銼DS-PAGE膠，將蛋白轉到PVDF膜上，轉移膜置于奶粉封閉液中封閉2 h：加一抗孵育2 h，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光試劑發(fā)光，膠片曝光、顯影定影。掃描圖像，凝膠圖像分析軟件分析條帶積分值。以各細胞因子及其受體蛋白條帶的積分值與β-actin的比值作為蛋白表達量。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 DAI評分

表1顯示，UC模型復制成功后，按表1進行DAI評分。給藥第1天至第10天，模型組DAI值趨于穩(wěn)定，第11天開始模型組DAI值呈下降趨勢，說明大鼠本身具有一定自愈能力；翻白草高、中、低劑量組DAI值始終處于下降趨勢，表明翻白草對UC模型大鼠的潰瘍有較好的治療效果(圖1)。

圖1 DAI評分結果

3.2 病理學形態(tài)變化

圖2 各組大鼠結腸病理組織學觀察

低倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組腸壁四層結構明顯，大腸腺排列規(guī)則；模型組潰瘍明顯且潰瘍面積較大，腸壁四層結構不明顯，其中黏膜層和黏膜下層中有豐富的炎癥細胞；陽性藥組結腸四層分層明顯，黏膜固有層、黏膜下層甚至肌層可見大量彌散淋巴細胞；高劑量組結腸四層分層明顯，大腸腺排列整齊；中劑量組結腸四層結構分層明顯，在黏膜下層可見較大淋巴小結，大腸腺部分擴張；低劑量組腸壁四層結構明顯，大腸腺排列整齊，但在黏膜下層和黏膜固有層可見大量彌散的炎癥細胞。高倍鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組腸壁黏膜層三層結構完整；模型組結腸潰瘍處有豐富的炎癥細胞，潰瘍邊緣大腸腺排列紊亂，腺體擴張；陽性藥組結腸大腸腺排列紊亂，腺體擴張，黏膜固有層有較多炎癥細胞存在；高劑量組結腸黏膜層三層結構明顯，在黏膜固有層有豐富的彌散淋巴細胞，黏膜下層可見一淋巴細胞團存在；中劑量組結腸黏膜固有層有大量淋巴細胞存在，腺體輕度擴張；低劑量組結腸黏膜層三層分層明顯，腺體排列整齊，但黏膜固有層和黏膜下層有許多彌散淋巴細胞和中性粒細胞存在。

3.3 各組大鼠結腸組織TLR4、NF-κBP65蛋白表達變化

與模型組比較，空白組結腸組織NF-κBP65的表達差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；翻白草低、中、高劑量組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，柳氮磺吡啶組比較差異無統(tǒng)計學意義。與模型組比較，TLR4的表達與各組比較差異無統(tǒng)計學意義。

表2 TLR4、NF-κBP65蛋白表達水平比較(灰度比值

注：與模型組比較:*P<0.05，**P<0.01

圖3 蛋白表達水平注：1.空白組；2.模型組；3.陽性藥組；4.低劑量組；5.中劑量組；6.高劑量組

4 討論

翻白草(PotentilladiscolorBunge)又名雞距草、天青地白、雞腿兒、鴨腳參、雞腳草，為薔薇科(Rosaceae)植物翻白草的帶根全草，因葉下發(fā)白被命名為“翻白草”[2]。使用時采摘全草，除去泥沙雜質、洗凈，切成段曬干后在通風干燥處收藏備用。李時珍云：“翻白，以葉之形名；雞腿、天藕，以根之味名也。楚人謂之湖雞腿，淮人謂之天藕。[3]”《本草綱目》《救荒本草》《現(xiàn)代實用中藥》等古籍均有記載。翻白草味甘、微苦、性平，歸肝、胃、大腸經(jīng)，具有止血止痢、清火解毒、祛風除濕、消腫止痛、涼血止血、降低血糖的功效。近年來，廣泛用于治療糖尿病，彝醫(yī)將其用于治療瘧疾、痢疾、瀉痢便血、癰腫瘡毒、風濕痛和月經(jīng)不調等疾病[1]。本實驗據(jù)此研究翻白草對大鼠潰瘍性結腸炎的治療作用，并初步探究其作用機制。潰瘍性結腸炎屬于炎癥性腸病, 其病因和發(fā)病機制尚不明確, 可能是多種因素共同作用的結果。有研究發(fā)現(xiàn)，促炎因子如IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IFN、TNF等, 抗炎因子如IL-4、IL-10、IL-13等均與潰瘍性結腸炎的發(fā)病及病程進展有關[4]。NF-κB是一種具有多向轉錄調節(jié)作用的轉錄因子, 參與眾多炎癥反應相關基因的轉錄調控。NF-κB最常見的形式是由 p50 和 p65 亞單位組成的異二聚體，p65 亞單位是主要的促炎單位, 其活化在UC發(fā)病中起關鍵作用, 許多與 UC 相關的促炎細胞因子都存在NF-κB 結合位點[5-6]。其活化可以控制各種促炎因子的基因轉錄, 因此它對潰瘍性結腸炎發(fā)病機制的研究具有重要意義。炎癥性腸病患者結腸上皮細胞和巨噬細胞中的NF-κB可被活化。本實驗發(fā)現(xiàn)，翻白草給藥組可抑制轉錄因子NF-κB的表達，而HE染色及DAI評分結果表明，翻白草給藥組可有效緩解UC模型大鼠的腹瀉便血癥狀，改善其活動性，并對潰瘍性結腸炎結腸黏膜有一定的修復作用。由此推測，翻白草是通過抑制轉錄因子NF-κB的表達，調控炎癥因子網(wǎng)絡，從而改善大鼠潰瘍性結腸炎的癥狀，具體細胞作用通路需進一步的實驗驗證。Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)[7-8]是重要的介導腸黏膜先天防御反應的介質，在維持腸黏膜和腸道微生態(tài)穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)13種TLRs(TLR1-13)。TLRs是以模式識別受體(patterns recognition receptors，PRR)的方式識別微生物抗原，不同TLRs識別不同的配體。有研究[9]表明，TLR/MyD88(髓樣分化因子)信號通路可調控下游核轉錄因子，調控UC細胞因子水平，從而介導免疫炎癥反應，導致UC發(fā)生。MyD88信號傳導途徑是TLR信號傳導的共同通路(TLR3除外)，TLR1-9均能通過MyD88途徑完成信號傳導。本實驗對照組及給藥組TLR4表達水平均未發(fā)生顯著變化，可能與TNBS誘導的炎癥性腸病模型并未產(chǎn)生TLR4相關識別配體有關，而NF-κB信號傳導途徑為TLR/MyD88信號通路的傳導途徑之一。本實驗NF-κB發(fā)生顯著變化，可能是其他TLRs受體參與完成TLR/MyD88-NF-κB信號通路，需進一步實驗驗證。

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StudyontheEffectandMechanismofPotentillaDiscoloronUlcerativeColitisinRats

PEI Ling-yan, ZHANG Chun-fang, LIU Wei-zhi△, KE Yu-shi, WANG Lin

(InstituteofChineseMinorityTraditionalMedicine,MinzuUniversityofChina,Beijing100081,China)

Objects: To study the pesticide effectiveness of Potentilla discolor Bunge on treating ulcerative colitis(UC) rats, and to explore the molecular mechanism of Potentilla discolor Bunge in the treatment of UC. Methods: The UC rats were induced by trinitrobenzene sulfonic acid-ethanol enema. The rats were divided into six groups: blank control group, model control group, sulfasalazine group, low potentilla discolor, Middle and high dose groups. After 14 consecutive days, chloral hydrate was used to make the rats narcotized and colonic tissue was embedded in paraffin,serially cut and stained for microscopic observation. TLR4 and NF-κBP65 in the remaining colon tissue were detected by western blot. Results: Compared with the blank control group, the DAI index and pathological morphologic change in the model group were significantly different. The therapeutic effect in low-dose group was the best. Compared with the blank control group, the expression of NF-κBP65 was significantly increased in the model group. All the Potentilla discolor Bunge groups could down regulate the NF-κBP65 expression level. Conclusion: Potentilla discolor Bunge could exert its effect on UC by regulating the expression level of NF-κBP65 in UC rats.

PotentilladiscolorBunge; UC; Pharmacological function; TLR4; NF-κBP65

R574.62

B

1006-3250(2017)09-1238-03

中央高校基本科研業(yè)務費資助項目(2015MDQN15)-基于腸黏膜屏障損傷修復的彝藥翻白草抗UC藥效評價及作用機制研究

裴玲燕(1989-)，女(朝鮮族)，黑龍江牡丹江人，在讀博士，從事民族醫(yī)藥開發(fā)研究。

劉偉志(1981-)，男(回族)，吉林長春人，高級工程師，醫(yī)學博士，從事民族醫(yī)藥開發(fā)研究，Tel：010-68939942。

2017-03-17