電針對類風濕關節炎大鼠口服雷公藤甲素藥動學及肝損指標的影響?

肖 燕，張皓然，陳 昊，顧一煌，洪漢青

(南京中醫藥大學第二臨床醫學院，南京 210023)

【針灸研究】

電針對類風濕關節炎大鼠口服雷公藤甲素藥動學及肝損指標的影響?

肖 燕，張皓然，陳 昊，顧一煌△，洪漢青

(南京中醫藥大學第二臨床醫學院，南京 210023)

目的：為電針聯合雷公藤甲素(triptolide，TPL)治療類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)，同時減輕TPL所致的肝損提供增效減毒的實驗依據。方法：RA模型采用弗氏完全佐劑(freund’s complete adjuvant，CFA)建立，運用液相色譜-質譜聯用技術(liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)檢測大鼠血漿TPL濃度，試劑盒測定肝勻漿中谷氨酸-丙酮酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)含量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)活性。結果：針藥組大鼠足趾腫脹改善情況最好，藥物組次之，再者為電針組；在同一時刻電針刺“足三里”后的血藥濃度高于單獨口服TPL的濃度，TPL的藥動學參數：達峰時間(Tmax)提前，峰濃度(Cmax)及藥時曲線下面積(area under the curve，AUC)提高；針藥組ALT、AST含量及MDA活性均較藥物組降低，SOD活性則升高。結論：電針“足三里”可以減輕RA大鼠足趾腫脹，提高TPL的血藥濃度，進而提高其生物利用度，同時還可減輕TPL對RA大鼠肝組織的損傷，提高其抗氧化應激能力。

電針；類風濕關節炎；雷公藤甲素；藥動學；液相色譜-質譜聯用

類風濕關節炎(RA)是一種病因未明、慢性進行性、侵蝕性的全身性疾病，以關節和關節周圍組織非化膿性炎癥為主要表現，其早期治療至關重要[1]。現代藥理研究證實，TPL在抑制免疫炎癥反應、抗腫瘤和抗生育等方面發揮著重要作用[2]，但TPL中毒劑量和有效劑量非常接近[3]，因此其應用受到極大限制。本研究旨在探討電針對RA大鼠口服TPL的藥動學及TPL致RA大鼠肝損傷的ALT、AST、MDA指標及抗氧化指標SOD的影響，為電針結合TPL治療RA及同時減輕TPL所致的肝損提供增效減毒的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物造模及分組 7周齡SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質量(180±20) g共50只，購自上海斯萊特實驗動物有限責任公司(動物許可證號2007000523799)，適應性喂養7 d。按照隨機數字表法抽取10只作為空白對照，另40只根據相關文獻[4]，取經消毒后的左側后肢足墊皮內注射0.l ml CFA建造RA模型。按隨機數字表法將RA大鼠分為模型組、電針組、藥物組和針藥組各10只，飼養室溫為20～25 ℃，相對濕度控制在50%～60%。

1.1.2 主要試劑及儀器 CFA由Sigma公司提供(生產批號F5881)；YLS-7B足趾容積測量儀由河北邢臺潤聯科技開發有限公司提供；潑尼松龍標準品、TPL標準品由上海惠誠生物科技有限公司提供；乙酸銨、甲酸、甲醇及乙酸乙酯由南京化學試劑有限公司提供；5810R冷凍離心機由德國Eppendorf生產，上海普林斯頓生物科技發展有限公司提供；SHIMADZΜ LC-20A高效液相色譜儀:LC-20AD泵2個、SIL-20AC自動進樣器、CTO-20AC柱溫箱、CBM-20A控制器由日本島津液相色譜儀公司提供；4000 Q TRAP質譜儀由美國AB Sciex公司提供；AST、ALT測定試劑盒由世諾臨床診斷制品上海貿易有限公司供給(生產批號J022、J027)；MDA、SOD測定試劑盒由南京建成生物工程研究所供給(生產批號20150915、20150918)。

圖1 大鼠血漿中雷公藤甲素標準曲線

1.2 方法

1.2.1 足趾體積測量 采用足趾容積測量儀測量RA大鼠足趾體積。具體操作：自大鼠踝關節上畫一標記線，以該線為標記，將大鼠足趾沒入水中，水平面與該線平齊，測量足趾體積。每只大鼠每個足趾分別由2人各測量2次，取平均值記錄數據，連續觀察4周。

1.2.2 干預方法 用自制的鼠架俯臥位固定電針組大鼠，用0.25 mm×25 mm華佗牌毫針針刺雙側“足三里”(取穴參照《實驗針灸學》[5])，進針直刺2～3 mm，平補平瀉1 min，將電針儀的導線接到針柄上，給予連續波刺激(頻率為1 Hz/s)，強度1～2 mA(以雙下肢輕微抖動為度)，每天1次，每次20 min，電針干預結束后給予0.9%氯化鈉水溶液(1.17×10-2mol/L)灌胃；藥物組每天給予等量的TPL溶液(7.208×10-2mol/L)灌胃；針藥組先給予與電針組相同的電針刺激，再給予同藥物組等量的TPL溶液灌胃。于同一時間給予空白組、模型組以與其他組相同方式的抓取固定,并給予等量0.9%氯化鈉水溶液灌胃，共干預14 d。

1.2.3 液相色譜-質譜檢測條件 參照相關文獻[6]設立高效液相色譜-質譜條件，色譜條件為色譜柱：Thermo BDS HYPERSIL C18(100 mm×2.1 mm, 2.4 μm)Part No. 28102-102130，45 ℃柱溫，流動相：2 mmoL乙酸銨+0.5‰，甲酸∶甲醇(VV=55∶45)，流速為0.2 mL/min；質譜條件為電噴霧離子源(Turbo Spray)，多級反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)，正離子模式，Turbo Gas Temperature(TEM)：550 ℃；Auxiliary Gas(GS2)：30 psi，Nebulizing Gas(GS1)：30 psi，Curtain Gas(CUR)：10 psi，Ion Spray Voltage(IS)：5500 V。

1.2.4 樣品采集與處理 分別于給藥后5 min、10 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min、180 min、240 min、360 min采集藥物組和針藥組大鼠的眼眶靜脈血。將10 μL內標液(7.2088×10-7mol/L潑尼松龍)加入100 μL空白大鼠血漿中，渦旋30 s混勻，加入1ml乙酸乙酯，渦旋混勻3 min，以轉速為12000 r/min(rcf)在高速冷凍離心機離心10 min，4℃取800 μL上清液真空濃縮揮干，用100 μl流動相溶解，以20000 rcf的轉速在高速冷凍離心機離心10 min，取60 μL上清液，20 μL進樣進行LC-MS分析。將色譜峰面積代入回歸方程，即求得各時間點大鼠血漿中的TPL濃度。

1.2.5 線性關系考察 圖1顯示，將7.2088×10-7mol/L的潑尼松龍10 μL加入100 μL大鼠空白血漿中，再分別加入濃度為9.01×10-11、1.802×10-10、3.604×10-10、1.802×10-9、7.208×10-9、1.802×10-8mol/L的TPL系列標準溶液各20 μL，按上述“1.2.4”項方法操作，每個濃度取樣5份，分析并記錄樣品峰和內標峰面積，用樣品濃度C對樣品峰和內標峰面積的比值A作線性回歸，得回歸方程y=0.0785x+0.0361，r=0.9969(權重W=1/C2)，TPL在9.01×10-11-1.802×10-8mol/L濃度范圍內線性良好。

1.2.6 日內與日間精密度 表1顯示，將空白血漿分別配制3個不同濃度(0.5、5、40 ng/ml)的質量監控樣品，每個濃度取樣5份，共分析3個批次，與標準曲線同批依法進行測定，以同批標準曲線計算樣品濃度及批內、批間的相對標準偏差(RSD)，結果表明日間精密度和日內精密度變異均小于5%。

1.2.7 提取回收率及樣品穩定性考察 表2顯示，各取5份上述不同濃度的樣品，將空白樣品中添加被測物并經樣品處理后的檢測信號與血漿處理后加藥相應濃度標準液的檢測信號進行對比，計算得3個濃度的提取回收率分別為(94.2%±1.7、97.3%±4.1、89.7%±4.5)。仍取上述樣品各5份，在室溫穩定性、長期及凍融的不同條件下觀察其穩定性，結果表明在-20 ℃下保存30 d、室溫放置24 h及反復凍融3次的條件下，大鼠血漿中的TPL都具有良好的穩定性(RSD<15%)。

表1 TPL在大鼠血漿中日間、日內精密度比較

表2 TPL在大鼠血漿中的短期、室溫和凍融穩定性

1.2.8 肝標本采集與指標檢測 處死大鼠，取肝組織置于-80 ℃冰箱中保存，制備勻漿液，采取酶聯免疫吸附測定法(Elisa)測定肝組織勻漿中ALT、AST含量及SOD、MDA活性，均嚴格按照試劑盒規定操作。

2 結果

2.1 足趾體積

表3顯示，足趾體積反映了RA大鼠的足趾病變程度。

表3 各組大鼠足趾體積比較

注：與模型組比較：*P<0.05；與電針組比較：ΔP<0.05；與藥物組比較：■P<0.05

表3顯示,各組大鼠足趾體積治療前比較差異無統計學意義(P>0.05)，說明各組足趾腫脹程度具有可比性。治療14 d后，電針組、藥物組、針藥組的足趾體積與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)，針藥組與電針組、藥物組比較差異有統計學意義(P<0.05)，說明藥物組、電針組及針藥組的足趾腫脹程度均較模型組減輕，且療效最好的為針藥組，藥物組次之，再次為電針組。

2.2 各時間點血藥濃度

表4顯示，干預14 d后按“樣品采集與處理”中的方法取各時刻大鼠血漿，通過LC-MS測得給藥后不同時間點的血藥濃度如下。

表4顯示，TPL在大鼠體內吸收較快，藥物組在給藥后10 min左右出現吸收峰，而針藥組在給藥后5 min左右出現吸收峰，2組120 min時血藥濃度均低于檢測低限。經統計學分析，藥物組和針藥組各時間點血藥濃度比較差異有統計學意義(P<0.05)。可得出結論，針藥組在上述各時間點的血藥濃度高于藥物組，電針提高了RA大鼠體內的血TPL濃度。

表4 藥物組和針藥組各時間點血TPL濃度比較

注：與藥物組比較:*P<0.05(NA為低于檢測低限)

2.3 藥動學參數

表5圖2顯示，運用DAS2.0計算得出藥物組和針藥組的藥動學參數并繪制出AUC。

表5 藥物組和針藥組藥動學指標

注：與藥物組比較：*P<0.05

圖2 藥物組和針藥組TPL的AUC比較

表5圖2顯示，藥物組和針藥組的AUC變化趨勢大體相似，在10 min即達到Cmax，初始血TPL濃度急驟下降，而后速度減緩，360 min后低于檢測低限。經DAS2.0分析，電針可以影響TPL在模型大鼠體內的藥動學過程：(1)經LC-MS檢測，電針“足三里”后的血TPL濃度在同一時間點高于單獨口服TPL的濃度，差異有統計學意義(P<0.05)，說明電針可提高同一時間點的血漿TPL濃度；(2)電針“足三里”提前了TPL的Tmax，并提高其Cmax及AUC，差異有統計學意義(P<0.05)，說明電針可提高單位時間血TPL濃度，進而提高其生物利用度。

2.4 ALT、AST含量和SOD、MDA活性

表6顯示，針藥組肝組織勻漿液中的ALT、AST含量及MDA活性均較藥物組降低，而SOD活性則升高(P<0.05)。

表6 藥物組與針藥組ALT、AST含量及SOD、MDA活性比較

注：與藥物組比較:*P<0.05

3 討論

現代研究表明，電針聯合藥物能夠在一定程度上拮抗藥物毒副作用，提高藥物生物利用度，促進藥物的靶向運動，電針能很好地減輕RA的免疫炎癥反應，并能一定程度地抑制TPL對RA的肝毒性。

本研究顯示，針藥組大鼠足趾腫脹改善情況最好，且電針提升單位時間血TPL濃度、Cmax及AUC，提升TPL的生物利用度，其機制可能與電針增強胃電活動[7]或調控RA的炎癥信號傳導通路[8]有關，這可作為今后進一步研究的切入點。此外，電針還降低肝組織的ALT、AST含量及MDA活性，升高SOD活性，說明電針減輕TPL所致的肝損害，有助于肝功能恢復[9]和提高肝組織的抗氧化能力。該實驗結果也對臨床電針結合TPL治療RA提供了參考性意義，即在臨床治療RA時可將電針與低劑量TPL“足三里”配合干預，提高TPL的生物利用度，節省藥物成本；另一方面也提示，TPL劑量應用較大時需慎用電針，以防電針引起血TPL濃度過高而對機體肝、腎、心等多個臟器造成毒性損害。本研究結果為動物藥理學和毒理學研究及針藥結合治療RA的安全性和有效性(最佳給藥途徑、給藥間隔時間)提供重要的理論依據，但存在分組較少、動物樣本量不足、實驗過程欠規范化、穴位選擇及操作手法差異性等不足。故實驗研究應服務于臨床，針對“足三里”的臨床功效還需進一步深入研究，通過對比觀察不同穴位的療效，從而為電針結合TPL治療RA開辟一條新的增效減毒路徑。

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ImpactsofPharmacokineticsandLiverDamageIndexesofElectroacupunctureonRheumatoidArthritisRatswithTakingTriptolideOrally

XIAO Yan, ZHANG Hao-ran, CHEN Hao, GU Yi-huang△, HONG Han-Qing

(SecondClinicalMedicalSchool,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Objective: Observe the effect of electro-acupuncture combined with triptolide(TPL)on the digits swelling of rheumatoid arthritis(RA) rats, and influence of electroacupuncture to pharmacokinetic parameters and Liver damage indexes: aspartate aminotrans ferase(ALT)、aspartate aminotransferase(AST)、superoxide dismutase(SOD)、malondialdehyde(MDA) of RA rats with taking TPL orally, which displays the effects of efficacy enhancing and toxicity reducing for TPL-induced liver injury and provides experimental basis for clinical RA treatment of electroacupuncture combined with TPL. Methods:Building RA rats by using freund’s complete adjuvant(FCA);Using liquid chromatography-mass spectrometry to detect the TPL concentration in the plasma, and liver homogenate was prepared to detect the content of ALT、AST and the activity of SOD and MDA by enzyme-linked immuno sorbent assay (Elisa) kit. Results:The improvement situation of digits swelling of RA rats in the electroacupuncture combined with TPL group was best, the drug group followed, and electroacupuncture group came in last;TPL’s concentration in the electroacupuncture combined with TPL group was higher than that in the drug group at the same time, Tmaxin advance, the peak concentration(Cmax) of TPL and area under the curve(AUC) increased, too;Combined with drug group, the content of ALT、AST and the activity of MDA in the electroacupuncture combined with TPL group decreased, the activity of SOD increased. Conclusions: Electroacupuncture at “Zusanli(ST36)” not only can alleviate the digits swelling of RA rats, improve the blood TPL concentration and bioavailability, but also can reduce the liver injury of RA rats caused by oral TPL, and improve the organic ability to resist oxidative stress.

Electroacupuncture; Rheumatoid arthritis(RA); Triptolide(TPL); Pharmacokinetics; Liquid chromatography-mass spectrometry(LC-MS)

R245.9+7

B

1006-3250(2017)09-1284-04

國家自然科學基金面上項目(81674063)-不同時間窗電針干預抗心肌缺血再灌注損傷的自噬相關機制研究;南京中醫藥大學國家基金預研基金項目(14XYY07)

肖 燕(1988-)，女，廣西梧州人，在讀碩士，從事艾灸對運動疲勞的防治研究。

顧一煌(1965-)，男，江蘇南通人，教授，從事中醫藥對運動疲勞的防治研究，Tel：025-85811683,E-mail:gyh5196411@163.com。

2017-02-10