刺老苞根皮含藥血清對原代成骨細胞增殖、分化和礦化功能的影響?

依香叫，王松月，李金誠，燕夢云，裴凌鵬

(中央民族大學，北京 100081)

【方藥研究】

刺老苞根皮含藥血清對原代成骨細胞增殖、分化和礦化功能的影響?

依香叫，王松月，李金誠，燕夢云，裴凌鵬△

(中央民族大學，北京 100081)

目的：研究不同濃度刺老苞根皮含藥血清對原代成骨細胞的增殖、分化及礦化功能的影響。方法：SPF級健康雌性SD 大鼠(80 只)給予蒸餾水、刺老苞根皮水煎劑高、中、低3種劑量濃度，連續灌胃7 d制備含藥血清。各組含藥血清干預培養成骨細胞，采用微量酶標法檢測堿性磷酸酶活性、茜素紅染色鈣化結節并計數，流式PI單染法檢測成骨細胞周期。結果：在干預培養后與模型對照組比較，各劑量組堿性磷酸酶活性、鈣化結節數有所升高，中、高劑量組高于模型對照組；與模型對照組比較，流式細胞儀檢測發現各劑量組G0/G1期、G2/M期明顯下降，S期和G2/M+S期明顯升高。結論：刺老苞根皮含藥血清可通過延長原代成骨細胞S期，促進其增殖、分化及礦化功能的作用。

刺老苞根皮；原代成骨細胞；堿性磷酸酶；礦化結節；成骨細胞周期

土家族藥刺老苞根皮為五加科楤木屬植物楤木(Aralia echinocaulis Hand.Mazz)及其變種白背葉楤木(Aralia chinensis L. var.nuda Nakai)的根皮或莖皮，藥材片狀或槽狀，氣微香，嚼之帶黏液性，味辛性平，歸肝腎經，功能滋陰補腎、祛風濕、壯筋骨、散瘀血、消腫毒，可用于風濕痹痛、跌打損傷、骨折等治療[1-3]。經大量體內實驗及臨床數據證明，刺老苞根皮能促進骨折愈合[5-9]。現通過刺老苞根皮含藥血清干預原代成骨細胞來觀察其對成骨細胞增殖、分化及功能的影響，以進一步研究其作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

新生24 h SD大鼠乳鼠10只。SPF級健康雌性SD 大鼠80 只，3 月齡，體質量(270±20) g，中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供(許可證號SCXK-(軍)2012-0004)。

1.2 藥物

刺老苞根皮采于湖北恩施地區(經北京中醫藥大學生藥系楊瑤珺教授鑒定，批號0P1101)，湖北恩施中藥材有限公司。

1.3 主要試劑

α-MEM培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶溶液(美國Gibco)，青霉素/鏈霉素、茜素紅、II 型膠原酶、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸(美國Sigma)，PBS 磷酸鹽緩沖液(粉劑，北京昌盛生物技術有限責任公司)，堿性磷酸酶試劑盒(微量酶標法，南京建成科技公司)，PI/RNase Staining Buffer(美國BD Pharmingen公司)。

1.4 主要儀器

細胞超凈操作臺(蘇州蘇潔凈化設備有限公司)，CO2培養箱(美國Thermo Scientific)，電腦型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)，流式細胞儀(美國BD公司)。

2 方法

2.1 刺老苞根皮含藥血清制備與分組

2.1.1 刺老苞根皮含藥血清制備 SPF級健康雌性SD大鼠80 只適應性喂養1周后，通過在脛骨上打孔模擬骨折二期愈合的理想力學環境。術后第2天用SPSS軟件按隨機數字表法分為模型組、刺老苞根皮低劑量組、刺老苞根皮中劑量組、刺老苞根皮高劑量組4組各20只。用藥劑量根據人體習用安全劑量(20 g·70 kg-1)，按人/鼠表面積比率換算等效計量法計算。刺老苞根皮灌胃劑量為1.8 g·kg-1·d-1，以臨床劑量為中劑量，1/2、2倍劑量為低、高劑量(即分別為0.9 g·kg-1·d-1、3.6 g·kg-1·d-1)。模型組給予等劑量等頻率蒸餾水，術后7 d取材(取材前進食12 h)，末次給藥后1 h稱重，3%戊巴比妥鈉(3 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，在無菌操作下腹主動脈采血，將采集來的血樣在室溫下靜置2 h后，1800 r·min-1離心20 min，分離出血清，56 ℃水浴滅活30 min，在0.22 μm微孔膜過濾除菌后分裝，保存于-20 ℃備用。

2.1.2 分組 實驗共分為4組：模型對照組(20% 模型對照組大鼠血清+α-MEM+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+50 μg·mL-1抗壞血酸)、低劑量組(20% 刺老苞低劑量含藥血清+α-MEM+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+50 μg·mL-1抗壞血酸)、中劑量組(20% 刺老苞中劑量含藥血清+α-MEM+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+50 μg·mL-1抗壞血酸)、高劑量組(20% 刺老苞高劑量含藥血清+α-MEM+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+50 μg·mL-1抗壞血酸)。

2.2 原代成骨細胞培養及鑒定

取新生24 h內的SD大鼠乳鼠10只，放入75%乙醇浸洗乳鼠，將乳鼠轉移到一個有蓋培養皿內，在無菌操作下分離顱骨，清除顱骨表面的結締組織，用PBS簡單沖洗顱蓋骨后放入15 mL離心管內，加入3 mL 0.25%胰蛋白酶液-II型膠原酶溶液(1∶2)(消化液)，37 ℃恒溫水浴振蕩消化5 min棄上清液。加入3 mL消化液，37 ℃恒溫水浴振蕩消化10 min，收集上清液并重復消化4次。將收集的消化液1500 r·min-1離心4 min棄上清液，重懸細胞，調整細胞密度后接種于25 cm2培養瓶。培養24 h后，換成骨細胞分化培養基(10% FBS+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+50 μg·mL-1抗壞血酸)，每3 d換液1次，待細胞融合50%～70%后消化并傳代，取3～6代細胞進行試驗，經ALP(alkaline phosphatase堿性磷酸酶)染色和茜素紅染色鑒定成骨細胞。

2.3 微量酶標法堿性磷酸酶活性實驗

收集第3代原代成骨細胞，以1×105個·mL-1接種于24孔板，每孔1 mL，每組設3個復孔，每2 d換液1次，并每天觀察細胞狀態。培養48 h后按實驗分組更換不同含藥血清培養基。分別于0 h、24 h、48 h、72 h、96 h用微量酶標法檢測ALP活性(參照堿性磷酸酶微量酶標法說明書操作)。

2.4 茜素紅染色法檢測細胞礦化功能實驗

收集第3代原代成骨細胞，以1×105個·mL-1接種于24孔板，每孔1 mL，每組設3個復孔，每2 d換液1次，并每天觀察細胞狀態。培養48 h后按實驗分組更換不同含藥血清培養基，10 d后取出24孔板，用PBS沖洗3遍，每孔加入2 mL 4%多聚甲醛固定15 min，蒸餾水沖洗3遍，每孔加入2 mL茜素紅染液，放置于37 ℃、45 min后蒸餾水沖洗3遍，用熒光倒置顯微鏡拍照并計數鈣化結節數量。

2.5 流式PI單染法檢測細胞周期實驗

收集第3代原代成骨細胞，以1×105個·mL-1接種于6孔板，每孔2 mL，每組設3個復孔，每天觀察細胞狀態。培養48 h后按實驗分組更換不同含藥血清培養基，干預培養48 h后，0.25%胰蛋白酶消化并收集細胞，用預冷PBS(1×)沖洗2遍后，邊振蕩邊加預冷70%乙醇，存放于4 ℃、24 h后加入PI/RNase Staining Buffer染液0.5 mL，室溫下孵育15 min，上流式細胞儀檢測并分析結果。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 原代成骨細胞的鑒定結果

圖1顯示，原代成骨細胞用成骨細胞完全培養基(含10% 胎牛血清)在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。經倒置顯微鏡觀察，細胞在24 h后開始貼壁，48 h后完全貼壁，細胞為單核，呈長梭形和多角形等形態，10 d左右細胞融合成鋪路石樣，并伴有礦化結節的出現。

3.2 堿性磷酸酶活性檢測結果

表1顯示，不同濃度刺老苞根皮含藥血清在0～96 h期間干預成骨細胞并用微量酶標法檢測ALP活力。結果顯示，與模型對照組比較，48 h、72 h中劑量組ALP活力高于模型對照組(P<0.05)，96 h中劑量組ALP活性明顯升高(P<0.01)，48～96 h高劑量組ALP活性明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。

圖1 原代成骨細胞培養及鑒定

組別例數ALP(金氏單位/100ml)0h24h48h72h96h對照組30.095±0.0060.102±0.0100.169±0.0120.201±0.01500.231±0.014低劑量組30.095±0.0060.109±0.0140.198±0.0150.235±0.01700.269±0.020中劑量組30.095±0.0060.121±0.0170.279±0.017*0.328±0.0180*0.391±0.020**高劑量組30.095±0.0060.124±0.0160.339±0.017**0.398±0.1020**0.433±0.023**

注：與模型對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

3.3 成骨細胞礦化功能檢測結果

表2顯示，不同濃度含藥血清對成骨細胞作用10 d后，經茜素紅染色后計數鈣化結節的個數。結果顯示，與模型對照組比較，低劑量組鈣化結節數增多且差異有統計學意義(P<0.05)，中劑量組和高劑量組的礦化結節數明顯增多且差異有統計學意義(P<0.01)。

表2 不同濃度含藥血清對成骨細胞礦化的影響

注：與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

表3 不同濃度含藥血清對成骨細胞周期的影響

注：與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01

3.4 成骨細胞周期檢測結果

表3顯示，經過流式細胞儀檢測發現，成骨細胞的細胞周期G0/G1期與模型對照組比較，各劑量組都有不同程度的降低，其中中劑量組、高劑量組降低，差異有統計學意義(P<0.01)；成骨細胞的細胞周期G2/M期與模型對照組比較，各劑量組均有所降低，其中中劑量組、高劑量組降低，差異有統計學意義(P<0.05)；成骨細胞的細胞周期S期與模型對照組比較，各劑量組均有所升高，差異有統計學意義(P<0.01)；成骨細胞的細胞軸系G2/M+S期與模型對照組比較，各劑量組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。

4 討論

土家族是我國的主要少數民族之一，主要分布于我國黔、湘、渝、鄂相鄰的武陵山、大婁山、大巴山、巫山余脈，這些地區地勢險峻陡峭、崎嶇不平，給土家族人民的生產生活帶來極大的不便，加之以前戰事頻繁，常有毒蛇出沒，造成金創、骨折外傷出現較多，使土家醫在骨傷科疾病的治療用藥方面積累了大量的寶貴經驗。土家醫經長期的醫療實踐，形成了土家族傳統醫學理論體系，其醫學理論基礎是“三元”學說，認為骨折后如經脈暢通，氣、血、精充分滋養，頭元、腹元、足元調和方能愈合[2]。現代醫學認為，骨折愈合的基礎是骨膜成骨細胞再生，成骨細胞與破骨細胞的動態平衡過程[4]，故成骨細胞在骨折愈合中起重要作用。成骨細胞是一種典型的分泌細胞，其胞漿膜上富含堿性磷酸酶。堿性磷酸酶可調節骨基質成熟穩定，是成骨細胞分化的早期指標。經前期研究民族藥刺老苞根皮對骨折愈合的作用機制發現，刺老苞根皮含有較高的總黃酮、總皂苷、多糖和豐富的微量元素，能夠提高大鼠骨組織內 Ca、 Mg、 P、 Mn、 Cu、 Se、 Zn 等礦物元素的含量，升高骨堿性磷酸酶轉移酶(ALP)、骨鈣素、羥脯氨基酸、骨磷含量，改善脛骨骨折大鼠骨代謝情況，有效促進骨折愈合修復[5-9]。

本實驗進一步采用混合酶消化法多次消化乳鼠顱蓋骨獲得成骨細胞的方法培養獲得成骨細胞，同時利用ALP染色和鈣茜素紅染色鑒定成骨細胞，并取3～6代成骨細胞為研究對象。從實驗結果可知，刺老苞根皮含藥血清通過延遲S期(DNA的合成期)促進成骨細胞增殖，誘導成骨細胞的分化，增強其礦化的能力，從而促進骨折愈合。但刺老苞根皮含藥血清調節成骨細胞增殖、分化的作用機制尚未明確，仍需進一步探究。

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EffectofAraliaEchinocauiisHand.MazzContainingSerumonProliferation,Differentiation,MineralizationofPrimaryOsteoblasts

YI Xiang-jiao, WANG Song-yue, LI Jin-cheng, YAN Meng-yun, PEI Ling-peng△

(MinzuUniversityofChina,Beijing100081,China)

Objectives:Observing the influence of Aralia echinocauIis Hand.Mazz containing serum on the proliferation, differentiation, mineralization of primary osteoblasts. Methods: SD rats (n=80) were used to make Aralia echinocauIis Hand.Mazz containing serum by gastric perfusion for seven days with distilled water, Aralia echinocauIis Hand.Mazz water decoction high, middle, low dosages. In vitro, the primary osteoblasts were cultured with the drug serum in each group. Detection of alkaline phosphatase activity by trace enzyme method, cells were detected by alizarin red staining experiments, osteoblasts cycle were analyzed by flow cytometry. Results: After osteoblasts were intervened with the serum in each group, compared with model groups, osteoblasts were cultured with drug serum in each group, the alkaline phosphatase activity and the ability of mineralization were improved. The G0/ G1and G2/M phase of the osteoblasts cycle were decreased. The S and G2/M+S phase were increased. Conclusion: Effects of Aralia echinocaulis Hand.Mazz containing serum could extend the S phase of osteoblasts. The proliferation, differentiation, mineralization of primary osteoblasts were promoted.

Aralia echinocauIis Hand. Mazz; Primary osteoblast; Alkaline phosphatase; Mineralization; Osteoblasts cycle

R285.5

B

1006-3250(2017)09-1305-03

國家自然科學基金資助項目(81673769)-基于信號網絡耦聯節點理論探討刺老苞根皮有效成分群干預糖尿病骨質疏松癥的分子機制研究;國家自然科學基金資助項目(81473451)-基于3D打印技術與分子信號網絡理論研究刺老苞根皮有效成分群調控骨折愈合作用機制；國家自然科學基金資助項目(81270051)-基于Wnt/β-catenin與TGF-β/BMPs信號耦聯網絡的刺老苞根皮干預骨折愈合分子機制研究；教育部長江學者和創新團隊發展計劃資助項目(IRT-13R63)-中國少數民族傳統醫學

依香叫(1988-)，女(傣族)，云南人，在讀博士，從事民族醫藥學研究。

裴凌鵬(1976-)，副研究員，碩士研究生導師，從事民族醫藥與臨床學研究，E-mail: lppei@hotmail.com。

2017-04-05