苦豆子總黃酮對(duì)乙肝病毒復(fù)制的影響

＊.新疆維吾爾自治區(qū)昌吉州人民醫(yī)院，新疆 昌吉 800；.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 80004；.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 00050

苦豆子總黃酮對(duì)乙肝病毒復(fù)制的影響

趙義勇1楊巧麗2李壯3劉燕2黃華2＊
1.新疆維吾爾自治區(qū)昌吉州人民醫(yī)院，新疆 昌吉 831100；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050

目的觀察苦豆子總黃酮提取物(KDH)在體內(nèi)、外對(duì)乙肝病毒復(fù)制的影響。方法采用乙型肝炎病毒HBV轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2的2.2.15細(xì)胞系，檢測(cè)KDH對(duì)乙肝病毒DNA(HBV-DNA)復(fù)制及表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)分泌的影響；采用鴨乙肝病毒DHBV感染的雛鴨模型觀察KDH對(duì)鴨乙型肝炎的治療作用。結(jié)果KDH (125-500)μg/mL濃度在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)HBV-DNA的復(fù)制有明顯的抑制作用，其500μg/mL濃度對(duì)HBsAg、HBeAg的分泌有一定的抑制作用；其25mg/kg劑量口服可持續(xù)降低鴨乙肝模型血清中DHBV-DNA水平。結(jié)論KDH可有效干預(yù)乙肝病毒的復(fù)制。

苦豆子；總黃酮；乙肝病毒；

乙型肝炎是世界性的性流行病，我國(guó)是高地方性流行區(qū)，在全球3.5億HBV感染者中，中國(guó)人占三分之一。在乙肝患者漫長(zhǎng)的治療中，應(yīng)用抗乙肝藥物控制和緩解病情，對(duì)延長(zhǎng)生存期和改善生活質(zhì)量起著至關(guān)重要的作用。臨床經(jīng)驗(yàn)表明，長(zhǎng)期治療和多方位的藥效是使病情獲得持續(xù)緩解的有效途徑。我國(guó)傳統(tǒng)的中醫(yī)中藥在治療乙型肝炎的應(yīng)用中有其獨(dú)到之處，一些經(jīng)典復(fù)方，如茵陳蒿湯、小柴胡湯等，在臨床常用于急、慢性肝炎的對(duì)癥治療，在緩解癥狀、改善病情方面起到了積極的作用[1]。一般認(rèn)為，中藥主要是通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能而發(fā)揮間接的抗病毒作用，但近年來的研究表明，中藥不僅能通過調(diào)節(jié)免疫功能幫助機(jī)體清除病毒，還可能直接抑制病毒復(fù)制。據(jù)報(bào)道，許多單味藥材的提取物，如葉下珠、黃芪、扯根菜、臺(tái)灣細(xì)葉油柑等藥材的提取物，可有效抑制乙肝病毒的復(fù)制[2-5]。此外，一些民間驗(yàn)方有直接抑制乙肝病毒的作用，如復(fù)方六月雪、愈肝膠囊等[6-7]。在當(dāng)今抗乙肝藥物的研究中，傳統(tǒng)中藥的優(yōu)勢(shì)受到越來越多的關(guān)注，從中藥寶庫中尋找天然抗病毒活性部位或活性成分，已成為發(fā)掘新藥的重要途徑之一。

苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)為豆科槐屬多年生草本植物，廣泛分布于我國(guó)西北地區(qū)，是維吾爾醫(yī)的傳統(tǒng)用藥，主要以地上部分或種子入藥。研究報(bào)道，苦豆子中含有豐富的化學(xué)成分，其中主要的兩大類為生物堿類和黃酮類[8-9]，以往對(duì)其生物堿類成分研究較多[10]，并發(fā)現(xiàn)了一些有效成分[11-13]，而對(duì)其黃酮類成分的研究較少，尤其是對(duì)黃酮類成分生物活性的研究還未見報(bào)道。本課題采用大孔樹脂和聚酰胺樹脂聯(lián)用的方法[14]對(duì)新疆地產(chǎn)苦豆子藥材中的黃酮類成分進(jìn)行分離純化，得到苦豆子總黃酮提取物(KDH)，并進(jìn)行體內(nèi)、外抗乙肝病毒活性的初步研究，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 儀器與材料

1.1 樣品 KDH(出膏率2.5%)由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所提供，制備方法：取苦豆子種子粗粉，加8倍量的70%乙醇提取3次，每次1h，合并提取液，提取液過濾、放冷、離心，上清液減壓濃縮至無醇味，并用蒸餾水定容至溶液濃度為0.4g(生藥)/mL，取上述濃縮液調(diào)pH值為7，上大孔樹脂-聚酰胺混合柱，柱徑高比為1∶7，用4 BV水洗脫去除水溶性雜質(zhì)，再用5 BV 50%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮，50℃烘干。拉米夫定原料藥(3TC，批號(hào)NDS0061105，北京諾德恒信化工技術(shù)有限公司)，4℃保存。

1.2 細(xì)胞及動(dòng)物 乙型肝炎病毒(HBV)DNA克隆轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞(Hep G2)的2.2.15細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)科院生物技術(shù)研究所病毒室提供。用含胎牛血清10%，3%谷氨酰胺1%，G418 380μg/mL，卡那霉素50U/mL的Eagle’s MEM培養(yǎng)液，在37℃ 5% CO2溫箱中培養(yǎng)，大約每周傳代1次。鴨乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)強(qiáng)陽性血清，采自上海麻鴨，-70℃保存；1日齡北京鴨，購(gòu)自北京前進(jìn)種鴨場(chǎng)。

1.3 儀器 LIOHTCYCLER2.0型PCR全自動(dòng)熒光定量系統(tǒng)(美國(guó)通用羅氏公司)；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；HH-CP-01型二氧化碳培養(yǎng)葙(上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；BHC-1300ⅡA/B3生物安全柜(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；MDF-382E低溫冰箱(SANYO Electric)；BIO-RAO 3550型酶標(biāo)儀、γ-計(jì)數(shù)儀(美國(guó)DPC公司)；

1.4 試劑 MEM培養(yǎng)基(GiBco，Invitrogen Corporation)；胰酶(北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司)；小牛血清、HEPES(中國(guó)醫(yī)科院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)；乙肝病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒cPCR-熒光探針(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)；HBsAg、HBeAg固相放射免疫測(cè)定盒(中國(guó)同位素公司北方免疫試劑研究所)；放射性同位素α-32PdCTP(亞輝生物醫(yī)學(xué)工程公司，比活度：111 TBq/nmol)；探針標(biāo)記用隨機(jī)引物試劑盒(Promerga公司)；缺口翻譯試劑盒(Promega Co.)；Sephadex G-50、Ficoll PVP(Pharmacia公司)；SDS(Merck公司)；魚精DNA、牛血清白蛋白(中國(guó)科學(xué)院生物物理所)；0.45μm硝酸纖維素膜(Amersham公司)。

2 方法與結(jié)果[15]

2.1 熒光定量PCR法檢測(cè) 對(duì)HBV-DNA表達(dá)的抑制作用 KDH用含DMSO的營(yíng)養(yǎng)液配成4000μg/mL的原液，4℃保存，臨用時(shí)以2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。取2.2.15細(xì)胞接種96孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層時(shí)，取原液以培養(yǎng)液作2倍稀釋，取(2000～250)μg/mL四個(gè)濃度加樣，每濃度4孔，于37℃ 5% CO2條件培養(yǎng)，第4天各組換相應(yīng)濃度的藥液，同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照。第8天顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況，完全破壞為4；75%為3；50%為2；25%為1；無病變?yōu)?。觀察計(jì)算最大無毒濃度(TC0)和半數(shù)有毒濃度(TC50)。該部分研究重復(fù)了2批實(shí)驗(yàn)，2批實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KDH在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)的毒性：TC50和TC0分別為1000μg/mL和500μg/mL。

2.2.15細(xì)胞(約50萬個(gè)/mL)接種96孔板培養(yǎng)板，每孔100(L，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)48h左右加藥，KDH TC0及以下的兩個(gè)2倍稀釋度，每濃度3孔，設(shè)細(xì)胞對(duì)照組，于37℃、5% CO2條件培養(yǎng)，第3天換1次藥液，繼續(xù)培養(yǎng)，加藥第6d收取細(xì)胞，用試劑盒提取DNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HBV- DNA表達(dá)量(拷貝/mL)，計(jì)算樣品對(duì)HBV-DNA的抑制率，結(jié)果苦豆子提取物(125-500)μg/mL濃度在2.2.15細(xì)胞中可明顯降低HBV-DNA表達(dá)量。結(jié)果見表1。

表1 KDH對(duì)HBV-DNA表達(dá)量的影響

2.2 斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)對(duì)HBV DNA復(fù)制的抑制作用 2.2.15細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(約10 萬個(gè)/mL)，每孔200μL，37℃、5% CO2條件培養(yǎng)，觀察細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，KDH取無毒濃度及其以下的4個(gè)2倍稀釋度，共5個(gè)濃度組，每濃度3孔, 同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照組。加樣后于37℃，5% CO2條件培養(yǎng)，第3天換原濃度樣品溶液繼續(xù)培養(yǎng)，于第6d取各樣品組及細(xì)胞對(duì)照組的上清液和細(xì)胞，按分子克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法提取其HBV-DNA，進(jìn)行斑點(diǎn)雜交、放射自顯影，測(cè)量各雜交點(diǎn)的A值后，計(jì)算抑制率，并按Reed&Muench法計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)，結(jié)果表明苦豆子提取物在2.2.15細(xì)胞中對(duì)HBV-DNA的復(fù)制有明顯的抑制作用。結(jié)果見表2。

HBV DNA抑制百分率(%)=(細(xì)胞對(duì)照組A值-給藥組A值)/細(xì)胞對(duì)照組A值×100。

表2 KDH對(duì)HBV-DNA的抑制作用

2.3 對(duì)2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg、HBsAg的抑制作用 每毫升10萬個(gè)2.2.15細(xì)胞接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 每孔200μL，37℃ 5% CO2培養(yǎng)24h，樣品取最大無毒濃度及以下4個(gè)2倍稀釋度，共5個(gè)濃度，每濃度4孔，37℃ 5% CO2條件下培養(yǎng)，每4天換原濃度藥液培養(yǎng)，第8天時(shí)收獲培養(yǎng)液，-20℃冰凍保存。

實(shí)驗(yàn)設(shè)HBsAg、HBeAg 陽性和陰性對(duì)照及細(xì)胞對(duì)照。用 HBsAg和HBeAg固相放射免疫試劑盒按說明書方法測(cè)定HBsAg和HBeAg, 用γ-計(jì)數(shù)儀測(cè)定每孔放射強(qiáng)度值，3個(gè)平行孔取均值后，計(jì)算抑制率。按Reed&Muench法計(jì)算半數(shù)有效濃度(IC50)。

抗原抑制百分率(%)=(細(xì)胞對(duì)照組放射強(qiáng)度值-給藥組放射強(qiáng)度值)/細(xì)胞對(duì)照組放射強(qiáng)度值×100。

結(jié)果，苦豆子總黃酮提取物最大無毒濃度對(duì)在2.2.15細(xì)胞中分泌HBsAg和HBeAg有一定的抑制作用。結(jié)果見表3、4。

表3 KDH在2.2.15細(xì)胞中第8d對(duì)HBsAg的抑制作用

表4 KDH在2.2.15細(xì)胞中第8天對(duì)HBeAg的抑制作用

2.4 對(duì)鴨乙肝模型的治療效應(yīng) 取1日齡北京鴨，自鴨腿脛靜脈注射上海麻鴨DHBV-DNA陽性鴨血清，0.2 mL/只，感染7d后隨機(jī)分組進(jìn)行藥物治療實(shí)驗(yàn)，每組6只，苦豆子提取物組以25 mg/kg劑量口服給藥，病毒對(duì)照(DHBV)組給予等體積的生理鹽水，陽性對(duì)照組給予50 mg/kg的3TC，每天給藥2次，連續(xù)10d，分別于DHBV感染后第7天即用藥前(T0)，用藥第5天(T5)，用藥第10天(T10)和停藥后第3天(P3)，自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，-70℃保存待檢。取上述待檢鴨血清，同時(shí)點(diǎn)膜，測(cè)定鴨血清中DHBV-DNA水平的動(dòng)態(tài)。按缺口翻譯試劑盒說明書方法，用32P標(biāo)記DHBV-DNA探針，作鴨血清斑點(diǎn)雜交，放射自顯影膜片斑點(diǎn)在酶標(biāo)儀(490nm)測(cè)定吸光度A，以A值作為標(biāo)本DHBV-DNA水平值，計(jì)算每組動(dòng)物不同時(shí)間(T5、T10)和停藥后第3天(P3)血清DHBV-DNA的抑制率，比較各組鴨血清DHBV-DNA的抑制率的動(dòng)態(tài)。

DNA抑制率=(給藥前(T0)A值-給藥后(T5，T10，P3)A值)/給藥前(T0)A值×100%

結(jié)果，3組動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)期體重水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果如圖1所示。KDH在給藥期及停藥后3d對(duì)DHBV-DNA有持續(xù)的抑制作用，且停藥3d后抑制率下降不明顯，而3TC在停藥后抑制率明顯下降，提示KHD的抑制作用比較穩(wěn)定。結(jié)果如圖2所示。

3 討論

2.2.15細(xì)胞模型和鴨乙肝模型是目前抗乙肝病毒藥物篩選和評(píng)價(jià)的主要手段，隨著這兩種模型在中藥抗HBV研究中的應(yīng)用，許多傳統(tǒng)中藥的提取部位或化學(xué)成分被證實(shí)有抗HBV活性，為從天然產(chǎn)物中尋找抗病毒藥物提供了有效途徑。在藥用植物成分中，研究報(bào)道較多的主要有黃酮類、糖苷類和生物堿類[16-17]。

由于苦豆子中的生物堿類含量很高，在過去幾十年，對(duì)苦豆子的研究開發(fā)一直集中于其生物堿類成分，其黃酮類成分的生物活性則從未引起關(guān)注。隨著對(duì)中草藥抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)不斷深入，黃酮類成分在該領(lǐng)域的重要性得到公認(rèn)，并且已發(fā)現(xiàn)許多植物黃酮類成分具有廣譜抗病毒活性[18]。由此推測(cè)，苦豆子中的黃酮類成分有可能是潛在的抗病毒活性物質(zhì)。

研究對(duì)苦豆子總黃酮提取物展開體內(nèi)、外抗病毒作用的研究，旨在為進(jìn)一步探明苦豆子黃酮類單體成分的抗HBV活性奠定基礎(chǔ)。研究顯示苦豆子總黃酮在細(xì)胞培養(yǎng)中明顯抑制HBV-DNA的表達(dá)，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，其IC50值約為269.2μg/mL，表明其體外抗病毒活性較強(qiáng)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中苦豆子總黃酮在給藥期可明顯降低鴨血清中DHBV-DNA水平，其抑制作用雖不及陽性對(duì)照藥拉米夫定，但可平穩(wěn)持續(xù)至停藥后第3天；而拉米夫定對(duì)病毒的抑制率在給藥期間較高，停藥后則大幅下降，提示苦豆子總黃酮對(duì)鴨乙肝的治療效應(yīng)比西藥更為穩(wěn)定。上述研究結(jié)果初步印證了課題組的預(yù)期，苦豆子中的黃酮類成分也是其重要的抗病毒物質(zhì)基礎(chǔ)。目前從苦豆子中分離得到的黃酮類化合物已有5種[19]，這些黃酮類成分的抗HBV活性及作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

在2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中，熒光定量PCR和斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)均表明苦豆子總黃酮(125～500)μg/mL濃度明顯抑制HBV-DNA的表達(dá)；放射免疫法測(cè)定其500μg/mL濃度對(duì)HBsAg、HBeAg的分泌也有一定的抑制作用；在鴨乙肝模型治療實(shí)驗(yàn)中，苦豆子總黃酮提取物以25mg/kg劑量口服可持續(xù)降低模型動(dòng)物血清中DHBV-DNA水平。該結(jié)果提示苦豆子總黃酮提取物在體內(nèi)、外均可有效干預(yù)乙肝病毒的復(fù)制。

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TheInhibitoryEffectoftheTotalFlavonoidsErtractsfromSophoraalopecuroidesL.onReplicaionofHepatitisBVirus

ZHAO Yiyong1YANG Qiaoli2LI Zhuang3LIU Yan2HUANG Hua2*

1.The Hospital of Changji Hui Autonomous Prefecture，Changji 831100，China；2.The XinJiang Institute of Materia Medic, Urumqi 830004，China；3.Institute of Medicinal Biothechnology Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100050，China

ObjectiveTo observe the effect of KDH on the replicaion of hepatitis B virus.MethodsHBV-transfected HepG 2.2.15 cells as the vitro model, The antiviraI activity of KDH was examined by detecting the levels of HBsAg and HBeAg in the supernatant and extracellular HBV-DNA. Andinvivomodel, BeiJing brown spotted ducks infected with the DHBV-DNA were randomly divided into three groups: model group, positive group, KDH group. Blood was collected respectively to determine the content of DHBV-DNA, before and at the fifth, tenth day during treatment, and at the third day after finishing the treatment.ResultsKDH at the concentration of(125～500)μg/mL showed an inhibitory effect on HBV-DNA, The KDH 500μg·mL-1dose suppressed HBsAg and HBeAg expressions. And, The KDH 25mg/kg dose of oral sustainably reduced DHBV-DNA levels in the serum of duck hepatitis B virus model.ConclusionThe study suggested that KDH has a strong effect against HBV replication.

SophoraalopecuroidesL.; Total Flavonoid; Hepatitis B Virus

R285

A

1007-8517(2017)17-0021-04

2017-07-07 編輯：陶希睿)

趙義勇(1967-)，男，漢族，本科，研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)。E-mail:zhaoyiyong@sina.cn

黃華(1965-)，女，漢族，碩士研究生，研究員，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)研究。E-mail:huangh6505@163.com