扇貝多肽的作用及其機制

魏婷婷+侯玉+宗雅麗+馬敬芝+楊俊麗+崔龍波

摘 要：綜述扇貝多肽（PCF）在抑制紫外線誘導的細胞凋亡、增強機體免疫功能以及作為抗氧化劑保護細胞等方面的作用，簡述其對細胞增殖周期的影響，并探討PCF發揮這些作用的生物學機制。

關鍵詞：扇貝多肽；細胞凋亡；免疫；抗氧化

扇貝多肽（polypeptide from Chlamys fareri，PCF）是利用現代海洋生物工程技術從櫛孔扇貝中提取的水溶性小分子多肽，氨基酸序列為 Pro-Asn-Thr-Hyl-Ser-Cys-Arg-Gly。與傳統人工合成的抗氧化劑和大分子化合物相比，它具有相對分子質量小（Mr=879）、水溶性強和致敏性低的特點[1]。作為一種新興海洋活性物質，PCF引起了眾多科研工作者的注意，根據他們的研究結果，本文從抑制細胞凋亡、增強機體免疫功能、抗氧化等方面對扇貝多肽的作用及其作用機制進行了綜述，以期為相關藥物以及化妝品等的研發提供理論基礎，使PCF得到進一步開發利用。

1 PCF可抑制紫外線誘導的細胞凋亡

紫外線（UVB）對細胞結構損傷明顯，誘導出現細胞凋亡現象。已有研究表明經UVB輻射的小鼠其表皮變薄，成纖維細胞數量減少，表皮細胞和成纖維細胞中均有空泡形成，真皮的成纖維細胞內可見囊泡狀擴張的內質網，高爾基體等細胞器減少，線粒體膜受損、嵴斷裂，有的可見細胞核固縮，通過彗星電泳可檢測有DNA鏈的斷裂[2]。但經過UVB和PCF共同處理后，表皮的厚度和成纖維細胞的數量均有所增加，超微結構顯示細胞結構明顯改善，粗面內質網豐富，DNA鏈斷裂程度減輕[3]。由此可推斷， PCF能夠在一定程度上抑制紫外線誘導的損傷和細胞凋亡。

PCF通過影響細胞凋亡通路抑制細胞凋亡，目前探索到PCF所影響的信號通路如下。

1.1 死亡受體通路（Fas-FADD-caspase-8通路）

在死亡受體起始的細胞凋亡信號通路中，死亡受體（Fas）的交聯使得接頭分子（FADD）通過死亡結構域的相互作用被募集到死亡受體的胞內區，caspase-8（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-8）通過死亡效應結構域的相互作用結合到FADD上，二聚化的caspase-8通過自身切割而被活化，活化的caspase-8又可以去裂解并活化效應caspase，從而導致細胞凋亡。李丙華等[4]的研究表明，UVB照射引起Fas和FADD的表達增加及caspase-8的活化，引發細胞凋亡，而PCF可通過抑制 Fas和FADD的表達及caspase-8的活化從而抑制紫外線誘導的HaCaT（人永生化表皮）細胞凋亡。

1.2 線粒體內源性凋亡通路

1.2.1 Bax / Bcl-2通路 Bcl-2（B淋巴細胞瘤-2基因）家族蛋白主要通過調節線粒體外膜的通透性來調控細胞凋亡，Bax和Bak是Bcl-2家族中的多結構域蛋白，它們能導致線粒體外膜通透化。與此同時，Bax和Bak的活化及其功能會被Bcl-2家族的抗凋亡成員（如Bcl-2等）所抑制，從而抑制外膜通透化及細胞凋亡。因此，Bax/Bcl-2的比值對細胞至關重要，它決定著細胞受到刺激后是發生凋亡還是幸存。實驗[5]表明，PCF可通過增強Bcl-2蛋白表達，抑制Bax蛋白表達來抑制UVB輻射誘導的小鼠胸腺細胞的凋亡。

1.2.2 Smac-XIAP-caspase-3通路 凋亡蛋白抑制劑（IAPs）家族是近年來新發現的一類抑制細胞凋亡的蛋白，X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）是其中的一種caspases抑制劑[6]。當細胞受到凋亡信號刺激后，促凋亡蛋白分子（Smac）從線粒體釋放進入細胞質，與caspases競爭結合X連鎖凋亡抑制因子的重復序列，從而使caspases恢復活性，引發細胞凋亡。張蘭蘭等[6]研究發現，PCF可呈劑量依賴性地抑制Smac從線粒體釋放到細胞質，上調 XIAP mRNA的表達，抑制相關caspase的活化，從而抑制UVB誘導的HaCaT細胞凋亡。

1.3 活性氧（ROS）相關通路

1.3.1 ROS-JNK-caspase-3通路 紫外線輻射能導致ROS-JNK-caspase-3級連反應的發生，從而引起細胞凋亡。PCF可降低細胞內ROS的含量[7]，提高抗氧化酶的活性，抑制JNK（c-Jun氨基末端激酶）的磷酸化，進而使其下游caspase-3的活化被抑制，從而抑制紫外線輻射誘導的細胞凋亡。

1.3.2 ROS-細胞色素C通路 在UVB誘導的HeLa細胞凋亡中，ROS的生成可引起線粒體膜電位的丟失，線粒體內膜上的滲透性通透孔通道開放，從而引起細胞色素 C的釋放，傳遞凋亡信號。若預先加入不同劑量的PCF可劑量依賴性降低ROS的水平，進而減少線粒體細胞色素C的釋放，從而抑制細胞凋亡[8]。

1.3.3 ASK1-JNK通路 ROS誘導細胞凋亡的一個機制是通過激活ASK1（凋亡信號調節激酶1），從而引起JNK蛋白活化，使線粒體功能發生改變進而引起caspase活化而誘導細胞凋亡的。ASK1是對氧敏感的MAP-KKK，既可激活MKK3/MKK6-p38，又能激活SEK1-JNK途徑，從而誘導細胞凋亡[7]。陳海英等[9]發現，PCF能降低因UVB輻射造成的ROS含量的升高，引起ASK1的降解，升高線粒體膜電位，抑制ASK1-JNK凋亡通路的活化，從而抑制細胞凋亡。

1.4 MAPKs通路

細胞外調節激酶——絲裂原活化蛋白激酶（APKs）家族包括ERKs、JNK和p38[10]。ERKs是一種胞漿內廣泛分布的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，與細胞增殖和分化有關[11]，其所介導的通路的活化具有抗細胞凋亡的作用。在 MAPKs通路中，紫外線可催化激活JNKs和p38，它們是引起細胞凋亡的信號，從而導致細胞凋亡。而PCF可通過抑制JNKs和P38激酶水平、提高ERKs活性以及降低caspase-3的活化，從而抑制紫外線誘導的細胞凋亡[10]。endprint

1.5 p38MAPK-HSP27通路

熱休克蛋白27（heat-shock protein，HSP27）為細胞受損時產生的高度保守蛋白，是p38 MAPK （p38 mitogen activated protein kinases）的一個下游底物，在細胞應激反應中具有重要作用，可被p38 MAPK信號途徑磷酸化，進而參與細胞的凋亡。石少婷等[12]研究表明，PCF可通過劑量依賴性抑制p38 MAPK的磷酸化活化而阻斷HSP27的磷酸化及其細胞內移位，從而抑制紫外線引起的細胞凋亡。

1.6 aSMase-JNK信號通路

酸性鞘磷脂酶（aSMase）通常主要分布于溶酶體、內體和細胞膜的小窩，活化后即與膜融合，使其內容物釋放到細胞外表面。UVA可誘導細胞表面aSMase的表達增多[1]，aSMase可進一步引起JNK的活化，PCF對細胞的保護作用是通過抑制aSMase的表達從而抑制JNK的活化而實現的。

1.7 EGFR-ATK-CyclinD1-CDK-4通路

紫外線照射后，表皮生長因子受體（EGFR）所在的信號通路被激活，EGFR表達迅速增多，EGFR基因序列較之正常組缺失了TAT序列，而插入了CTCTC序列；預先加入PCF孵育后，雖然仍保留部分CTCTC，但TAT序列被修復，故PCF在基因水平對細胞凋亡起作用[13]。此外，PCF可通過抑制磷脂酰肌醇-3激酶（ATK）的表達從而抑制細胞周期蛋白CyclinD1和周期蛋白依賴激酶4（CDK-4）的活化，抑制紫外線引起的細胞凋亡[14]。

1.8 c-jun/c-fos和COX-2通路

c-jun和c-fos基因對細胞生長的調控具有重要意義，是細胞凋亡的中間媒介，它們的表達產物c-jun和c-fos蛋白是激活蛋白1（activator protein1， AP-1）的重要組成部分，研究[15]表明AP-1在介導紫外線誘導的皮膚老化和癌癥中占有重要地位。UVA可誘導HaCaT細胞內c-jun/c-fos和環氧合酶-2（COX-2）的表達，引發細胞凋亡，而PCF可通過抑制AP-1和COX-2的活性來抑制HaCaT細胞凋亡。

1.9 TNF-α/TNFR1通路

腫瘤壞死因子（TNF-α）與其受體TNFR1的結合既可以誘導凋亡信號，也可以引起抗凋亡信號，其作用與細胞核因子NF-κB被活化還是被抑制有關。紫外線輻射后HaCaT細胞內TNF-α、TNFR1的活化可導致JNK蛋白的激活，活化的TNFR1還可以通過影響NF-κB的活性及caspase級聯反應來調控細胞凋亡過程。實驗[16]表明PCF可以通過影響TNF-α/TNFR1的表達，進而抑制下游JNK磷酸化，最終發揮細胞保護作用。

1.10 TRAIL通路

腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（Tumour necrosis factor related apoptosis inducing ligand，TRAIL）存在于人體的大多數器官和細胞，其誘導的凋亡信號傳導與ROS有關[17]。PCF可直接抑制TRAIL的表達，或以其抗氧化活性抑制TRAIL凋亡通路。

2 PCF增強機體免疫功能

目前，在研究PCF對免疫方面的作用時，常采用地塞米松（DEX）建立淋巴細胞的免疫抑制病理模型[18]。DEX可以顯著減弱脾臟和胸腺細胞的活性，減少免疫細胞的數量。

2.1 PCF對機體免疫細胞的影響

PCF對正常小鼠的腹腔巨噬細胞和天然殺傷細胞無明顯影響，但是DEX和FCF共同培養與DEX單獨培養的細胞比較，腹腔巨噬細胞的吞噬功能和天然殺傷細胞的活性均有明顯提高[18]。因此可推斷，對于免疫力低下的小鼠，PCF可提高機體非特異性免疫防御能力。

PCF對于胸腺和脾臟的作用并不完全相同。胸腺是中樞淋巴器官，是培育T淋巴細胞的場所；而脾臟為外周淋巴器官，是T淋巴細胞和B淋巴細胞受到抗原刺激后產生免疫反應的場所。根據張彩梅等[19]的研究發現，PCF對DEX處理小鼠的胸腺細胞形態學無明顯影響，但可以使脾臟白髓組織恢復正常大小，且淋巴細胞密集；在另一方面，PCF對于正常和DEX處理小鼠胸腺各T細胞亞群無明顯影響，但可以使脾臟T細胞亞群中L3T4+和Lyt2+所占的比例明顯升高。由此可推斷， PCF可能主要通過影響外周成熟免疫細胞發揮免疫調節作用。

2.2 PCF對免疫調節物質的影響

PCF還可以通過調節機體內免疫物質而影響機體的免疫能力。刀豆素（ConA）能較好的促進淋巴細胞的轉化反應，調節機體免疫反應。PCF可以提高因DEX處理而降低的ConA轉化能力，但對于正常的細胞，PCF沒有明顯增強ConA轉化能力的效果[18]。雌二醇（E2）是機體中具有廣泛調節作用的激素之一，對免疫功能也具有調節作用，可在體內抑制免疫細胞的活性，而PCF可以阻斷E2對免疫細胞的抑制作用[20]。

3 PCF的抗氧化作用

PCF可作為抗氧化劑，使細胞中ROS、丙二醇（MAD）等物質減少，還可以提高抗氧化物質的活性。車勇良[21]實驗證明，PCF和H2O2共同處理的胸腺細胞較H2O2單獨處理的胸腺細胞，抗氧化酶和非酶抗氧化劑如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、H2O2酶（CAT）及總抗氧化能力（T-AOC）的活性有明顯升高，且在一定范圍內有劑量依賴性。PCF的抗氧化作用在不同種氧化損傷模型處理的不同細胞中普遍存在，如以UVA為損傷模型處理的HaCaT細胞[22]，以UVB為損傷模型處理的Hela細胞[23]、HaCaT細胞[24]中均出現此類現象。

3.1 修復H2O2損傷的生物膜結構

H2O2是一種強氧化劑，可以使細胞中MAD的含量升高，MAD是自由基所致的過氧化物，可以破壞細胞膜脂，損壞其結構和功能的完整性。PCF可以普遍降低氧化損傷細胞中MAD的含量，從而抑制了細胞的脂質過氧化。endprint

另外，PCF還可以通過升高線粒體膜電位（ΔJm）和Ca2+濃度保護生物膜[21]。線粒體膜電位的下降可引起線粒體Ca2+外流，Ca2+作為一種重要的細胞信號，它的持續升高會導致細胞質中大量的蛋白酶和磷酸酶失活，同時分解鈣的依賴性蛋白酶和磷酸酶可能被激活，從而引起細胞骨架的破壞和細胞膜的損傷。

3.2 抑制P物質（SP）的過度表達

SP是由感覺神經纖維C受到各種刺激后釋放，作為調節皮膚炎癥的遞質，另外它還與細胞增殖和細胞凋亡有關。張玉江等人[25]的研究表明，在無毛小鼠皮膚氧化損傷和凋亡模型中均存在SP的過度表達，PCF對SP的表達有抑制作用且存在劑量依賴性。因此可推測，UVB引起的皮膚氧化損傷與SP的過度表達有關，PCF可以減少SP的表達量，預防連續UVB輻射對皮膚組織的損傷。

3.3 降低一氧化氮（NO）的產生

NO是細胞在應激狀態下產生的高反應自由基，由一氧化氮合酶NOS催化產生，也可以由非一氧化氮合酶（iNOS）途徑產生。實驗表明[26]，PCF預孵的HaCaT細胞經UVB照射后，NO的釋放量低于未預孵的模型組，說明PCF可有效抑制NO的釋放。PCF可能通過抑制iNOS的表達，從而抑制NO的生成，但對于通過其他途徑釋放NO的抑制，還需通過進一步研究。

3.4 抑制EGFR的過度表達

EGFR是一種跨膜蛋白，其胞外區有上皮生長因子的結合位點，其介導的酪氨酸磷酸化反應在調節細胞生長和增殖中有重要的作用，多種腫瘤細胞存在EGFR的過量表達，因此該途徑被認為與腫瘤的發生密切相關。在連續UVB輻射無毛小鼠皮膚氧化損傷病理模型的基礎上研究發現，連續UVB輻射可使無毛小鼠突變型EGFR過度表達，PCF可以有效減少因輻射而增加的EGFR的表達量[25]。因此可推斷，PCF可以通過減少EGFR的表達量預防連續UVB輻射對皮膚組織的損傷。

4 PCF的其它作用

4.1 抑制UVB導致的人皮膚成纖維細胞周期阻滯

實驗證明，UVB可以使人皮膚成纖維細胞ROS含量上升，誘導p53蛋白表達，使p21Cip1（周期蛋白依賴激酶抑制因子）分子表達明顯升高；加入PCF后，ROS、p53蛋白和p21Cip1分子的表達均受到抑制[27]。p21Cip1分子是p53蛋白的下游靶分子，對細胞周期有負調控作用，可導致細胞G1期阻滯，而ROS是激活p53蛋白物質之一。因此可以推斷，PCF通過清除ROS、抑制p53蛋白的表達緩解人皮膚成纖維細胞周期阻滯。

4.2 促進細胞的增殖和分化

實驗證明，一定濃度的PCF可以明顯促進新西蘭兔骨髓基質細胞（BM-SCs）在體外的增殖，達到促進神經細胞損傷修復的效果[28]。另外，PCF還可以促進人臍血干細胞的的分化[29]。

5 展望

PCF是一種新興的海洋活性物質，相比于傳統人工合成的大分子多肽，其具有毒性低、來源廣的特點，因此近年來引起研究者的注意。目前已取得一些進展與突破，主要是在細胞保護方面，提供了細胞損傷的修復及防治方法。同時，海洋蛋白經酶解后有溶解性強、乳化性高、流動性增加等特點，使PCF在化食品、藥物、化妝品等方面有著十分廣闊的開發與利用前景[30]。其與相應藥物聯用后的抑瘤作用更是為腫瘤輔助藥物的研發提供了新思路，充分體現出其潛在而巨大的社會效益與經濟效益。當然，現在對PCF的研究是遠遠不夠的，未來對其進行綜合研究將會對相關行業的現狀帶來巨大改善。

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Effects and mechanism of polypetide from Chamys farreri

WEI Ting-ting，HOU Yu，ZONG Ya-li，Ma Jing-zhi，Yang Jun-li，CUI Long-bo

（College of Life Sciences，Yantai University，Yantai 264005，China）

Abstract：Polypeptides from Chlamys farreri （PCF） is an solvable antioxidative peptide. The functions of PCF were summerized， including inhibiting apoptosis caused by UVB， boosting immunity and inhibiting the oxidative damages as antioxidants. The role of PCF in the proliferation cycle was also outlined and the mechanism of actions of PCF was analyzed.

Key words：Polypetide from Chamys farreri； apoptisis； immunity； antioxidationendprint