響應面法優化杏鮑菇曲制曲條件

許 彬，李慧星，李 斌，王冬梅

（南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽 473004）

響應面法優化杏鮑菇曲制曲條件

許 彬，李慧星，李 斌，王冬梅

（南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽 473004）

該研究以米曲霉為菌種制備杏鮑菇曲，以蛋白酶活力、CMC酶活力、β-葡萄糖苷酶活力為指標，通過單因素和響應面試驗優化杏鮑菇制曲工藝條件，并比較了杏鮑菇是否制曲對杏鮑菇黃豆醬的氨基酸態氮含量和·OH清除率的影響。結果表明，杏鮑菇曲的最佳制曲條件為杏鮑菇含水量60%，拌入干燥杏鮑菇質量分數10%的面粉，接種后鋪成單層，在溫度30℃的恒溫培養箱中培養5 d。在該條件下杏鮑菇曲的平均蛋白酶活力為698.7 U/g、CMC酶活力為98.4 U/g、β-葡萄糖苷酶活力為1 791.4 U/g。所得杏鮑菇曲曲層呈棕綠色、孢子分布均勻。杏鮑菇經米曲霉制曲后與黃豆曲共同發酵成杏鮑菇黃豆醬，可以顯著提高醬的氨基酸態氮含量和·OH清除率，使其分別達到6.84 mg/g和75.4%。

杏鮑菇曲；制曲條件；酶活力

杏鮑菇屬于草腐食用菌，其菇肉肥厚、脆嫩可口，具有杏仁的香味，又兼有鮑魚的風味和口感，深受消費者歡迎[1-3]。其子實體營養豐富，每100 g鮮菇中含蛋白質1.3 g，占其干物質的12.5%；含碳水化合物8.3 g，占其干物質的79.8%；還含有多種維生素和礦物質元素[4]。杏鮑菇是一種具有藥用保健功能的真菌，有降低膽固醇、抗氧化、抗動脈粥樣硬化的功能[5-7]。杏鮑菇加工制品形式多樣，將杏鮑菇接種米曲霉后制曲，所得杏鮑菇曲可用來釀制醬油[8]。菇曲中米曲霉分泌的纖維素酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶可以分解杏鮑菇的細胞組織結構，促進胞內活性成分在發酵過程中的釋放，促進糖苷分解釋放活性苷元，促進蛋白質分解為游離氨基酸[9-12]。

杏鮑菇曲也可以單獨或與黃豆曲共同發酵，釀制杏鮑菇黃豆醬。杏鮑菇曲的酶活力決定了釀造醬的發酵進程以及產品的營養價值和保健價值。本研究考察制曲條件對杏鮑菇曲蛋白酶活力、羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC）酶活力、β-葡萄糖苷酶活力的影響，采用響應曲面法優化制曲工藝，以期為開發發酵型杏鮑菇黃豆醬提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆曲：南陽市淅川縣香花鎮振翼調味品有限公司；杏鮑菇、食鹽、面粉：市售；米曲霉（滬釀3.042）曲精：山東長態生物科技有限公司。

葡萄糖、磷酸氫二鈉、無水碳酸鈉、三氯乙酸，氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、酒石酸鉀鈉、羧甲基纖維素鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫（均為分析純）：天津市德恩化學試劑有限公司。福林酚、L-酪氨酸、酪蛋白、水楊苷：合肥博美生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

721可見光分光光度計：上海箐華科技儀器有限公司；FA1004型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；CQ50電熱恒溫水浴鍋：鞏義市予華儀器有限責任公司；PHS-3C pH計：上海安亭雷磁儀器廠；101-2A型電熱鼓風干燥箱：天津市泰斯特儀器有限公司；95-2雙向恒溫磁力攪拌器：西安明克斯檢測設備有限公司；TDL-40B臺式離心機：上海安亭科學儀器廠制造；LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；MJ-300—II霉菌培養箱：上海躍進醫療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制曲方法

將杏鮑菇切成5mm左右的顆粒，干燥至質量恒定后調節含水量，裝于封閉容器（組培瓶）中，在115℃條件下滅菌10 min，按杏鮑菇干質量的0.4%接種米曲霉曲精，攪拌均勻，使物料在組培瓶底均勻分布。將組培瓶放置在相對濕度80%、一定溫度的恒溫霉菌培養箱中培養一定時間。

1.3.2 單因素試驗

以菇曲的蛋白酶活力、CMC酶活力和β-纖維素酶活力為指標，分別研究料層厚度（單層、雙層）、是否添加面粉（0，10%）、杏鮑菇含水量（50%、55%、60%、65%）、培養溫度（25℃、28℃、31℃和34℃）、培養時間（3 d、4 d、5 d和6 d）對菇曲酶活力的影響。

1.3.3 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Benhnken設計安排制曲條件優化試驗，選擇菇含水量（X1）、培養溫度（X2）、培養時間（X3）3個因素為自變量，蛋白酶（Y1）、CMC酶（Y2）、β-葡萄糖苷酶（Y3）酶活力為響應值。設計3因素3水平共15個試驗點的響應面試驗。

1.3.4 杏鮑菇黃豆醬的制作

將黃豆成曲與杏鮑菇曲或杏鮑菇按100∶30（W/W）混合，添加復合基質質量90%的16%的鹽水，置于46℃的恒溫水浴鍋中發酵，每3 d翻醬一次，發酵10 d[13]。另外按上述發酵工藝制備不添加杏鮑菇的純黃豆醬。每種處理重復3次試驗，測定醬的氨基酸態氮和羥自由基（·OH）清除率。

1.3.5 測定方法

采用Folin-酚法測定杏鮑菇曲的蛋白酶活力[14]，在40℃條件下水解酪蛋白，每1g菇曲每1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸定義為1個蛋白酶活力單位（U/g）。

采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法以羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulosesodium，CMC-Na）為底物測定CMC酶活力[14]，在50℃條件下水解，每1g菇曲每1min水解CMC-Na產生1 μg葡萄糖定義為1個CMC酶活力單位（U/g）。

采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法以水楊苷為底物β-葡萄糖苷酶活力[15]，在50℃條件下水解，每1 g菇曲每1 min水解水楊苷產生1 μg葡萄糖定義為1個β-葡萄糖苷酶活力單位（U/g）。

采用甲醛滴定法測定醬的氨基酸態氮[14]，利用Fenton反應測定·OH清除率[16]。

2 結果與分析

2.1 杏鮑菇曲制曲的單因素試驗

2.1.1 料層厚度的影響

不同料層厚度的杏鮑菇基質制曲后，菇曲的蛋白酶活力、CMC酶活力和β-葡萄糖苷酶活力變化如圖1所示。

圖1 料層厚度對酶活力的影響Fig.1 Effect of material layer thickness on enzyme activity

由圖1可知，單層基質所培養的杏鮑菇曲的蛋白酶酶活力和β-葡萄糖苷酶活力分別為555 U/g、1 148 U/g，遠高于雙層基質的蛋白酶酶活力（249 U/g）和β-葡萄糖苷酶活力（481U/g）；單層基質的CMC酶活力為96.3U/g，略高于雙層基質（79.5 U/g）。這是由于米曲霉是一種好氧型微生物，當氧氣不足時，生長受到抑制。單層培養時，基料與空氣接觸面積大，氧氣分布均勻，易于利用曲層中菌絲的生長，并利于孢子形成；料層厚度過厚會使空氣流通不暢，從而引起散熱不良[13]，曲層中心和下層的菌絲生長受限，且不利于孢子生長。另外，本試驗中杏鮑菇顆粒較小，經過蒸煮處理的杏鮑菇硬度降低，所以堆積成料層孔隙率小，自然狀態下通風較差。因此杏鮑菇制曲的適宜選用單料層。

2.1.2 面粉的影響

按杏鮑菇干質量的10%添加面粉，接種制曲，并與未添加面粉的杏鮑菇曲進行比較。菇曲的蛋白酶活力、CMC酶活力和β-葡萄糖苷酶活力變化如圖2所示。

由圖2可知，加面粉時杏鮑菇成曲中蛋白酶活力和β-葡萄糖苷酶酶活力明顯比不加面粉時酶活力大，CMC酶活力略有增加。其中，面粉對菇曲蛋白酶活力的影響與劉云珍等[17]報道一致。米曲霉能分泌淀粉酶，面粉中淀粉相對于杏鮑菇中的碳水化合物更易被米曲霉分解利用，更易為菌絲生長和產酶提供營養[18]。因此，添加面粉后杏鮑菇制曲更致密，孢子在曲層分布均勻，菇曲具有較高的酶活力。

圖2 添加面粉對酶活力的影響Fig.2 Effect of wheat flour addition on enzyme activity

2.1.3 杏鮑菇含水量的影響

不同含水量的杏鮑菇基質制曲后，曲料的蛋白酶、CMC酶和β-葡萄糖苷酶活力變化如圖3所示。

圖3 杏鮑菇含水量對酶活力的影響Fig.3 Effect ofPleurotus eryngiimoisture content on enzyme activity

由圖3可知，隨著杏鮑菇基料含水量的增加，杏鮑菇曲的各種酶活力不斷增加，當杏鮑菇基料含水量達到60%時，酶活力達到最大值；基料含水量繼續增加會導致酶活力下降。基料含有適當的水分，是加速米曲霉萌發、生長的主要條件之一。在適當的水分含量下，細胞內物質為水所溶解，為米曲霉生長提供了供給養料的條件。但水分過高時，空氣不易向料層中滲透，菌絲淹沒在培養基中，因厭氧而不利于米曲霉的生長和酶的分泌，且容易導致培養基質上雜菌繁殖消耗基料營養，從而使曲料酶活力降低。真菌的細胞壁對水分具有可滲透性，水分過低時細胞容易發生失水死亡[19]。因此選擇杏鮑菇含水量為55%、60%、65%進行后續試驗。

2.1.4 培養溫度的影響

在不同培養溫度下制曲，菇曲的蛋白酶活力、CMC酶活力和β-葡萄糖苷酶活力變化如圖4所示。

由圖4可知，培養溫度在28℃以下時，隨著發酵溫度的增加，蛋白酶活力和β-葡萄糖苷酶活力都有一定增加，但培養溫度超過30℃時，酶活力會顯著下降，這與劉云珍等[17]的報道相一致。CMC酶活力隨溫度升高而略有增加，最大為97.2 U/g（31℃），溫度升高至34℃時，酶活力降低至72.6 U/g，相對于其他兩種酶，CMC酶活力變化趨勢不明顯。溫度在適當范圍內升高時，可以促進培養基質內小分子物質的擴散運動，有利于加速生化反應，促進米曲霉的生長；但當溫度過高時，參與米曲霉代謝培養基質的酶的活性受到抑制，從而使米曲霉的生長受到限制，菌絲稀疏，酶的分泌受到影響，導致菇曲的蛋白酶活力和β-葡萄糖苷酶活力顯著下降。由于米曲霉在杏鮑菇基質上所產CMC酶的活力相對較低，在試驗所考察溫度范圍內，CMC酶活力變化并不明顯。因此選擇培養溫度為28℃、31℃、34℃進行后續試驗。

圖4 培養溫度對酶活力的影響Fig.4 Effect of culture temperature on enzyme activity

2.1.5 培養時間的影響

在不同培養時間下制曲，菇曲的蛋白酶活力、CMC酶活力和β-葡萄糖苷酶活力變化如圖5所示。

圖5 培養時間對酶活力的影響Fig.5 Effect of culture time on enzyme activity

由圖5可知，在試驗考察范圍內隨著培養時間的延長，菇曲的酶活力是呈先增加后趨平緩的變化趨勢。杏鮑菇的成分與黃豆有很大區別，杏鮑菇的蛋白質含量遠遠低于黃豆，且所含碳水化合物以纖維素、幾丁質等非淀粉成分為主[3]，在一定的培養條件下，米曲霉在杏鮑菇基質上的生長及產孢子速度比較緩慢，因此菇曲酶活力需要培養4 d才能達到最大值。隨著培養時間的延長，到培養6 d時酶活力沒有顯著降低。因此選擇培養時間為4 d、5 d、6 d進行后續試驗。

2.2 響應面試驗

Box-Benhnken試驗水平編碼及結果如表1所示。

表1 Box-Benhnken試驗設計及結果Table 1 Design and results of Box-Benhnken experiments

利用minitab軟件對表1數據進行二次多項回歸擬合，獲得杏鮑菇曲蛋白酶活力（Y1）、CMC酶活力（Y2）、β-葡萄糖苷酶活力（Y3）對菇含水量、培養溫度及培養時間的二次多項回歸方程：對各回歸模型進行方差分析，各模型中變異來源項的顯著性如表2所示。

Y1模型極顯著（P=0.005＜0.01），失擬項不顯著（P=0.100＞0.05），模型的調整決定系數R2=89.03%，表明此模型能解釋89.03%的蛋白酶活力（Y1）響應值變化；Y2模型極顯著（P=0.009＜0.01），失擬項不顯著（P=0.183＞0.05），模型的調整決定系數R2=86.10%，表明此模型能解釋86.10%的CMC酶活力（Y2）響應值變化；Y3模型極顯著（P=0.001＜0.01），失擬項不顯著（P=0.217＞0.05），模型的調整決定系數R2=94.97%，表明此模型能解釋94.97%的β-葡萄糖苷酶活力（Y3）響應值變化。

表2 響應面試驗方差分析Table 2 ANOVA of response surface methodology

由表2可知，菇含水量和培養溫度的交互作用（X1X2）以及菇含水量和培養時間的交互作用（X1X3）對3個模型的影響均不顯著，剔除后重新回歸得到方程如下：

培養溫度和培養時間的交互作用（X2X3）對蛋白酶活力、CMC酶活力和β-葡萄糖苷酶活力的響應曲面圖（X1=0）如圖6所示。

由圖6可知，培養溫度和培養時間的交互作用對菇曲的3種酶活力影響相近。在試驗范圍內，響應曲面存在最高點，培養時間一定時，培養溫度增加會引起菇曲酶活力的先增加后降低；培養溫度一定時，培養時間變化也會導致菇曲酶活力發生同樣趨勢的變化。培養溫度和培養時間都接近試驗范圍中心點時，才能獲得最大的菇曲酶活力。

采用minitab的響應優化器對三個模型進行尋優分析，得到最優制曲條件為X1=-0.090 9，X2=-0.494 9，X3=0.090 9，即菇含水量60%、培養溫度30℃、培養時間的5 d。在該條件下菇曲的預測蛋白酶活力可達696.6 U/g、CMC酶活力可達98.5 U/g、β-葡萄糖苷酶活力可達1 786.4 U/g。經3次試驗驗證，該條件下杏鮑菇的實際平均蛋白酶活力為698.7 U/g、CMC酶活力為98.4 U/g、β-葡萄糖苷酶活力為1 791.4 U/g。

圖6 培養溫度和培養時間交互作用對蛋白酶活力、CMC酶活力和β-葡萄糖苷酶活力影響的響應曲面Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between culture temperature and time on protease carboxymethyl cellulase and β-glucosaccharase activity

2.3 不同杏鮑菇黃豆醬的對比

將未制曲杏鮑菇和杏鮑菇曲分別與黃豆曲共同發酵，得到兩種杏鮑菇黃豆醬，同時制備不添加杏鮑菇的純黃豆醬，測定3種醬的氨基酸態氮含量和·OH清除率，結果如表3所示。

表3 不同黃豆醬指標的對比Table 3 Indexes comparison of different soybean paste

由表3可知，添加杏鮑菇的兩種黃豆醬與純黃豆醬相比較，在氨基酸態氮和·OH清除率兩個指標上差異均達到極顯著（P＜0.01）。相對于純黃豆醬，添加未制曲杏鮑菇發酵的黃豆醬，其氨基酸態氮含量有所降低，但·OH清除率顯著提高。這可能是由于在發酵過程中，豆曲酶類和發酵體系中的微生物對杏鮑菇成分有一定的分解作用，能促進抗氧化活性成分的產生和釋放。但由于杏鮑菇中氨基酸含量本身低于黃豆的氨基酸含量，且蛋白質分解有限，所以添加未制曲杏鮑菇的黃豆醬的氨基酸態氮含量較低。而添加杏鮑菇曲發酵的黃豆醬，由于制曲時菇曲酶的分解作用，杏鮑菇細胞內蛋白質更易被釋放、蛋白酶分解產生的游離氨基酸更多，加上發酵過程中菇曲蛋白酶對黃豆蛋白質的分解作用，大大提高了醬中游離氨基酸的含量，達到6.84 mg/g。另外在制曲時，由于米曲霉中纖維素酶對杏鮑菇細胞壁的分解作用，促進了細胞內抗氧化活性成分的釋放，所以添加杏鮑菇曲發酵的黃豆醬的·OH清除率也顯著增加，達到75.4%。

3 結論

以杏鮑菇為基質，接種米曲霉制成杏鮑菇曲，菇曲的蛋白酶活力、CMC酶活力、β-葡萄糖苷酶活力受到制曲條件的影響。制曲時宜采用單層曲層，添加面粉有利于提高菇曲酶活力。杏鮑菇干燥至質量恒定后調節含水量至60%，經滅菌、接種后在溫度30℃的恒溫培養箱中制曲5d。該最佳條件下所得杏鮑菇曲的實際平均蛋白酶活力為698.7 U/g、CMC酶活力為98.4 U/g、β-葡萄糖苷酶活力為1 791.4 U/g。所得杏鮑菇曲曲層呈綠色、孢子分布均勻。

杏鮑菇經米曲霉制曲后與黃豆曲共同發酵制備發酵型杏鮑菇黃豆醬，借助米曲霉在菇基質上代謝產生的多種分解酶，可以顯著提高醬的氨基酸態氮含量和·OH清除率，使其分別達到6.84 mg/g和75.4%。

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Optimization of koji-making conditions ofPleurotus eryngiiusing response suface methodology

XU Bin,LI Huixing,LI Bin,WANG Dongmei
(College of Biology and Chemical Engineering,Nanyang Institute of Technology,Nanyang 473004,China)

ThePleurotus eryngiikoji-making conditions withAspergillus oryzaewas studied.Using protease,carboxymethyl cellulase and β-glucosidase activity as the indicator,the koji-making condition was optimized through single factor experiments and response surface methodology.Then the effect of with or withoutP.eryngiikoji-making process on the content of amino acid nitrogen and hydroxyl radical scavenging ability ofP.eryngiisoybean paste was tested.The results showed that the optimal conditions forP.eryngiikoji-making wereP.eryngiimoisture content 60%,wheat flour 10%of dryP.eryngii,monolayer in culture flask after inoculum,culture temperature 30℃,time 5 d.In these conditions,the protease,carboxymethyl cellulase and β-glucosidase activity were 698.7 U/g,98.4 U/g and 1 791.4 U/g,respectively.TheP.eryngiikoji was brownish-green with balance spore-distributing.AfterP.eryngiikoji-making byA.oryzae,P.eryngiisoybean paste was prepared,and results showed that the content of amino acid nitrogen and hydroxyl radical scavenging ability ofP.eryngii-soybean paste was enhanced,which was 6.84 mg/g and 75.4%,respectively.

Pleurotus eryngiikoji;koji-making conditions;enzyme activity

TS264.2

0254-5071（2017）10-0114-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.024

2017-07-17

河南省高等學校重點科研項目（16A550017）

許 彬（1980-），女，講師，碩士，研究方向為食品發酵技術。