福林-酚比色法測定葡萄烈酒中總多酚含量的研究

張 婭，石方劍，楊有仙*

（1.紅河州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 蒙自 661199；2.紅河學(xué)院理學(xué)院，云南 蒙自 661199）

福林-酚比色法測定葡萄烈酒中總多酚含量的研究

張 婭1，石方劍2，楊有仙1*

（1.紅河州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 蒙自 661199；2.紅河學(xué)院理學(xué)院，云南 蒙自 661199）

該試驗(yàn)對福林-酚比色法測定葡萄烈酒中總多酚含量的最佳條件進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，最佳檢測條件確定為反應(yīng)溫度40℃、顯色時間20 min、檢測波長736 nm。在此最佳條件下，沒食子酸質(zhì)量濃度在50～400 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好（相關(guān)系數(shù)R2=0.997 4），方法重復(fù)性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.97%和1.17%，回收率為98.61%～103.22%，RSD值為2.34%，表明該方法重復(fù)性好、精密度和準(zhǔn)確度較高，可用于葡萄烈酒中總多酚含量的檢測。

福林-酚比色法；葡萄烈酒；總多酚；檢測條件

葡萄烈酒是高濃度烈性酒，酒精度在45%vol～85%vol范圍內(nèi)，主要產(chǎn)于云南省紅河州彌勒市，一般采用水晶葡萄作為原料，以白蘭地釀酒技術(shù)為基礎(chǔ)，結(jié)合中國傳統(tǒng)的釀酒特點(diǎn)，經(jīng)特殊工藝加工而成。葡萄烈酒與白蘭地、威士忌、朗姆酒、杜松子酒等烈酒相比，有其獨(dú)特的酒體和香氣。新蒸餾的原葡萄烈酒質(zhì)地粗糙、香味不圓熟，不具有葡萄烈酒的口味和香氣，需經(jīng)橡木桶多年貯存陳釀才逐漸完成向陳釀葡萄烈酒的轉(zhuǎn)變[1]。在陳釀的過程中，原葡萄烈酒發(fā)生一定程度的氧化，并從橡木桶中萃取出酚類、單寧、半纖維素等物質(zhì)[2-3]，這些物質(zhì)增加了葡萄烈酒的口感，構(gòu)成了葡萄烈酒的獨(dú)特風(fēng)格，對葡萄烈酒的等級具有重要的影響。葡萄烈酒中總多酚含量一定程度上反映了葡萄烈酒陳釀的時間及后熟程度，所以葡萄烈酒中總多酚含量的測定有助于衡量葡萄烈酒的質(zhì)量和品質(zhì)。

國內(nèi)對多酚類化合物的測定方法主要有：高錳酸鉀滴定法[4-5]、分光光度法（酒石酸亞鐵法[4]、福林-酚（Folin-ciocalteu）法[6-8]和鐵氰化鉀分光光度法[9-10]）、液相色譜法[11-12]等。福林-酚法具有顯色明顯、誤差小、回收率高的特點(diǎn)[13]，因此本研究在前人的基礎(chǔ)上嘗試用福林-酚法對葡萄烈酒中總多酚物質(zhì)含量進(jìn)行測定。

沒食子酸常用來作為多酚含量測定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)[14-16]，研究顯示，沒食子酸標(biāo)液質(zhì)量濃度在200～600 mg/L下，用福林-酚法測定，線性良好，并發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時間和反應(yīng)溫度是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不穩(wěn)定（重現(xiàn)性差）、誤差大（回收率低）的兩個重要原因[13]；有文獻(xiàn)指出[6]，反應(yīng)溫度為70℃，反應(yīng)時間為30min時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定。李巨秀等[17]采用福林-酚比色法對桑椹中總多酚含量的研究結(jié)果表明，反應(yīng)溫度為40℃，反應(yīng)時間為50 min時，結(jié)果重現(xiàn)性好、加標(biāo)回收率高。可見反應(yīng)溫度、時間對多酚含量檢測結(jié)果的影響較大。因此本試驗(yàn)研究了福林-酚法測定葡萄烈酒中總多酚物質(zhì)含量時，檢測波長、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度對多酚含量的影響，并考察了方法的可靠性和準(zhǔn)確度，以期建立一個快速準(zhǔn)確地測定葡萄烈酒中總多酚含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄烈酒（酒精度80%vol）：云南省紅河州彌勒市市售；葡萄烈酒A（酒精度82%vol于不銹鋼罐儲存陳釀）、葡萄烈酒B（酒精度81%vol于橡木桶儲存陳釀）、葡萄烈酒C（酒精度72%vol于土罐儲存陳釀）：云南省紅河州彌勒東風(fēng)寶云酒莊；福林-酚試劑（分析純）：美國Sigma公司；沒食子酸（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；Na2CO3（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

MS205DU電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-2550雙光束紫外可見分光光度計：日本島津公司；HH-4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；Transfer pette移液器：普蘭德（上海）貿(mào)易有限公司。

1.3 方法

1.3.1 最佳吸收波長的選擇

多酚類化合物在堿性條件下，與福林-酚試劑形成藍(lán)色物質(zhì)。取25 mL具塞比色管一支，加入0.5 mL質(zhì)量濃度為150 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、1 mL福林-酚顯色劑，混勻靜置30 s后加入18 mL 4%的Na2CO3溶液[7]，用去離子水定容，常溫條件下反應(yīng)1.5 h后用雙光束紫外可見分光光度計對反應(yīng)后試液進(jìn)行700～780 nm范圍全波長掃描，獲取最大吸收波長。

1.3.2 最佳反應(yīng)時間的選擇

取8支25 mL具塞比色管，編號為1～8號，1～7號比色管中各加入0.5 mL質(zhì)量濃度為150 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，8號管中加入0.5 mL去離子水，各管中再加入1 mL福林-酚顯色劑，混勻靜置30s后向各管加入18mL4%的Na2CO3溶液并用去離子水定容至刻度，將1～7號比色管于40℃水浴鍋中分別反應(yīng)5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min時，以8號管（40℃反應(yīng)20 min）作參比液，在波長736 nm處測定各比色管中試液的吸光度值。以反應(yīng)時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制吸光度值-反應(yīng)時間曲線，確定最適宜的反應(yīng)時間。

1.3.3 最佳反應(yīng)溫度的選擇

取8支25 mL具塞比色管，編號為1～8號，1～7號比色管中各加入0.5 mL質(zhì)量濃度為150 μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，8號管中加入0.5mL去離子水，分別向各管中加入1mL福林-酚顯色劑（每個比色管添加時間間隔1 min），混勻靜置30s后加入18 mL4%的Na2CO3溶液并用去離子水定容至刻度，1～7號比色管分別于15℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃反應(yīng)20 min后，在波長736 nm處測定吸光度值，以8號管（40℃反應(yīng)20min）作為參比以反應(yīng)溫度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制吸光度值-溫度曲線，確定最適宜的反應(yīng)溫度。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取1.000g沒食子酸，用去離子水定容至100mL，配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次稀釋成50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400 μg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別取0.5 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)工作液于25 mL比色管中，加入1 mL福林-酚顯色劑，混勻靜置30 s后加入18 mL 4%的Na2CO3溶液并用去離子水定容至刻度，40℃水浴反應(yīng)20 min后，以8號管（40℃反應(yīng)20 min）作為參比，于波長736 nm處測定吸光度值，以沒食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳吸收波長的確定

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與福林-酚試劑反應(yīng)后于700～780nm范圍進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見圖1。由圖1可知，反應(yīng)液在波長736nm處有最高吸收峰，因此選擇736 nm作為福林-酚法測定葡萄烈酒中總多酚的最佳波長。

圖1 反應(yīng)液在可見光區(qū)的吸收曲線Fig.1 The absorption curve of reaction liquid in the visible region

2.2 反應(yīng)時間對吸光度值的影響

考察反應(yīng)時間對反應(yīng)液吸光度值的影響，繪制吸光度值-反應(yīng)時間變化曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 反應(yīng)時間對反應(yīng)液吸光度值的影響Fig.2 Effect of reaction time on the absorbance value of the reaction liquid

由圖2可知，隨反應(yīng)時間的延長，反應(yīng)液吸光度值先迅速增加，當(dāng)反應(yīng)時間為20 min時，吸光度值達(dá)到最大值，說明此時反應(yīng)液中有色物質(zhì)含量最高；繼續(xù)延長反應(yīng)時間，吸光度值開始下降，表明反應(yīng)液中有色物質(zhì)開始分解，40min后酒樣的吸光度值趨于穩(wěn)定。因此，選擇20 min為最佳反應(yīng)時間。

2.3 反應(yīng)溫度對吸光度值的影響

考察反應(yīng)時間對反應(yīng)液吸光度值的影響，繪制吸光度值-反應(yīng)時間變化曲線，結(jié)果見圖3。

圖3 反應(yīng)溫度對反應(yīng)液吸光度值的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the absorbance value of the reaction liquid

由圖3可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)液吸光度值呈先增加后減小的趨勢，當(dāng)反應(yīng)溫度為40℃時，吸光度值達(dá)到最高；繼續(xù)升高反應(yīng)溫度，吸光度值開始下降，可能是由于隨著反應(yīng)溫度升高有色物質(zhì)逐漸被分解。因此，選擇40℃為最適宜的反應(yīng)溫度。

2.4 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以沒食子酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖4。

圖4 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of gallic acid

由圖4可知，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.0036x+0.096 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 4，表明沒食子酸在質(zhì)量濃度50～400 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好。

2.5 重復(fù)性和精密度試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取1 mL葡萄烈酒樣品6份于6支25 mL的具塞比色管中，加入1 mL福林-酚顯色劑，混勻靜置30 s后加入18 mL 4%的Na2CO3溶液并用去離子水定容至刻度，40℃水浴反應(yīng)20min后，以8號管中試液作為參比，于波長736nm處測定吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算葡萄烈酒樣品中總多酚含量，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standarddeviation，RSD），考察方法重復(fù)性，同一管中的試液連續(xù)測定6次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），考察方法的精密度。結(jié)果表明，在選定的最佳反應(yīng)條件下，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果的RSD值為1.97%，精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD值為1.17%，表明該方法具有良好的重復(fù)性和精密度。

2.6 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取1mL的葡萄烈酒樣品9份于9支25 mL具塞比色管中，分成3個濃度組，每組3個平行，分別加入50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后加入1mL福林-酚顯色劑，混勻靜置30 s后，加入18 mL 4%的Na2CO3溶液并用去離子水定容至刻度，40℃水浴反應(yīng)20 min后，以8號管作為參比，于波長737 nm處測定吸光度值，加標(biāo)回收率計算結(jié)果見表1。

表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of adding standard recovery tests

由表1可知，葡萄烈酒中總多酚平均加標(biāo)回收率在98.61%～103.22%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.34%，表明該方法準(zhǔn)確度較高，可用于葡萄烈酒中總多酚含量的檢測。

2.7 葡萄烈酒樣品中總多酚含量的測定

采用上述所建立的方法對3種不同儲存條件下葡萄烈酒樣品中的總多酚含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表2 不同儲存條件下葡萄烈酒中總多酚含量測定結(jié)果Table 2 Determination results of total polyphenols content in grape spirits under different storage conditions

由表2可知，A、B、C三種存儲陳釀方式的葡萄烈酒中總多酚含量分別為32.72 μg/mL、111.89 μg/mL、47.35 μg/mL，其中于橡木桶儲存陳釀的葡萄烈酒中總多酚含量明顯高于其他二種。這是由于橡木桶儲存陳釀的葡萄烈酒中總多酚除了來源于葡萄漿果之外，還來源于橡木桶的多酚類物質(zhì)。在葡萄烈酒儲存陳釀過程中，原葡萄烈酒發(fā)生一定程度的氧化，從橡木桶中萃取出單寧等多酚類物質(zhì)，橡木桶中多酚可以增加葡萄烈酒中總酚的含量，并與其他酚類物質(zhì)共同來增加或修飾葡萄烈酒的香氣、口感和色澤[2-3]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對福林-酚法測定葡萄烈酒中總多酚含量的檢測條件：波長、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度進(jìn)行了研究，并考察了方法的重復(fù)性、精密度和回收率。結(jié)果顯示，福林-酚法測定葡萄烈酒中總多酚含量的最佳條件為：反應(yīng)溫度40℃、顯色時間20 min、檢測波長736 nm。在該條件下沒食子酸質(zhì)量濃度在50～400 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度值線性關(guān)系良好（R2=0.997 4），方法重復(fù)性試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.97%和1.17%，平均加標(biāo)回收率為98.61%～103.22%，RSD值為2.34%，表明該方法重復(fù)性好、精密度和準(zhǔn)確度較高，可作為福林-酚法測定葡萄烈酒中總多酚含量的參考條件。

[1]宋 普.白蘭地陳釀過程中揮發(fā)性成分變化規(guī)律研究[D].煙臺：煙臺大學(xué)，2013.

[2]成曉玲，李 艷.橡木片對霞多麗葡萄酒發(fā)酵的影響[J].中國釀造，2012，36（6）：42-45.

[3]王 霞.橡木制品在白蘭地陳釀中的應(yīng)用研究[D].無錫：江南大學(xué)，2006.

[4]王燁軍，徐奕鼎，黃建琴，等.酒石酸亞鐵比色法和高錳酸鉀滴定法測定茶多酚的比較[J].茶業(yè)通報，2010，32（2）：61-63.

[5]王文杰.高錳酸鉀滴定法測定茶多酚有關(guān)用劑的特性研究[J].福建茶葉，2002（1）：15-17.

[6]李 靜，聶繼云，王孝娣，等.Folin-Ciocalteus法測定葡萄和葡萄酒中的總多酚[J].中國南方果樹，2007，36（6）：86-87.

[7]陳悅嬌，趙曉娟，李敏儀，等.Folin-Ciocalteu法測定蘋果醋飲料的總多酚含量[J].食品科學(xué)，2013，34（8）：31-35.

[8]王興東，牟明月，任雅奇，等.茅臺醬香型酒糟中總黃酮及總多酚含量的測定[J].中國釀造，2015，34（10）：86-90.

[9]馬亞軍，楊秉勤，郎惠云.高鐵鹽-鐵氰化鉀分光光度法測定葡萄籽原花青素的含量[J].西部糧油科技，2003，28（1）：60-62.

[10]郎惠云，廖曉玲，杜月琴.差示分光光度法測定茶多酚的含量[J].分析科學(xué)學(xué)報，2003，19（2）：151-153.

[11]侯冬巖，回瑞華，李鐵純，等.高效液相色譜法對綠茶中茶多酚含量的測定[J].食品科學(xué)，2010，31（24）：305-307.

[12]楊光明.高效液相色譜與化學(xué)發(fā)光聯(lián)用新技術(shù)檢測植物和藥物中的酚類化合物的研究[D].重慶：西南師范大學(xué)，2003.

[13]Folin-Ciocalteu比色法測定核桃青皮果蔬酵素總多酚含量[J].中國釀造，2015，34（9）：130-134.

[14]李文仙，俞 丹，林 玲，等.Folin-Ciocalteu比色法應(yīng)用于蔬菜和水果總多酚含量測定的研究[J].營養(yǎng)學(xué)報，2011，33（3）：302-307.

[15]游見明，曹新志.福林酚法測定茶樹中茶多酚的分布水平[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（10）：2417-2419.

[16]喻 謹(jǐn)，岳永德，湯 鋒，等.Folin-Ciocalteu法測定竹葉中總多酚含量[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2013，30（6）：2752-2758.

[17]李巨秀，王柏玉.福林-酚比色法測定桑椹中總多酚[J].食品科學(xué)，2009，30（18）：292-295.

Determination of the total polyphenols content in grape spirits by Folin-ciocalteu colorimetry method

ZHANG Ya1,SHI Fangjian2，YANG Youxian1*
(1.Honghe Quality and Technical Supervision Comprehensive Testing Center,Mengzi 661199,China;2.College of Science,Honghe University,Mengzi 661199,China)

The optimum determination conditions of total polyphenols content in grape spirits by Folin-ciocalteaut method were researched.The results showed that the optimum determination conditions were be identified as reaction temperature 40℃,developing time 20 min and detection wavelength 736 nm.Under the optimum conditions,the gallic acid in the range of 50-400 μg/ml had a good linear relationship with the absorbance value(R2=0.997 4).The relative standard deviation(RSD)of method repeatability test and the precision tests results were 1.97%and 1.17%,respectively.The recovery rate was 98.61%-103.22%,RSD was 2.34%,which indicated the method had good repeatability,precision and high accuracy,and could be used for the determination of total polyphenols content in grape spirits.

Folin-ciocalteu colorimetry;grape spirits;polyphenols;detection conditions

TS207.3

0254-5071（2017）10-0163-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.10.034

2017-05-24

張 婭（1962-），女，高級工程師，本科，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測。

*通訊作者：楊有仙（1987-），女，助理工程師，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩c檢測。