GLI1與胃癌上皮間質轉換的關系及臨床研究

林智平++++++段炤

[摘要]目的 觀察GLI1表達與胃癌上皮間質轉換的關系。方法 收集2006年1月～2011年12月診斷明確、資料完整的58例手術切除胃癌標本，做成組織芯片，采用免疫組化SP的方法檢測組織芯片中胃癌組織及正常胃黏膜組織中GLI1、E-cadherin、N-cadherin的表達。結果 GLI1在胃癌中表達較正常組織高，與胃癌的淋巴轉移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯有關，差異有統計學意義（P<0.05）；E-cadherin在正常胃黏膜組織表達比胃癌組織高，與胃癌的淋巴轉移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯有關，差異有統計學意義（P<0.05）；N-cadherin在胃癌中表達高于正常胃黏膜組織，與胃癌的淋巴轉移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯有關，差異有統計學意義（P<0.05）；GLI1表達與上皮間質轉換的狀態有關，差異有統計學意義（P<0.01）。結論 在胃癌組織中GLI1表達與E-cadherin、N-cadherin有關，提示GLI1可能參與了EMT過程。

[關鍵詞]胃癌；GLI1；上皮間質轉換

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）10（b）-0049-04

[Abstract]Objective To observe the relationship between GLI1 expression and epithelial-mesenchymal transition in gastric cancer.Methods 58 cases of gastric cancer specimens who were given surgical resection with clear diagnosis and complete data from January 2006 to December 2011 were collected，and tissue microarray was made.The expression of GLI1，E-cadherin and N-cadherin in gastric carcinoma and normal gastric mucosa in tissue microarray were detected by immunohistochemical SP method.Results GLI1 expression in gastric cancer was higher than that in normal tissues （P<0.05），which was significantly associated with lymph node metastasis，clinical staging，Lauren typing and tumor differentiation of gastric cancer，with significant difference （P<0.05）.The expression of E-cadherin in normal gastric mucosa was higher than that in gastric cancer （P<0.05），which was significantly associated with lymph node metastasis，clinical staging，Lauren typing and tumor differentiation of gastric cancer，with significant difference （P<0.05）.The expression of N-cadherin in gastric cancer was higher than that in normal gastric mucosa （P<0.05），which was significantly associated with lymph node metastasis，clinical staging，Lauren typing and tumor differentiation of gastric cancer，with significant difference （P<0.05）.GLI1 expression was associated with epithelial-mesenchymal transition，with significant difference （P<0.01）.Conclusion The expression of GLI1 in gastric cancer is associated with E-cadherin and N-cadherin，indicating that GLI1 may be involved in the EMT process.

[Key words]Gastric cancer；GLI1；Epithelia-mesenchymal transition

胃癌（gastric cancer）是最常見的惡性腫瘤之一，發病率在全球常見癌癥中居第4位，在癌癥相關死因中居第2位，每年因胃癌死亡者約70萬例[1]；其在我國常見癌癥中居第2位，在癌癥死因中居第3位[2]。我國中晚期胃癌患者術后5年的生存率為20%～30%，早期胃癌患者的生存率最高為85%～100%[3-4]。決定患者生存率的主要因素是轉移，因此尋找腫瘤轉移的標志物是臨床研究的方向。研究發現上皮間質轉換（epithelia-mesenchymal transition，EMT）現象及SHH信號通路中的GLI1表達與腫瘤的轉移密切相關。EMT是一種基本的生理病理現象，其表達上調的因子主要是N-cadherin，表達下調的因子主要是E-cadherin。本研究以胃癌標本作為研究對象，采用免疫組化檢測胃癌中SHH信號通路中核轉錄因子GLI1及E-cadherin、N-cadherin的表達情況，現報道如下。endprint

1對象與方法

1.1研究對象

收集我院病理科存檔，2006年1月～2011年12月診斷明確、資料完整的58例手術切除胃癌標本，所有患者術前未經放療及抗癌化學藥物治療，其中男性38例，女性20例；按照WHO胃癌組織分類及分級標準歸納，分化類型：低分化24例，中高分化34例；按TNM進行分期，其中Ⅰ+Ⅱ期有31例，Ⅲ+Ⅳ期有27例；按Lauren進行分型，其中腸型30例，彌漫型28；淋巴結轉移組39例，無轉移組21例。同時選取15例正常胃黏膜用作對照。本研究已經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2試劑

GLI1抗體購自深圳華拓公司，E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、SABC（兔IgG）-POD試劑盒、SABC（小鼠IgG）-POD kit、DAB顯色試劑盒（黃）購自武漢博士德公司。

1.3免疫組化染色

所有標本經100%甲醛固定，石蠟包埋，制作成組織芯片，HE染色，SP法免疫組化。

1.4結果判定

①GLI1陽性的表達：定位于細胞胞漿及胞核內，腫瘤細胞胞質內和（或）胞核上出現棕黃色顆粒為陽性細胞。計算染色細胞所占百分數。染色細胞≥20%為陽性，<20%為陰性[5]。②E-cadherin：蛋白的陽性表達呈棕褐色，主要定位于細胞膜，或圍繞細胞膜呈線形。結果判斷參照Sulzers分級法，陽性細胞<10%為陰性；≥10%為陽性[6]。③N-cadherin：以細胞膜和細胞質中棕黃色為陽性細胞數，按陽性細胞所占比例進行分級，<10%為陰性，≥10%為陽性[7]。

1.5統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 GLI1在胃癌組織中的表達及與病理參數的關系分析

GLI1在正常胃黏膜組織中的表達率為20%，在胃癌組織中的表達率為83%，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）。GLI1陽性表達率與胃癌的淋巴轉移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯相關，差異有統計學意義（P<0.05）。兩組的性別、年齡、腫瘤大小相比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表1）。

2.2 E-cadherin在胃癌組織中的表達及與病理參數的關系分析

E-cadherin在正常胃黏膜中的表達率為80%，在胃癌組織中的表達率為36%，兩組比較差異有統計學意義（P<0.05）。E-cadherin陽性表達率與胃癌的淋巴轉移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯相關，差異有統計學意義（P<0.05）。兩組的性別、年齡、腫瘤大小比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表2）。

2.3 N-cadherin在胃癌組織中的表達及與病理參數的關系

N-cadherin在正常胃黏膜中的表達率為11%，在胃癌組織中的表達率為43%，兩者比較差異有統計學意義（P<0.05）。N-cadherin陽性表達率與胃癌的淋巴轉移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯相關，差異有統計學意義（P<0.05）。兩組的性別、年齡、腫瘤大小比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表3）。

2.4胃癌組織中GLI1表達EMT狀態的關系

參考David Sarrio的方法，選擇E-cadherin表達陰性同時N-cadherin表達陽性的病例作為發生EMT過程，記為EMT（+）。在58例胃癌中，EMT陽性表達率為45%，使用Kendall tau-b相關分析顯示，GLI1與EMT的狀態有一定關系，差異有統計學意義（P<0.05）（表4）。

3討論

EMT的概念最早于1982年，由Greenburg和Hay[8]在研究中提出。其是一種復雜的病理生理現象，在多種病理生理過程（如損傷、修復、炎癥、腫瘤侵襲轉移等）進展中發揮了重要意義。在正常情況下，EMT的發生是受到機體調控的，然而在腫瘤中，因喪失了機體正常調控作用，腫瘤細胞通過EMT形式獲得侵襲能力并向遠處轉移。Thiery[9]采用EMT現象來描述癌的發生及發展，具體為：正常上皮細胞沿著基底膜生長，通過表現遺傳學改變或基因的改變，細胞發生轉化生成原位癌；繼續發展，癌細胞通過EMT形成局部擴散，基底膜變脆，細胞侵入淋巴管及血管，發生轉移，形成轉移癌。EMT是許多腫瘤侵襲和轉移的一個重要的過程[10]。在各類細胞中，EMT現象與腫瘤的侵襲轉移密切相關，在卵巢癌、乳腺癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌、口腔癌、肝癌等多種癌癥的原位浸潤和遠處轉移中發揮了重要作用[11]。余韜等[12]發現EMT在腫瘤發生、腫瘤演進中也發揮了關鍵的作用。本研究結果顯示，E-cadherin、N-cadherin表達水平與胃癌的淋巴轉移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯相關，提示胃癌發生與E-cadherin表達下調及N-cadherin上調有關，E-cadherin、N-cadherin對維持細胞間連接和極性起著重要作用，影響腫瘤細胞的生存與增殖，也提示E-cadherin、N-cadherin是EMT途徑的重要標志。

Hedgehog信號通路與腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移密切相關[13-14]。Hedgehog信號通路之一的SHH信號通路表現出持續性激活并調控下游基因轉錄，通過誘導細胞增殖、阻斷細胞凋亡、促進血管形成，參與腫瘤的形成。SHH通路較為復雜，主要由分泌型信號糖蛋白SHH、跨膜蛋白受體PTCH和另一跨膜蛋白SMO以及轉入因子蛋白GLI1及下游靶基因組成[15-17]。PTCH結合SHH蛋白，解除了對SMO的抑制，抑制GLI1的水解。GLI1是整個信號通路中最關鍵的信號分子，功能性激活均會使該信號通路持續激活，全長的GLI1蛋白進入細胞核后激活目的基因的轉錄，致使細胞過度增殖，最終導致腫瘤的發生和發展[18]。生物化學研究顯示，GLI1因缺乏磷酸化和剪切修飾所必須的蛋白激酶A識別位點，因此僅有激活子功能，直接調控著該通路靶基因的轉錄。根據以往的文獻，以GLI1的核染色作為這一信號通路活化的標志，以GLl1陽性細胞百分比增加作為判斷這一信號通路活化程度提高的指標[19]。倪卓然等[20]發現，異常激活的Hedgehog通路中GLI1可能參與了調控Snail、Ecadherin的表達，通過調控EMT的發生，促進肝癌的發生、發展。Yanai等[21]發現，GLI1蛋白表達與體現胃癌侵襲力的三項指標（浸潤深度、淋巴結轉移、TNM分期）密切相關，侵襲力強的胃癌組織中的GLI1蛋白表達增強，并且在胃癌轉移淋巴結中GLI1顯著激活，暗示著SHH通路活化的胃癌可能具有較高的轉移潛能。本研究結果顯示，GLI1陽性表達與胃癌的淋巴轉移、臨床分期、Lauren分型、腫瘤分化明顯有關，有淋巴結轉移、臨床Ⅲ+Ⅳ期、彌漫型、低分化的患者其GLI1陽性率明顯增高，提示GLI1可作為胃癌的一個有效觀察標志，有助于病情的判斷。GLI1在胃癌組織細胞中的表達高于正常胃黏膜的表達，兩者的差異有統計學意義。GLI1有可能作為一種調控胃癌侵襲和轉移的關鍵步驟，從而對胃癌的發生及轉移起相關性作用。endprint

在本研究中，GLI1和N-cadherin在胃癌中表達較正常組織高，E-cadherin在正常胃黏膜組織表達比胃癌組織高。GLI1表達與EMT的狀態有關。隨著研究的進展，胃癌中Hedgehog通路調節EMT過程的機制愈發明晰，靶向干涉或阻斷Hedgehog通路，將為胃癌的臨床治療提供一個更為廣闊的應用前景。

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