胃癌中RBBP4和BCL-2的表達及意義

曹 嬿，范松龍，張智弘

胃癌中RBBP4和BCL-2的表達及意義

曹 嬿1,2，范松龍2，張智弘1

目的探討視網膜母細胞瘤結合蛋白4(retinoblastoma binding protein 4, RBBP4)和BCL-2在胃癌中的表達及其與臨床病理特征的關系。方法采用免疫組化SP法檢測72例胃癌及對應癌旁組織中RBBP4、BCL-2蛋白表達，分析RBBP4與胃癌臨床病理特征的關系及與BCL-2表達的相關性。實時熒光定量PCR法檢測20例胃癌及癌旁組織中RBBP4 mRNA的表達。結果RBBP4、BCL-2蛋白在癌組織中的陽性率分別為55.6%(40/72)、50%(36/72)，顯著高于癌旁組織13.9%、16.7%。RBBP4和BCL-2高表達均與腫瘤分化、浸潤深度及淋巴結轉移明顯相關(P<0.05)，且RBBP4和BCL-2蛋白的表達呈正相關(r=0.559，P<0.05)。RBBP4 mRNA在胃癌組織中的相對表達水平(9.988±1.948)顯著高于癌旁組織(1.458±0.489)。結論RBBP4在胃癌中的表達升高，可能和胃癌的發生、發展及侵襲轉移有關，可能成為胃癌診斷和預后評估的新指標。

胃腫瘤；RBBP4；BCL-2；免疫組織化學；實時熒光定量PCR

胃癌病死率高居癌癥相關病死率的第3位，嚴重威脅人類的健康[1]。除早期胃癌外，進展期胃癌復發率高，預后很差，5年生存率為5%～20%[2]。因此尋找新的分子標志物對實施個體化治療和預后判斷尤為重要。近年研究發現視網膜母細胞瘤結合蛋白4(retinoblastoma binding protein 4, RBBP4)與腫瘤的增殖、復發、治療抵抗有密切關系[3-4]。有文獻報道RBBP4在前列腺癌[5]、肝細胞肝癌[6]、子宮頸癌[7]中高表達，但在胃癌中報道較少且不明確。本文通過檢測RBBP4在胃癌中的表達，分析其與胃癌臨床病理特征的關系，同時檢測腫瘤凋亡相關因子BCL-2的表達，分析兩者表達的相關性及意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料選取常州市中醫醫院病理科2012年～2015年存檔的胃癌手術切除標本，按WHO(2010)胃癌組織學分級及分類標準診斷。所有病例術前均未行放、化療等抗腫瘤治療。標本送至病理科后規范固定、取材、常規脫水并制成蠟塊。選取有代表性的腫瘤組織和正常組織蠟塊，免疫組化法檢測RBBP4和BCL-2蛋白表達，同時以實時熒光定量PCR法檢測其中20例胃癌組織和癌旁組織中RBBP4 mRNA的表達。

1.2方法

1.2.1試劑 免疫組化抗體：鼠抗人RBBP4單克隆抗體(稀釋倍數1 ∶200)，鼠抗人BCL-2單克隆抗體(即用型)，免疫組化試劑盒購自北京西雅金橋公司。PureLink FFPE Total RNA Isolation Kit(Invitrogen公司)用于提取RNA，High-Capacity cDNA Reverse Transcriptipon Kit(ABI公司)用于逆轉錄，PCR試劑盒Power SYBR Green master mix(ABI公司)用于PCR擴增。

1.2.2免疫組化 采用免疫組化SP法檢測胃癌及癌旁組織中RBBP4、BCL-2蛋白表達。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知陽性片作為陽性對照。結果判定：由兩位病理醫師分別閱片并結果判定。RBBP4特異性染色定位于細胞核，BCL-2主要表達在細胞核膜和細胞質，染色陽性為出現黃色和棕黃色顆粒。每例鏡下采集10個低倍視野，根據陽性細胞百分比和染色強度綜合評分：(1)按陽性細胞百分比評分：陽性細胞數<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。(2)按染色強度評分：無陽性染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結果相乘：<2分為陰性，≥2分為陽性。

1.2.3實時熒光定量PCR 將選取好的腫瘤組織蠟塊20例分別切取白片3張，將白片放入去離子水中，用消毒的手術刀片對照HE染色切片的位置將腫瘤組織和腫瘤旁組織分別刮下，裝入離心管中，根據Invitrogen公司的PureLink FFPE Total RNA Isolation Kit的步驟進行RNA提取，-80 ℃保存。通過逆轉錄反應合成cDNA，而后以cDNA產物為模板，設計合成PCR引物，引物序列：上游5′-TCTTTACAGGGCATACGG-3′，下游5′-TGAGTGGCTTGGTTTGGA-3′；β-actin上游5′-GCGCGGCTACAGCTTCA-3′，下游5′-CTTAATGTCACGCACGATTTCC-3′。PCR反應條件：95 ℃，10 min，95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，共進行40個循環。設置管家基因β-actin為內參照。反應結束后由儀器自動分析結果，以2-△Ct及2-△△Ct計算mRNA的相對表達量。

1.3統計學分析使用統計分析軟件SPSS 22.0和Graphpad 5.0進行數據分析，使用Pearson χ2檢驗、校正的χ2檢驗這兩種統計檢驗方法和Spearman相關性分析，分析RBBP4、BCL-2表達與胃癌臨床病理特征之間的相關性，顯著性檢驗采用雙側檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1胃癌組織與癌旁組織中RBBP4、BCL-2的表達胃癌組織中RBBP4、BCL-2的表達明顯高于癌旁組織(P<0.05，表1，圖1、2)。

表1 RBBP4和BCL-2在胃癌和癌旁組織中的表達[n(%)]

①②

圖1胃癌中RBBP4陽性，SP法
圖2胃癌中BCL-2陽性，SP法

2.2RBBP4、BCL-2表達與胃癌臨床病理特征的關系RBBP4、BCL-2表達均與胃癌組織學分級、浸潤深度以及淋巴結侵犯密切相關(P<0.05)。而與患者年齡、性別、腫瘤大小和神經侵犯與否無關(P>0.05，表2)。

表2 RBBP4、BCL-2表達與胃癌臨床病理特征的關系

2.3胃癌組織中RBBP4與BCL-2表達的相關性Spearman相關分析結果顯示，胃癌組織中RBBP4與BCL-2表達呈正相關(P<0.05，表3)。

表3 胃癌組織中RBBP4與BCL-2的相關性

2.4胃癌及癌旁組織中RBBP4mRNA的表達實時熒光定量PCR檢測結果表明，20例胃癌組織中RBBP4 mRNA的表達平均值為9.988±1.948，明顯高于20例癌旁組織RBBP4 mRNA表達水平(1.458±0.489)(P<0.000 1，圖3)。

3 討論

RBBP4屬于WD40蛋白家族，為一種Rb結合蛋白，參與染色體配置、核小體修飾、細胞周期進展及腫瘤干細胞分化等功能[8-9]，并通過一系列中間環節，影響細胞因子的轉錄及細胞增殖[10]，并且對腫瘤放、化療效果有一定影響[11-12]。RBBP4在不同腫瘤中的意義并不相同。原發性肝癌中RBBP4呈高表達，是一種癌基因[13]，在子宮頸癌細胞中，沉默RBBP4基因后其轉移、侵襲能力下降[7]。但既往也有研究報道RBBP4抑制子宮頸癌的發生[14]。本組實驗采用免疫組化法檢測胃癌和癌旁組織中RBBP4的表達，發現RBBP4在胃癌組織中的表達(55.6%)明顯高于癌旁組織(13.9%)，進一步應用石蠟組織檢測RBBP4 mRNA的表達水平，結果顯示胃癌組織中RBBP4 mRNA的表達水平顯著高于癌旁組織。這些實驗結果表明胃癌組織中RBBP4蛋白和mRNA表達水平均升高，提示RBBP4可能參與胃癌發生、發展，是一種促癌基因。此外，本組實驗深入分析其與胃癌臨床病理特征的關系，免疫組化結果顯示RBBP4表達與胃癌組織學分級、浸潤深度以及淋巴結侵犯密切相關，組織分化越差、浸潤能力越強、有淋巴結轉移的胃癌組織中RBBP4表達顯著升高，而這些因素均與腫瘤預后有關。這說明RBBP4表達水平能反映胃癌的進展情況，可以作為判斷胃癌預后和早期診斷的新指標。

圖3 RBBP4 mRNA在胃癌及癌旁組織中的表達

有研究報道RBBP4家族成員RBBP2通過上調BCL-2蛋白參與白血病的進展[15]，因此作者也試圖通過分析胃癌中RBBP4與BCL-2的相關性來了解RBBP4在胃癌中的作用機制。本組實驗采用免疫組化法檢測BCL-2蛋白表達及其與RBBP4表達的相關性。BCL-2蛋白是與腫瘤細胞增殖、凋亡相關的重要蛋白，具有很強的凋亡抑制功能，其過表達是腫瘤轉移進展的重要原因之一[16]。許多研究顯示胃癌中BCL-2蛋白高表達參與胃癌的發生、發展。本組實驗結果顯示，BCL-2蛋白與RBBP4蛋白一樣，在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，與組織學分級、浸潤深度、淋巴結轉移相關，且胃癌組織中RBBP4表達與BCL-2蛋白表達呈正相關，即RBBP4可能通過促進BCL-2蛋白的表達，從而抑制胃癌細胞的凋亡，參與胃癌的發生、發展。

綜上所述，本組實驗證實了RBBP4與胃癌臨床病理特征的關系，可作為胃癌預后判斷重要指標之一，且初步揭示了RBBP4與胃癌的關系可能是通過調控BCL-2凋亡細胞通路。本實驗仍處于初步階段，缺乏對患者生存時間的相關分析，且病例數仍不足，下一步需進行更大樣本量的研究并隨訪收集相關數據，為RBBP4成為重要的預后指標和靶向治療提供充足的證據。

[1] Torre L A, Bray F, Siegel R L,etal. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[2] Shah M A. Update on metastatic gastric and esophageal cancers[J]. J Clin Oncol, 2015,33(16):1760-1769.

[3] Richly H, Aloia L, Di Croce L,etal. Roles of the Polycomb group proteins in stem cells and cancer[J]. Cell Death Dis, 2011,2(9):e204.

[4] Tsujii A, Miyamoto Y, Moriyama T,etal. Retinoblastoma-binding protein 4-regulated classical nuclear transport is involved in cellular senescence[J]. J Biol Chem, 2015,290(49):29375-29388.

[5] Chen J H, He H C, Jiang F N,etal. Analysis of the specific pathways and networks of prostate cancer for gene expression profiles in the Chinese population[J]. Med Oncol, 2012,29(3):1972-1984.

[6] Song H, Xia S L, Liao C,etal. Genes encoding Pir51, Beclin 1, RbAp48 and aldolase b are up or down-regulated in human primary hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2004,10(4):509-513.

[7] 鐘晶晶, 楊旭銳, 麥梅清, 等. 下調RbAp48表達可抑制人宮頸癌MS751細胞株的遷移侵襲能力[J]. 南方醫科大學學報, 2015,35(11):1564-1569.

[8] Krüger A V, Jelier R, Dzyubachyk O,etal. Comprehensive single cell-resolution analysis of the role of chromatin regulators in early C. Elegans embryogenesis[J]. Dev Biol, 2015,398(2):153-162.

[9] Satrimafitrah P, Barman H K, Ahmad A,etal. RbAp48 is essential for viability of vertebrate cells and plays a role in chromosome stability[J]. Chromosome Res, 2016,24(2):161-173.

[10] Wang X, Yao F, Liang X,etal. Cloning and expression of retinoblastoma-binding protein 4 gene in embryo diapause termination and in response to salinity stress from brine shrimp Artemia sinica[J]. Gene, 2016,591(2):351-361.

[11] Zheng L, Tang W, Wei F,etal. Radiation-inducible protein RbAp48 contributes to radiosensitivity of cervical cancer cells[J]. Gynecol Oncol, 2013,130(3):601-608.

[12] Kitange G J, Mladek A C, Schroeder M A,etal. Retinoblastoma binding protein 4 modulates temozolomide sensitivity in glioblastoma by regulating DNA repair proteins[J]. Cell Rep, 2016,14(11):2587-2598.

[13] Zhu P, Wang Y, He L,etal. ZIC2-dependent OCT4 activation drives self-renewal of human liver cancer stem cells[J]. J Clin Invest, 2015,125(10):3795-3808.

[14] Kong L, Yu X P, Bai X H,etal. RbAp48 is a critical mediator controlling the transforming activity of human papillomavirus type 16 in cervical cancer[J]. J Biol Chem, 2007,282(36):26381-26391.

[15] Wang X, Zhou M, Fu Y,etal. RBP2 promotes adult acute lymphoblastic leukemia by upregulating BCL-2[J]. PLoS One, 2016,11(3):e0152142.

[16] 趙 楠, 孫保存, 趙秀蘭, 等. 缺氧誘導腫瘤細胞BCL-2表達促進LPPCN樣細胞核凝集的形成[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2015,31(11):1258-1262.

ExpressionofRBBP4andBCL-2ingastriccarcinomaand
theirclinicopathologicalsignificance

CAO Yan1,2, FAN Song-long2, ZHANG Zhi-hong1

(1DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210029,China;2DepartmentofPathology,ChangzhouTraditionalChineseMedicineHospital,Changzhou213000,China)

PurposeTo investigate the expression and significance of RBBP4 and BCL-2 in gastric carcinoma and to explore the relationship between their expression and clinicopathologic characteristics.MethodsImmunohistochemistry was used to detect RBBP4 and BCL-2 proteins’ expression in the 72 tumor tissues and para-cancer tissues. The association of RBBP4 expression with the clinicopathologic features and the expression correlation between RBBP4 and BCL-2 were analyzed. Real-time PCR was used to detect the expression of RBBP4 mRNA in the 20 tumor tissues and corresponding para-cancer tissues.ResultsImmunohistochemical results showed that 40 cases of cancer tissues exhibited RBBP4 positive expression, with a positive rate of 55.6%, and 36 cases showed BCL-2 positive expression (50% positive rate), which were significantly higher than that in para-cancer mucosa (13.9%, 16.7%). The over-expression of RBBP4 and BCL-2 was correlated with tumor differentiation, invasive depth and lymphatic metastasis in gastric carcinoma (P<0.05). The expression of RBBP4 was positively correlated with BCL-2 (r=0.559,P<0.05). Real-time PCR results showed that the relative expression levels of RBBP4 mRNA in gastric carcinoma tissues and para-cancer tissues were 9.988±1.948 and 1.458±0.489 respectively, and the expression in gastric carcinoma was significantly up-regulated as compared with para-cancer tissues.ConclusionsThe expression of RBBP4 is up-regulated in gastric carcinoma, which may be involved in the development, invasion and metastasis of gastric carcinoma. RBBP4 might become a new diagnostic and prognostic marker for gastric carcinoma.

gastric neoplasms; RBBP4; BCL-2; immunohistochemistry; Real-time PCR

R 735.2

A

1001-7399(2017)10-1070-04

時間：2017-10-23 13:30 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.002.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.002

接受日期：2017-06-15

國家自然科學基金(81773109)、江蘇省自然科學基金(BK20151582)

1南京醫科大學第一附屬醫院病理科，南京 210029

2南京中醫藥大學附屬常州市中醫醫院病理科，常州 213000

曹 嬿，女，副主任醫師。E-mail: crossshine@163.com

張智弘，女，主任醫師，博士生導師,通訊作者。E-mail: zhangzhih2001@aliyun.com