胃癌組織中CTSD、HSP90α、EGFR的表達及臨床意義

李 禹，程愛蘭

胃癌組織中CTSD、HSP90α、EGFR的表達及臨床意義

李 禹1,2，程愛蘭1

目的檢測組織蛋白酶D(Cathepsin D, CTSD)、熱休克蛋白90α(heat shock protein 90α, HSP90α)、表皮生長因子受體(epidemal growth factor receptor, EGFR)蛋白及其mRNA在胃癌組織中的表達及其與胃癌臨床病理特征的關系，初步探討CTSD、HSP90α、EGFR在胃癌發生、發展及浸潤轉移過程中的作用。方法采用免疫組化及原位雜交(in situ hybridization, ISH)法檢測110例正常胃黏膜組織、83例癌旁異型增生組織、110例胃癌組織及78例胃癌淋巴結轉移組織中CTSD、HSP90α、EGFR蛋白及其mRNA的表達。結果(1)CTSD、HSP90α、EGFR蛋白在110例正常胃黏膜組織、83例癌旁異型增生組織、110例胃癌組織及78例胃癌淋巴結轉移組織中的陽性率分別為0、18.07%、80.91%、92.31%；0.9%、15.66%、75.45%、89.74%；0、12.05%、69.09%、84.62%。(2)相關分析結果顯示，CTSD、HSP90α、EGFR在胃癌組織中的表達呈兩兩正相關(rs=0.853，P<0.05；rs=0.639，P<0.05；rs=0.734，P<0.05)。(3)CTSD、HSP90α、EGFR在胃癌中的表達均與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期相關(P<0.05)；與患者年齡、性別、腫瘤大小無顯著相關性(P>0.05)。結論CTSD、HSP90α與EGFR可能與胃癌發生、發展以及侵襲轉移等惡性生物學行為密切相關。

胃腫瘤；CTSD；HSP90α；EGFR；臨床病理特征

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一。我國胃癌的發病率及病死率均明顯高于全球平均水平。在前期工作中，課題組利用蛋白質組學及生物信息學方法篩選并鑒定了高轉移鼻咽癌細胞中組織蛋白酶D(Cathepsin D, CTSD)的相互作用蛋白，發現CTSD/熱休克蛋白90α(heat shock protein 90α, HSP90α)/表皮生長因子受體(epidemal growth factor receptor, EGFR)在鼻咽癌細胞中形成相互作用組并能促進其侵襲轉移[1]，CTSD/HSP90α/EGFR在胃癌中是否也具有協同作用及促進其侵襲轉移尚不明確。本文采用免疫組化及原位雜交(in situ hybridization, ISH)法檢測不同胃病變組織中CTSD、HSP90α和EGFR蛋白及其mRNA的表達，旨在探討它們與胃癌發生、發展的關系，為尋找胃癌腫瘤標志物提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1一般材料收集2014年7月～2015年6月南華大學附屬第一醫院存檔的胃癌手術切除標本，包括正常胃黏膜組織110例、異型增生組織83例、胃癌組織110例和淋巴結轉移性癌組織78例，其中男性73例，女性37例；年齡27～81歲，平均58.29歲。分化程度：高分化6例，中分化20例，低+未分化84例；無區域性淋巴結轉移者32例，1～6枚區域性淋巴結轉移者29例，7～15枚區域性淋巴結轉移者30例，>15枚區域性淋巴結轉移者19例；浸潤深度：腫瘤浸潤至固有層及黏膜下層9例，肌層29例，漿膜層72例；腫瘤直徑：≥6 cm者23例，<6 cm者87例。TNM分期：Ⅰ期20例，Ⅱ期25例，Ⅲ期59例，Ⅳ期6例。以上病理結果均經兩名以上病理醫師確認。所有患者術前均未行放療或化療。

1.2試劑CTSD抗體及SP免疫組化檢測試劑盒購自福州邁新公司，HSP90α抗體、CTSD和EGFR ISH試劑盒均購自武漢博士德公司，兔抗EGFR抗體購自北京中杉金橋公司，HSP90α ISH試劑盒購自廣州伯信公司。

1.3方法

1.3.1免疫組化 采用免疫組化SP法染色。石蠟切片常規脫蠟水化，抗原修復，分別滴加3%H2O2內源性過氧化物酶抑制劑10 min，PBS緩沖液沖洗，滴加CTSD、HSP90α、EGFR一抗后4 ℃冰箱過夜，次日分別滴加二抗和SP溶液，DAB顯色，蘇木精復染，常規脫水、透明、封片。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.2ISH 切片常規脫蠟水化，0.25%乙酸酐酸化，3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶暴露mRNA核酸片段，后固定，預雜交，雜交，雜交后洗滌，封閉，滴加生物素化鼠抗地高辛、SABC、生物素化過氧化物酶后，DAB顯色，蘇木精復染，常規脫水、透明、封片。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4統計學處理采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析。定性資料的比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行顯著性檢驗，各指標相關性采用Spearman相關分析；采用Kappa檢驗比較其免疫組化和ISH的檢測結果。

2 結果

2.1CTSD、HSP90α、EGFR蛋白及其相應mRNA在不同胃病變中的表達CTSD、HSP90α、EGFR蛋白在110例正常胃黏膜組織、83例癌旁異型增生組織、110例胃癌組織及78例胃癌淋巴結轉移組織(圖1)中的陽性率分別為0、18.07%、80.91%、92.31%；0.9%、15.66%、75.45%、89.74%；0、12.05%、69.09%、84.62%。相應CTSD mRNA、HSP90α mRNA、EGFR mRNA(圖2)的陽性率分別為0、7.22%、65.45%、76.92%；0、14.46%、60.91%、67.95%；0、12.05%、60.91%、75.64%(表1)。

2.2CTSD、HSP90α和EGFR蛋白與mRNA表達的一致性分析Kappa檢驗，CTSD、HSP90α和EGFR與其相應的mRNA在胃癌組織中的表達均具有一致性(κ=0.603，P<0.05；κ=0.700，P<0.05；κ=0.455，P<0.05)。

2.3胃癌組織中CTSD、HSP90α與EGFR三者之間的關系相關分析結果顯示，CTSD與HSP90α、CTSD與EGFR、HSP90α與EGFR在胃癌組織中的表達呈正相關(rs=0.853，P<0.05；rs=0.639，P<0.05；rs=0.734，P<0.05)。

①A①B①C②A②B②C

圖1胃癌組織中CTSD、HSP90α和EGFR蛋白的表達：A.CTSD；B.HSP90α；C.EGFR，SP法圖2胃癌組織中CTSD mRNA、HSP90α mRNA和EGFR mRNA的表達：A.CTSD；B.HSP90α；C.EGFR，ISH

表1 不同胃組織中CTSD、HSP90α、EGFR蛋白及其相應mRNA的表達

胃癌vs正常胃黏膜組織，P<0.05；胃癌vs癌旁異型增生組織，P<0.05；胃癌vs胃癌淋巴結轉移組織，P<0.05

2.4CTSD、HSP90α、EGFR表達與胃癌臨床病理特征的關系CTSD、HSP90α、EGFR表達均與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移及TNM分期相關(P<0.05)；與患者年齡、性別、腫瘤大小無顯著相關性(P>0.05，表2)。

表2 CTSD、HSP90α、EGFR表達與胃癌臨床病理特征的關系

3 討論

近年研究認為胃癌是由多種內外因素介導細胞多種基因結構損傷和表達異常所致，是多步驟的復雜過程，其發生過程中涉及大量癌基因的活化和抑癌基因的失活。因此研究與胃癌發生、發展相關基因或蛋白質，發現具有診斷意義的腫瘤標志物，一直是亟待解決的課題。

CTSD是一種廣泛存在于不同組織細胞和腫瘤細胞的溶酶體天冬氨酸類肽鏈內切酶，因其生物學功能多樣性而倍受關注。Nirdé等[2]研究發現乳腺癌細胞過表達CTSD可通過促進HSP70的分泌來促進高密度腫瘤細胞的增生。Vashishta等[3]采用轉染方法使低分泌CTSD的NCI-H23肺癌細胞系大量分泌CTSD，發現NCI-H23細胞系的侵襲和轉移潛能顯著增強。本組實驗結果顯示，CTSD在高分化胃癌組織、無淋巴結轉移的胃癌組織中的表達水平顯著低于中～未分化胃癌組織及有淋巴結轉移的胃癌組織，且浸潤深度越深、TNM分期越高，CTSD的表達水平越高，提示CTSD的異常表達可能與胃癌的發生、發展具有重要作用，與徐曉艷等[4]、Dian等[5]的研究結果基本一致。

HSP90α是一種伴侶蛋白，輔助蛋白折疊，在腫瘤細胞中，HSP90α能夠使過度激活或突變的信號傳導蛋白保持活性，加速腫瘤細胞的惡性轉變。同時，HSP90α也能調控整合素信號轉導及黏著斑的穩定和功能、影響腫瘤血管形成，參與一些腫瘤的侵襲轉移過程。有研究表明，在胃癌、胰腺癌等實體腫瘤中HSP90α高表達且HSP90α表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期、病理分期等密切相關，其表達越高，預示預后越差[6-7]。本組實驗結果發現，分化程度越低、浸潤深度越深、淋巴結轉移個數越多，胃癌組織中HSP90α的表達水平越高。這些結果提示HSP90α對胃癌發生、發展、侵襲、轉移可能有一定的作用，與王佳泓等[8]報道的在胃癌組織中HSP90表達與浸潤深度、淋巴結轉移個數、TNM分期相關的結果基本一致。

已有研究表明，如大腸癌、胃癌以及食管癌等上皮細胞來源的惡性腫瘤均存在EGFR蛋白的表達及過表達現象，進而促進癌細胞的增殖、血管生成、侵襲和轉移，抑制癌細胞的凋亡[9-10]。Weng等[11]采用DNA甲基化檢測顯示EGFR啟動子甲基化可能是胃癌發生、發展的表觀遺傳學的生物標志。本組實驗結果顯示，在胃癌組織中EGFR表達均與胃癌分化程度、浸潤深度、淋巴結轉移個數、TNM分期相關，與患者性別、年齡、腫瘤大小無關，提示EGFR的過度激活在胃黏膜正常細胞的轉化過程以及胃癌組織中惡性細胞的演進過程中扮演重要角色。

王婭蘭等[12]利用免疫組化法檢測結直腸癌中CTSD與EGFR的表達，兩者呈正相關，且CTSD陽性者淋巴結轉移率明顯高于陰性者，并認為EGFR可以增加CTSD轉錄，從而與促進其分泌有關。陳春鳳等[13]的實驗結果顯示非小細胞肺癌中EGFR與CTSD表達呈明顯正相關，并發現CTSD與EGFR表達具有協同作用，共同促進腫瘤發展。劉世全等[14]的實驗結果顯示食管鱗狀細胞癌中EGFR與HSP90α的表達呈正相關，且兩者表達與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移個數及TNM分期呈正相關，并認為這可能與HSP90α作為分子伴侶可協助EGFR維持其基本功能有關。實驗發現CTSD、HSP90α及EGFR呈兩兩正相關，提示CTSD、HSP90α及EGFR可能在胃癌中形成相互作用組并共同促進胃癌的發生、發展及浸潤、轉移，而具體機制尚需進一步探討。

總之，CTSD、HSP90α與EGFR的表達水平可能與胃癌的發生、發展及侵襲轉移等惡性生物學行為密切相關。

[1] Cheng A L, Huang W G, Chen Z C,etal. Identificating cathepsin D as a biomarker for differentiation and prognosis of nasopharyngeal carcinoma by laser capture microdissection and proteomic analysis[J]. J Proteome Res, 2008,7(6):2415-2426.

[2] Nirdé P, Derocq D, Maynadier M,etal. Heat shock cognate 70 protein secretion as a new growth arrest signal for cancer cells[J]. Oncogene, 2010,29(1):117-127.

[3] Vashishta A, Ohri S S, Proctor M,etal. Ribozyme-targeting procathepsin D and its effect on invasion and growth of breast cancer cells: an implication in breast cancer therapy[J]. Int J Oncol, 2007,30(5):1223-1230.

[4] 徐曉艷, 范鵬程, 馬秀梅. E-鈣黏附素、組織蛋白酶D與胃癌侵襲轉移的關系[J]. 山西醫科大學學報, 2008,39(3):237-241.

[5] Dian D, Vrekoussis T, Shabani N,etal. Expression of cathepsin-D in primary breast cancer and corresponding local recurrence or metastasis:an immunohistochemical study[J]. Anticancer Res, 2012,32(3):901-906.

[6] Wang J, Cui S, Zhang X,etal. High expression of heat shock protein 90 is associated with tumor aggressiveness and poor prognosis in patients with advanced gastric cancer[J]. PLoS One, 2013,8(4):e62876.

[7] Jiang H, Duan B, He C,etal. Cytoplasmic HSP90α expression is associated with perineural invasion in pancreatic cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(6):3305-3311.

[8] 王佳泓, 崔書中, 張相良, 等. 進展期胃癌HSP90的表達及其臨床意義[J]. 臨床腫瘤學雜志, 2013,18(8):394-397.

[9] 劉 萍, 李云峰, 李 強, 等. EGFR、αVβ3、ADAM23 在大腸癌中的表達及臨床意義[J]. 實用癌癥雜志, 2016,31(1):1-3.

[10] Hedner C, Borg D, Nodin B,etal. Expression and prognostic significance of human epidermal growth factor receptors 1 and 3 in gastric and esophageal denocarcinoma[J]. PLoS One, 2016,11(2):e0148101.

[11] Weng X, Zhang H, Ye J,etal. Hypermethylated epidermal growth factor receptor (EGFR) promoter is associated with gastric cancer[J]. Sci Rep, 2015,5:10154.

[12] 王婭蘭, 苗德林, 周 偉. 大腸癌組織蛋白酶D表達及其與EGFR, PCNA表達的關系[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 1998,14(3):261-263.

[13] 陳春風, 趙俊軍. CathD、CD44V6和EGFR在非小細胞肺癌的表達及意義[J]. 中國冶金工業醫學雜志, 2009,26(3):256-258.

[14] 劉世全. 食管鱗癌及食管胃交接部腺癌中EGFR、HER-2及Hsp90α的表達及對預后的影響[D]. 石家莊: 河北醫科大學, 2014.

ExpressionofCTSD,HSP90αandEGFRingastriccancerand
theirclinicalsignificance

LI Yu1,2, CHENG Ai-lan1

(1CancerResearchInstitute,KeyLaboratoryofTumourCellandMolecularPathology,UniversityofSouthChina,Hengyang421001,China;2AnxiangPeople’sHospital,Changde415600,China)

PurposeTo detect the expression of Cathepsin D(CTSD), heat shock protein 90α (HSP90α) and epidermal growth factor receptor (EGFR) in gastric cancer(GC) tissues and to analyze the association of their expression levels and clinical pathological features of GC, the role of CTSD, HSP90α, EGFR in the carcinogenesis, progression, invasion and metastasis of GC.MethodsThe expression of CTSD, HSP90α and EGFR in normal gastric mucosa, dysplasia adjacent to carcinoma, GC tissues and lymph node metastasis was measured by immunohistochemistry (IHC) and in situ hybridization (ISH).ResultsIn 110 cases of normal gastric mucosa, 83 cases of dysplasia adjacent to carcinoma, 110 cases of GC and 78 cases of the lymph node metastasis, the positive rate of CTSD, HSP90α, EGFR protein was 0, 18.7%, 80.91% and 92.31%, 0.9%, 15.66%, 75.45% and 89.74%, 0, 12.05%, 69.09% and 84.62%, respectively. Correlation analysis showed that the expression CTSD, HSP90α and EGFR in GC tissues was positively correlated (rs=0.853,P<0.05,rs=0.639,P<0.05,rs=0.734,P<0.05). Expression of CTSD, HSP90α and EGFR in GC was correlated with the degree of tumor differentiation, invasive depth, number of lymph node metastasis and TNM stages (P<0.05). There was no significant correlation with the patient's age, sex, tumor size (P>0.05).ConclusionCTSD, HSP90α and EGFR may be associated with malignant behavior, development and invasion and metastasis of GC.

gastric neoplasms; CTSD; HSP90α; EGFR; clinicopathologic features

R 735.2

A

1001-7399(2017)10-1074-04

時間：2017-10-23 13:30 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20171023.1330.003.html

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.10.003

接受日期：2017-08-16

國家自然科學基金(81372894、81072198)、湖南省教育廳重點項目(10A104)

1南華大學醫學院腫瘤研究所，衡陽 421001

2湖南省常德市安鄉縣人民醫院病理科，常德 415600

李 禹，女，碩士，醫師。E-mail: 526756791@qq.com

程愛蘭，女，博士，碩士生導師，通訊作者。E-mail: ailan_cheng@hotmail.com