LPS誘導牛子宮內膜細胞miRNA差異表達分析

王 軍 ， 燕曉曉 ， 丁 赫 ， 王靜芳 ， 呂文發

(1.吉林農業大學動物科學技術學院 吉林省反芻動物繁育生物技術與健康養殖工程實驗室 ， 吉林 長春 130118 ；2.新疆阿勒泰畜牧獸醫職業學校 ， 新疆 阿勒泰 836599)

LPS誘導牛子宮內膜細胞miRNA差異表達分析

王 軍1， 燕曉曉1， 丁 赫1， 王靜芳2， 呂文發1

(1.吉林農業大學動物科學技術學院 吉林省反芻動物繁育生物技術與健康養殖工程實驗室 ， 吉林 長春 130118 ；2.新疆阿勒泰畜牧獸醫職業學校 ， 新疆 阿勒泰 836599)

MicroRNA (miRNA)在炎癥反應中起重要作用，本試驗用miRNA測序技術研究了細菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導的牛子宮內膜細胞miRNA差異表達。用1μg/mL 的LPS處理牛子宮內膜細胞24 h，測定細胞上清液IL-6和IL-8分泌量，對細胞進行miRNA測序，并用熒光定量PCR驗證測序結果。結果表明，LPS可誘導牛子宮內膜細胞11個miRNA表達上調、9個miRNA表達下調。差異表達miRNA的靶基因注釋到生物過程的GO term共20個，注釋到細胞組分的GO term共12個，注釋到分子功能的GO term共20個；差異表達miRNA靶基因主要富集于PI3K-Akt和MAPK等信號通路。結果提示，miRNA在LPS誘導的牛子宮內膜細胞炎癥反應中起重要作用，其作用與PI3K-Akt和MAPK等信號通路激活有關。

細菌脂多糖 ； 子宮內膜細胞 ； miRNA測序 ； 差異表達

奶牛子宮內膜炎是由病原微生物感染引起的一種產科疾病，其發病率達20%～40%，給奶牛業造成嚴重的經濟損失[1]。研究奶牛子宮內膜炎的發病機制對于開發新型技術防治該病具有重要意義。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，也是使細胞產生炎癥反應的重要物質[2]，LPS誘導奶牛子宮內膜細胞發生炎癥反應的調節機制一直是研究熱點[3-4]。miRNA是一類長度約為20～24個核苷酸長度的具有調控功能的非編碼RNA，主要參與基因轉錄后水平的調控，在細胞增殖、凋亡、器官形成和機體發育等生理過程中發揮重要作用[5-6]。最近，越來越多的證據表明，miRNA參與炎癥反應的調節[7-8]，但miRNA在LPS誘導牛子宮內膜細胞發生炎癥反應中的作用目前尚不清楚。本試驗利用miRNA測序技術研究LPS感染牛子宮內膜細胞24 h后miRNA的差異表達，為揭示LPS誘導牛子宮內膜細胞發生炎癥反應的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 從屠宰場采集牛子宮角，采用組織塊培養法，于37 ℃，5% CO2飽和濕度培養箱中培養子宮內膜細胞，每2 d更換一次完全培養液，待細胞長滿培養瓶底壁80%時，用0.25%胰酶-EDTA消化細胞傳代培養。

1.2 試驗設計 選擇3～5代生長狀態良好的牛子宮內膜細胞，用1 μg/mL的 LPS (Sigma，美國)處理(LPS組)，對照組用完全培養液培養(Ctr組)，24 h后收集細胞及上清液，上清液用于IL-6和IL-8分泌量測定，細胞用于miRNA測序及后續熒光定量PCR驗證。

1.3 IL-6和IL-8濃度測定 細胞上清液用3 000 r /min離心20 min后，分別用ELISA試劑盒(Life Technologies，美國)測定上清液中IL-6和IL-8濃度，具體操作按試劑盒說明書執行。

1.4 miRNA測序及分析 利用TRIZol法提取細胞總RNA，經檢測，RNA質量合格后，直接將miRNA兩端加上接頭，然后反轉錄合成cDNA，隨后經PCR擴增和切膠回收等環節獲得cDNA文庫。使用Agilent 2100和Q-PCR明確文庫質量合格后，進行HiSeq/MiSeq測序。將測序序列與miRBase 20.0數據庫中牛的已知miRNAs比對分析，得到miRNA表達結果，分別使用log2比率(火山圖)和散點圖比較兩組共同表達的miRNA表達量差異，并將差異表達的miRNA進行聚類分析，利用miRBase數據庫中的軟件及數據對差異表達的miRNA進行靶基因預測，利用Blast等軟件對靶基因進行GO分析和KEGG分析。

1.5 熒光定量PCR 為驗證miRNA測序的可靠性，隨機選擇4個miRNA，采用polyA加尾法進行miRNA的熒光定量PCR驗證。利用TRIZol法提取細胞總RNA，通過實時熒光定量 PCR測定miRNA表達量。miRNA引物及內參U6的引物信息見表1。實時熒光定量 PCR總反應體系中含SYBR PremixExTaq10 μL、ROX reference dye 0.4 μL、上下游引物各0.8 μL、cDNA 2 μL和滅菌去離子水6 μL。反應條件：預變性95 ℃ 30 s、變性95 ℃ 5 s、退火溫度持續34 s、延伸95 ℃ 15 s，共40個循環。利用2-△△Ct法分析miRNA相對表達量。

表1 miRNA熒光定量PCR引物信息

1.6 統計分析 利用SPSS18.0軟件對試驗結果進行分析，t檢驗法比較分析Ctr組和LPS組之間的差異，顯著水平為Plt;0.05。

2 結果與分析

2.1 細胞培養液中IL-6和IL-8水平 圖1表明，LPS處理24 h可顯著提高奶牛子宮內膜細胞IL-6和IL-8分泌量(Plt;0.01)，提示LPS處理成功。

圖1 不同處理組細胞培養液上清IL-6和IL-8濃度

2.2 miRNA測序結果 測序結果表明，LPS處理24 h后牛子宮內膜細胞有20個miRNA差異表達，其中11個miRNA上調、9個miRNA下調(見中插彩版圖2A、C、D)。隨機選取的4個miRNA熒光定量PCR結果也與miRNA測序結果一致(見中插彩版圖2B)，表明測序結果的準確性。差異表達miRNA的靶基因GO分析結果表明，差異基因注釋到生物過程、細胞組分和分子功能的GO term分別為20，12個和20個(圖3)。差異表達miRNA靶基因KEGG分析結果表明，LPS誘導牛子宮內膜細胞差異表達miRNA的靶基因主要富集于PI3K-Akt等信號通路(見中插彩版圖4)。

圖3差異表達miRNA靶基因GO分析(LPSvsCtr)

注：BP:生物過程； CC：細胞組成； MF：分子功能

3 討論

LPS可誘導牛子宮內膜細胞IL-6、IL-8和IL-1β等炎癥因子表達量上升，引發炎癥反應，但其表達調控機制目前尚不清楚。本試驗利用miRNA測序技術研究了LPS對牛子宮內膜細胞miRNA表達的影響，發現11個miRNA表達上調和9個miRNA表達下調，并明確了這些差異表達miRNA靶基因富集的信號通路。研究結果不僅為明確miRNA參與LPS誘導牛子宮內膜細胞發生炎癥反應的調節提供證據，也為研究LPS誘導牛子宮內膜細胞炎癥反應的分子機制提供參考。

本試驗發現的20個差異表達miRNA，雖然在牛子宮內膜炎上鮮有報道，但對其他物種的研究顯示，多個miRNA參與炎癥反應。miR-20a等參與miRNA靶向調控SIRPα表達介導巨噬細胞的炎癥反應過程[9]，miR-375不僅可調節食管和支氣管上皮細胞IL-13的表達[10]，而且可調節胸腺基質淋巴細胞生成素的產生[11]。結核分枝桿菌感染鼠樹突狀細胞時，miR-99b 可調節IL-6、IL-12和 IL-1β等炎癥細胞因子的釋放[12]；let-7c 可通過靶向調控STAT3調控肺泡巨噬細胞炎癥反應[13]。此外，我們發現LPS誘導牛子宮內膜細胞差異表達miRNA的靶基因主要富集于PI3K-Akt和MAPK等信號通路，以往報道支持這一發現。已有研究表明，LPS可通過激活多種細胞PI3K-Akt或MAPK信號通路而引發炎癥反應[14-15]。本研究雖然揭示了miRNA在LPS誘導牛子宮內膜細胞炎癥反應中的作用，但其作用機制有待深入研究。

4 結論

miRNA在LPS誘導的牛子宮內膜細胞炎癥反應中起重要作用，其作用與PI3K-Akt和MAPK等信號通路激活有關。

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Lipopolysaccharide-InducedDifferentialExpressionofmiRNAsinBovineendometrialcells

WANG Jun1, YAN Xiao-xiao1, DING He1, WANG Jing-fang2, LV Wen-fa1

(1.Jilin Province Engineering Laboratory for Ruminant Reproductive Biotechnology and Healthy Production，College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China；2.Xinjiang Altay Animal Husbandry and Veterinary Schools Vocational Schools，Altay 836599,China)

MicroRNA (miRNA) plays important roles in inflammation response, the present study was conducted to study differential expression of miRNA in bovine endometrial cells induced by Lipopolysaccharide (LPS) using miRNA sequencing method. Firstly, bovine endometrial cells were treated with 1.0 μg/ml of LPS for 24 h, then concentration of IL-6 and IL-8 in cell supernatant and miRNA expression pattern of cell were determined using ELISA Kit and miRNA sequencing. Finally, real-time PCR was used to verify results of miRNA sequencing. The results showed that LPS stimulation led to differential expression of 20 miRNAs with 11 up-regulated and 9 down-regulated miRNAs. Target genes of the 20 miRNAs were referred to 20 Go terms for biological processes, 12 Go terms for cellular component and 20 Go terms for molecular function. Results of KEGG analysis showed that the target genes were significantly enriched in PI3K-Akt and AMPK signaling pathway. These results indicated that miRNA play important roles in the inflammation response of bovine endometrial cells induced by LPS, which may be achieved by the activation of PI3K-Akt and MAPK signaling pathway.

LPS ； endometrial cells ； miRNA sequencing ； differential expression

LV Wen-fa

S823

A

0529-6005(2017)10-0010-03

2017-07-24

國家自然科學基金面上項目(31672420)；吉林省科技廳項目(20150519018JH ，20150204074NY ，20160209001NY)

王軍(1979-)，男，副教授，博士，主要從事動物繁殖調控研究，E-mail: junwang2004@126.com

呂文發，E-mail: wenfa2004@163.com