miR-199a-3p對Eca109和KYSE450細胞周期和遷移的影響*

劉襄艷，侯桂琴，高 盼，凡 丞，張幸麗，師瑩瑩，魯照明

miR-199a-3p對Eca109和KYSE450細胞周期和遷移的影響*

劉襄艷，侯桂琴，高 盼，凡 丞，張幸麗，師瑩瑩，魯照明#

miR-199a-3p；食管鱗癌；細胞周期；細胞遷移；Eca109；KYSE450

目的：觀察miR-199a-3p對食管鱗癌細胞周期及遷移能力的影響，并探討其分子機制。方法常規培養Eca109和KYSE450細胞，分別轉染miR-199a-3p mimics及miR-199a-3p mimics negative control(陰性對照)。采用qRT-PCR法檢測3組細胞中miR-199a-3p的表達水平，并用流式細胞術及劃痕實驗分別檢測細胞周期及細胞遷移能力，用Western blot檢測細胞中mTORC2信號通路相關蛋白[mTOR、Rictor、PI3K、p-Akt(T308)、p-Akt(S473)]的表達。結果與陰性對照相比，轉染miR-199a-3p mimics后，Eca109和KYSE450細胞中miR-199a-3p表達量增加； G1期細胞增多，細胞相對遷移率降低，mTOR和Rictor蛋白的表達水平降低，而PI3K、p-Akt(T308)和p-Akt(S473)蛋白的表達水平升高(P均<0.05)。結論miR-199a-3p可能通過調控mTORC2信號通路來影響食管鱗癌細胞周期進程及細胞遷移。

microRNA是一類長度約為22 nt的非編碼RNA(ncRNA)，其分布廣泛且功能幾乎涉及與腫瘤相關的所有過程，包括增殖、分化、凋亡、轉移、血管生成、 免疫應答等[1]。microRNA的作用機制較為單一，其通過完全或部分互補的原則結合到靶基因mRNA 3’端非翻譯區，以降解或抑制mRNA翻譯的方式調控靶基因的表達。microRNA-199a-3p(miR-199a-3p)是眾多microRNA中的一種，已有研究[2-4]觀察了其在肝癌、卵巢癌、骨肉瘤中的作用，但其在食管癌中的研究很少。mTOR是雷帕霉素的靶分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，根據與其結合的物質不同，在體內主要以兩種復合物的形式存在，即mTORC1和mTORC2。mTOR與Raptor等蛋白構成mTORC1，與Rictor等蛋白構成mTORC2，不同形式的mTOR產生的生理作用不同[5]。有報道[2]顯示，miR-199a-3p對mTOR具有靶向調控作用，但具體調控機制仍不清楚。因此，該研究擬以食管鱗癌細胞為研究對象，探討miR-199a-3p對食管鱗癌細胞周期和遷移能力的影響，并探討其對mTORC2信號通路的影響，為進一步探討miR-199a-3p在食管鱗癌發生中的作用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1細胞株與主要試劑Eca109細胞購自中國科學院上海生物所細胞庫，KYSE450細胞由中國醫學科學院腫瘤醫院惠贈。RPMI 1640培養基和胎牛血清購自以色列BI公司，細胞周期檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，抗體PI3K(#13666)、p-Akt(S473)(#4060)、p-Akt(T308)(#13038)、mTOR(#2983)、Rictor(#2114)及GAPDH(#5174)均購自美國CST公司，RNA反轉錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司，轉染試劑siRNA-MateTM購自上海吉瑪制藥技術有限公司，miR-199a-3p mimics序列、miR-199a-3p mimics negative control序列以及U6內參引物序列也由大連寶生物工程有限公司設計合成。

1.2細胞培養及轉染Eca109和KYSE450細胞加入含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養液，置于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養。將處于對數生長期的Eca109和KYSE450細胞分別接種于6孔板(5×105個/孔)，待細胞匯合度達到30%～50%時，按照siRNA-MateTM說明書轉染miR-199a-3p mimics或miR-199a-3p mimics negative control(陰性對照)，并于轉染6 h后在熒光顯微鏡下觀察轉染效率，同時以未轉染細胞作為空白對照。

1.3qRT-PCR分別提取轉染miR-199a-3p mimics、miR-199a-3p mimics negative control 48 h及未轉染細胞總RNA，反轉錄成cDNA。miR-199a-3p引物序列為上游5’-GCCGAACAGTAGTCTGCACAT-3’，下游5’-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3’；U6引物序列為上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。qRT-PCR反應體系為20 μL，其中SYBR?Premix Ex Taq?(TliRNaseH Plus)10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，dH2O 6.4 μL。擴增條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，62 ℃ 30 s，40個循環。按2-ΔΔCt計算miR-199a-3p的相對表達量。實驗重復3次。

1.4細胞周期檢測收集轉染miR-199a-3p mimics及miR-199a-3p mimics negative control 48 h的Eca109和KYSE450細胞，用PBS洗2遍后加入體積分數70%預冷乙醇固定，混勻后4 ℃保存至少24 h。測定前1 000 r/min離心5 min以除去固定液，用PBS洗3遍后重懸細胞并加入適量RNaseA，37 ℃水浴30 min，之后加入適量的PI染液，混勻，4 ℃避光30 min。最后用流式細胞儀檢測G1期、S期、G2期細胞比例。實驗重復3次。

1.5劃痕實驗收集轉染miR-199a-3p mimics及miR-199a-3p mimics negative control 24 h的Eca109和KYSE450細胞，分別用10 μL的槍頭垂直劃痕；棄去培養基，并用PBS洗3遍，之后加入無血清培養基，分別于0、24 h置于倒置顯微鏡下拍照，并記錄劃痕寬度。應用Image J圖像處理軟件對劃痕寬度進行分析，以陰性對照組作為標準控制組，計算相對遷移率。遷移距離=0 h寬度-24 h寬度；相對遷移率(%)=遷移距離/陰性對照組平均遷移距離×100%。實驗重復3次。

1.6Westernblot收集轉染miR-199a-3p mimics及miR-199a-3p mimics negative control 48 h及未轉染細胞的Eca109和KYSE450細胞并分別提取總蛋白，Western blot檢測mTORC2信號通路相關蛋白表達水平。蛋白上樣量為20 μg。mTOR、Rictor、 PI3K、p-Akt(T308)、p-Akt(S473)和GAPDH一抗的稀釋比例均為11 000，二抗的稀釋比例均為110 000。電泳后用濕轉儀將蛋白轉移到NC膜上，轉膜條件為300 mA，2 h；將NC膜用50 g/L脫脂牛奶封閉，置于搖床上輕搖2 h；加一抗4 ℃過夜；PBS洗3遍，加入二抗置于搖床上輕搖2 h；PBS洗3遍后將ECL發光液加在NC膜上，于暗室進行曝光。實驗結果采用Image J圖像處理軟件進行灰度分析。以目的蛋白與GAPDH灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.7統計學處理用SPSS 21.0進行統計學處理。采用單因素方差分析比較未轉染組、陰性對照組及轉染miR-199a-3p mimics組食管癌細胞miR-199a-3p的相對表達量及mTORC2信號通路相關蛋白表達的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗；采用兩獨立樣本的t檢驗比較陰性對照組及轉染miR-199a-3p mimics組食管癌細胞周期分布和相對遷移率的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1轉染miR-199a-3pmimics對食管鱗癌細胞中miR-199a-3p表達的影響Eca109和KYSE450細胞在轉染miR-199a-3p mimics及其陰性對照6 h后，在熒光顯微鏡下均可看到較強的綠色熒光；轉染48 h后qRT-PCR檢測結果顯示，與其他2組相比，轉染miR-199a-3p mimics組中miR-199a-3p的表達升高，而陰性對照組則沒有明顯變化，見表1。

表1 各組細胞中miR-199a-3p的相對表達量(n=3)

*：與其他2組比較，P<0.001。

2.2轉染miR-199a-3pmimics對食管鱗癌細胞周期的影響流式細胞術檢測結果顯示，與陰性對照組相比，轉染miR-199a-3p mimics 的Eca109和KYSE450細胞中G1期細胞比例升高，S期細胞比例降低，見表2、3。

表2 Eca109不同分組細胞周期分布情況(n=3) %

表3 KYSE450不同分組細胞周期分布情況(n=3) %

2.3轉染miR-199a-3pmimics對食管鱗癌細胞遷移能力的影響Eca109和KYSE450細胞中轉染miR-199a-3p mimics的細胞相對遷移率低于陰性對照組，見表4。

表4 各組細胞的相對遷移率(n=3) %

2.4轉染miR-199a-3pmimics對食管鱗癌細胞mTORC2信號通路相關蛋白表達的影響Western blot結果證實，與未轉染組及陰性對照組相比，轉染miR-199a-3p mimics的Eca109和KYSE450細胞中mTOR和Rictor蛋白的表達水平降低，而p-Akt(T308)、p-Akt(S473)和PI3K的表達水平升高(圖1，表5、6)。

上圖：Eca109；下圖：KYSE450。圖1 miR-199a-3p mimics轉染對Eca109和KYSE450細胞mTORC2信號通路相關蛋白表達的影響

組別mTORRictorp?Akt(S473)PI3Kp?Akt(T308)未轉染組0．763±0．0120．923±0．0490．807±0．0290．673±0．0740．620±0．160陰性對照組0．783±0．0210．927±0．1000．850±0．0440．693±0．0960．850±0．137轉染miR?199a?3pmimics組0．613±0．025?0．390±0．072?1．067±0．076?1．103±0．083?1．147±0．110?F64．75048．60620．62624．54211．098P<0．001<0．0010．0020．0010．010

*：與其他2組比較，P<0.01。

表6 KYSE450各組細胞中相關蛋白表達的比較(n=3)

*：與其他2組比較，P<0.05。

3 討論

研究[6-7]發現，在哺乳動物基因組中，只有不到2%的轉錄產物具有蛋白編碼功能，其余98%均為ncRNA，其中microRNA是由較長的初級轉錄物經過一系列核酸酶剪切加工而得到的長度較短的一類ncRNA。近幾年的功能學研究[8]表明，microRNA既可以作為促癌基因參與腫瘤的發生和發展，也可作為抑癌基因控制惡性腫瘤的形成。Wang等[9]研究發現miR-199a-3p可以調節體細胞的細胞重構，其過表達可以通過阻滯細胞周期來抑制細胞的增殖。此外,肝癌中miR-199a-3p不僅可以影響細胞周期進程，而且可以調節細胞的侵襲能力[2]。作者的研究結果也證實，在兩種食管鱗癌細胞中miR-199a-3p過表達均可影響食管鱗癌細胞的周期進程，并將細胞阻滯于G1期，同時對細胞遷移也有明顯的抑制作用。

研究[10]發現，與腫瘤發生密切相關的多種生理過程如細胞生長增殖、細胞周期調控、細胞遷移等都受到mTOR信號通路的調控，許多腫瘤都伴有mTOR信號通路的異常。其中mTORC2信號通路可以有效調節細胞的遷移能力[11-12]。Fornari等[2]在肝癌中證實miR-199a-3p對mTOR具有靶向調節作用，但其對mTORC2信號通路具體的調節作用還不清楚。該研究結果證實，miR-199a-3p能抑制mTORC2信號通路中mTOR和Rictor蛋白的表達，因此在食管鱗癌中miR-199a-3p或許可以通過調節mTORC2信號通路進而影響食管鱗癌細胞周期進程及細胞遷移能力。但是在實驗中還發現，miR-199a-3p促進了PI3K、p-Akt(S473)和p-Akt(T308)蛋白的表達，這可能因為miR-199a-3p在對mTORC2調控的同時使PI3K-Akt信號通路負反饋激活，而Akt的激活會促進癌細胞的存活、增殖和生長，這一點與mTOR抑制劑對Akt產生的負反饋作用類似，也因此可能導致癌細胞對mTOR抑制劑產生耐藥性，這也是mTOR抑制劑用于臨床治療腫瘤時出現的一個違背人們意愿的結果[13-14]。miR-199a-3p對Akt的激活或許會減弱其對食管鱗癌細胞周期和遷移的作用，若能與Akt通路抑制劑聯用或許會有更好的效果，作者在這方面的研究正在進行中。該研究探討了miR-199a-3p在食管鱗癌細胞中的作用及作用機制，為進一步探討食管鱗癌分子發生發展機制及尋找分子治療靶點和治療方法提供了實驗基礎和理論依據。

[1] 任昊天,張巍.miRNA在癌癥的診斷與治療中的研究進展[J].中國社區醫師(醫學專業),2012,14(32):7

[2] FORNARI F,MILAZZO M,CHIECO P,et al.MiR-199a-3p regulates mTOR and c-Met to influence the doxorubicin sensitivity of human hepatocarcinoma cells[J].Cancer Res,2010,70(12):5184

[3] KINOSE Y,SAWADA K,NAKAMURA K,et al.The hypoxia-related microRNA miR-199a-3p displays tumor suppressor functions in ovarian carcinoma[J].Oncotarget,2015,6(13):11342

[4] ZHANG L,LYER AK,YANG X,et al.Polymeric nanoparticle-based delivery of microRNA-199a-3p inhibits proliferation and growth of osteosarcoma cells[J].Int J Nanomedicine,2015,10:2913

[5] 陸建國,俞松.mTOR信號通路與腫瘤研究進展[J].現代醫藥衛生,2015,31(2):199

[6] ENCODE Project Consortium,BIRNEY E, STAMATOYANNOPOULOS JA，et al.Identification and analysis of functional elements in 1% of the human genome by the ENCODE pilot project[J].Nature,2007,447(7146):799

[7] WANG Z,LI X.The role of noncoding RNA in hepatocellular carcinoma[J].Gland Surg,2013,2(1):25

[8] 王蘭,袁芳芳,呂曉慧,等.miRNA與腫瘤性疾病相關研究進展[J].畜牧與飼料科學,2014,35(9):33

[9] WANG J,HE Q,HAN C,et al.p53-facilitated miR-199a-3p regulates somatic cell reprogramming[J].Stem Cells,2012,30(7):1405

[10]潘智,張令強,蔣繼志,等.mTOR的研究進展[J].細胞生物學雜志,2006,28(3):395

[11]ZHANG X,WANG X,XU T,et al.Targeting of mTORC2 may have advantages over selective targeting of mTORC1 in the treatment of malignant pheochromocytoma[J].Tumour Biol,2015,36(7):5273

[12]AGARWAL NK,CHEN CH,CHO H,et al.Rictor regulates cell migration by suppressing RhoGDI2[J].Oncogene,2013,32(20):2521

[13]O′REILLY KE,ROJO F,SHE QB,et al.mTOR inhibition induces upstream receptor tyrosine kinase signaling and activates Akt[J].Cancer Res,2006,66(3):1500

[14]WANG X,YUE P,KIM YA,et al.Enhancing mammalian target of rapamycin(mTOR)-targeted cancer therapy by preventing mTOR/raptor inhibition-initiated,mTOR/rictor-independent Akt activation[J].Cancer Res,2008,68(18):7409

(2016-12-03收稿 責任編輯徐春燕)

Effects of miR-199a-3p on cell cycle and migration of Eca109 and KYSE450 cells

LIUXiangyan,HOUGuiqin,GAOPan,FANCheng,ZHANGXingli,SHIYingying,LUZhaoming

SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

miR-199a-3p; esophageal squamous cell carcinoma; cell cycle; cell migration；Eca109；KYSE450

Aim: To study the effects and molecular mechanism of miR-199a-3p on cell cycle and migration in esophageal squamous cell carcinoma.MethodsmiR-199a-3p mimics and miR-199a-3p mimics negative control were transfected into Eca109 and KYSE450 cells,and the expression level of miR-199a-3p in cells was detected by qRT-PCR.The cell cycle and migration were investigated by flow cytometry and wound healing assay, and the mTORC2 signaling pathway-related proteins such as mTOR,Rictor,PI3K,p-Akt(T308), and p-Akt(S473) were detected by Western blot.ResultsThe expression of miR-199a-3p was significantly increased in two cell lines after transfected with miR-199a-3p mimics(P<0.001). The results of cell cycle and wound healing assay showed that in cells transfected with miR-199a-3p mimics,the percentage of G1 phase cells was higher and the rate of cell migration was lower compared with those transfected with miR-199a-3p mimics negative control(P<0.05).Western blot results confirmed that the expression levels of mTOR and Rictor were obviously reduced, while those of PI3K,p-Akt(T308) and p-Akt(S473) were obviously increased in cells transfected with miR-199a-3p mimics than those transfected with miR-199a-3p mimics negative control(P<0.05).ConclusionmiR-199a-3p may affect the cell cycle and migration of esophageal squamous cell carcinoma cells through regulating the mTORC2 signaling pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.002

*國家自然科學基金資助項目 30901778;河南省基礎與前沿技術研究計劃項目 162300410122

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

#通信作者，男，1966年11月生，博士，副教授，研究方向：腫瘤細胞分子生物學，E-mail:lzm310@zzu.edu.cn

R735.1