食管鱗癌細胞中LSD1通過與Notch靶基因啟動子結合調控Notch通路相關蛋白表達*

張幸麗，侯桂琴，凡 丞，劉襄艷，高 盼，田 菲，白一汝，趙 琦，魯照明

食管鱗癌細胞中LSD1通過與Notch靶基因啟動子結合調控Notch通路相關蛋白表達*

張幸麗，侯桂琴，凡 丞，劉襄艷，高 盼，田 菲，白一汝，趙 琦，魯照明#

食管鱗癌；LSD1；Notch；Hes1

目的：探討食管鱗癌細胞中LSD1對Notch信號通路的調控作用及調控機制。方法Western blot法檢測5種食管鱗癌細胞KYSE450、KYSE790、Eca109、EC9706和TE-1中LSD1及Notch通路相關蛋白的表達情況。用LSD1抑制劑TCP 處理KYSE450、KYSE790和Eca109細胞或用LSD1 siRNA處理Eca109細胞，Western blot檢測處理前后細胞中LSD1、組蛋白H3K4me2和Notch信號通路相關蛋白的表達情況。結果5種食管鱗癌細胞中均存在LSD1及Notch信號通路相關蛋白的表達，且表達水平不同；TCP處理后，與未處理組相比，KYSE450、KYSE790和Eca109細胞中LSD1的表達水平均降低，組蛋白H3K4me2表達升高，Notch信號通路相關蛋白的表達均降低(P<0.05)；LSD1 siRNA同樣使Eca109細胞中LSD1與Notch信號通路相關蛋白表達受到抑制(P<0.05)。結論食管鱗癌細胞中LSD1對Notch信號通路有調節作用，且LSD1可能是通過與Notch靶基因Hes1的啟動子區域結合實現的。

食管癌是常見的消化道腫瘤之一，根據其病理學特征分為食管鱗癌和食管腺癌兩種類型[1]。在中國常見的是食管鱗癌，其發病率在河南省最高。其侵襲性強、預后差、多伴有淋巴結轉移且易復發的特點促使人們從分子水平上了解食管鱗癌的發生機制，以尋找有效的分子治療靶點。賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1，LSD1)是一個黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性胺氧化酶，能夠特異性去除組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4)和第9位賴氨酸(H3K9)上的單雙甲基基團[2]。研究[3]表明，LSD1參與調控腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲等，并且在多種腫瘤的發生及發展中發揮重要作用。Notch信號通路是通過細胞間相互作用來調節生物體生長發育的一個十分保守的信號通路[4]。Notch信號的產生是通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經過3次剪切，由胞內區(NICD)釋放進入細胞質，并進入細胞核與轉錄因子CSL結合，形成NICD/CSL轉錄激活復合體，從而調控下游Hes1、DTX1等靶蛋白發揮生物學作用。Notch的異常表達常與腫瘤細胞的侵襲、轉移和凋亡等過程密切相關[5]。該研究從分子水平探討食管鱗癌中LSD1對Notch信號通路的調控作用及調控機制，為進一步了解食管鱗癌發生的分子機制提供實驗基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1細胞株與材料食管鱗癌細胞株Eca109、EC9706和TE-1購自上海中科院細胞庫，KYSE450、KYSE790由鄭州大學第一附屬醫院病理科李晟磊博士惠贈；RPMI 1640培養基與胎牛血清均購自以色列BI公司，LSD1抑制劑反苯環丙胺硫酸鹽(TCP)購自美國Medchemexpress公司，LSD1 siRNA和siRNA-Mate均購自上海吉瑪公司，抗體LSD1[普通和染色質免疫沉淀(ChIP)級別]和Hes1均購自美國Abcam公司，Notch3、Notch1、H3K4me2購自美國CST公司，DTX1購自美國GeneTex公司， ChIP檢測試劑盒購自德國Millipore公司，real-time PCR試劑盒購自美國Roche公司，real-time PCR引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。內參GAPDH引物：上游5’-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’，下游5’-TCGAA CAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。Hes1基因不同區域的擴增引物共4對。引物1：上游5’-AGGTCACCCA GAGTCAGGAA-3’，下游5’-CAAGCGTCTTGTTTGAT GTG-3’；引物2：上游5’-CGTGTCTCCTCCTCCCATT-3’，下游5’-GAGAGGTAGACGGGGGATTC-3’；引物3：上游5’-TCAACACAGCACCGGATAAA-3’，下游5’-TCAGCT GGCTCAGACTTTCA-3’；引物4：上游5’-GGCTTTTG GTGGAATTTGAA-3’，下游5’-TCATGGAGGATTGGT GAAAAG-3’。

1.2細胞培養食管癌細胞株均用含體積分數10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養基，于37 ℃、體積分數5%CO2培養箱中培養，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3不同處理方式食管鱗癌細胞中LSD1和Notch信號通路相關蛋白的Westernblot檢測收集培養至對數生長期的5種食管鱗癌細胞，提取細胞總蛋白；并且分別用0、10、50 μmol/L TCP處理KYSE450、KYSE790和Eca109細胞48 h，提取細胞總蛋白和組蛋白，Western blot法檢測5種食管鱗癌細胞中LSD1與Notch信號通路相關蛋白的表達情況及TCP對上述各蛋白及組蛋白的影響。首先將蛋白用SDS-PAGE分離膠分離并濕轉至硝酸纖維素膜，將膜用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別與一抗(LSD1、Notch1、DTX1、Hes1 和H3K4me2均按11 000稀釋)或β-actin、H3 內參抗體4 ℃孵育過夜，PBST洗滌后再用相應的二抗室溫孵育2 h，PBST洗滌后加ECL發光液孵育1 min，暗室顯影曝光。實驗重復3次，用Image J軟件對條帶進行灰度分析。

1.4LSD1siRNA對Eca109細胞中Notch信號通路相關蛋白表達的影響Eca109細胞以1.5×105個/孔接種至6孔板，培養至融合度達30%～50%時，用LSD1 siRNA轉染細胞，具體步驟如下：將LSD1 siRNA或陰性對照siRNA溶液加入200 μL無血清培養基中，使其終濃度為150 nmol/L，輕輕混勻后室溫放置5 min，然后加入5 μL siRNA-Mate充分混勻，室溫放置10 min后逐滴加入細胞培養孔，輕輕混勻后繼續培養，6 h后熒光拍照，72 h后收集細胞并提取總蛋白，Western blot檢測LSD1與Notch3、Notch1、DTX1和Hes1的表達。實驗重復3次。

1.5ChIP法檢測Eca109細胞中LSD1與Hes1基因啟動子結合情況用100 nmol/L的TCP處理Eca109細胞，48 h后采用ChIP法檢測LSD1與Hes1基因啟動子結合情況。主要步驟如下。①用體積分數1%的甲醛溶液對細胞中蛋白-DNA進行交聯，然后用SDS裂解緩沖液裂解細胞。②用細胞超聲破碎儀超聲斷裂細胞染色質，然后4 ℃離心取上清。③免疫共沉淀。上清中加入蛋白G-瓊脂糖小珠，4 ℃振搖1 h后離心，取體積分數1%蛋白裂解液上清作為對照，在剩余的上清中分別加入免疫共沉淀抗體，包括陽性對照抗體、陰性對照抗體和LSD1抗體(ChIP級別)，4 ℃搖床孵育過夜后，向溶液中加入蛋白G-瓊脂糖小珠以吸附免疫沉淀復合物，離心去上清，依次用低鹽、高鹽、氯化鋰和TE緩沖液清洗蛋白G-瓊脂糖小珠。④用洗脫緩沖液洗脫免疫沉淀復合物，同時在裝有對照蛋白裂解液的管中加入相同體積的洗脫緩沖液。⑤依次用5 mol/L NaCl、RNase A、0.5 mol/L EDTA、1 mol/L Tis-HCl和蛋白酶K處理上述洗脫緩沖液，以使蛋白-DNA結合物解交聯，并用DNA純化柱回收DNA。⑥real-time PCR分析LSD1蛋白與Notch靶基因Hes1啟動子區域的結合情況。PCR反應體系：10 μL Master Mix，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，用滅菌雙蒸水補足20 μL。用三步法PCR反應程序(預變性：95 ℃ 10 min；PCR反應：95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共45個循環；溶解：95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s)進行擴增，擴增結果用ΔΔCt值進行相對定量，分別計算Eca109細胞中Hes1基因不同結合區域擴增片段的富集效率(代表特異性抗體所沉淀的目的蛋白水平)，分析LSD1與Hes1基因啟動子不同區域的結合情況。實驗重復3次。

1.6統計學處理采用SPSS 21.0進行數據分析。多組間LSD1及Notch信號通路相關蛋白表達的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；陰性對照組和LSD1 siRNA組LSD1及Notch信號通路相關蛋白表達的比較，TCP處理前后Eca109細胞中Hes1基因不同結合區域擴增片段的富集效率的比較，均采用兩獨立樣本的t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 5種食管鱗癌細胞中LSD1與Notch信號通路相關蛋白的表達情況結果見圖1。由圖1可以看出，Notch信號通路相關蛋白在不同食管鱗癌細胞中表達不同，LSD1在5種食管鱗癌細胞中表達均較高，尤其在Eca109和EC9706細胞中表達最高。

1～5：分別為KYSE450、KYSE790、Eca109、EC9706、TE-1細胞。圖1 5種食管鱗癌細胞中LSD1與Notch信號通路相關蛋白的表達情況

2.2TCP對KYSE450、KYSE790和Eca109細胞中LSD1、H3K4me2和Notch信號通路相關蛋白表達的影響結果見圖2、3和表1～4。可知，不同濃度TCP處理3種細胞后，LSD1的表達均不同程度降低，組蛋白H3K4me2表達升高，Notch信號通路相關蛋白DTX1、Hes1的表達受到抑制。

1～3：分別為0、10、50 μmol/L TCP處理后細胞。圖2 TCP對食管鱗癌細胞中LSD1與組蛋白H3K4me2表達的影響

1～3：分別為0、10、50 μmol/L TCP處理后細胞。圖3 TCP對食管鱗癌細胞中Notch信號通路相關蛋白表達的影響

c(TCP)/(μmol·L-1)nKYSE450KYSE790Eca109031．457±0．0811．328±0．1021．278±0．0531030．689±0．140?0．956±0．0310．816±0．0825030．601±0．034?0．631±0．152?0．657±0．093?F13．33734．95412．770P0．006<0．0010．007

*：與0 μmol/L TCP組比較，P<0.05。

*：與0 μmol/L TCP組比較，P<0.05。

表3 不同濃度TCP對KYSE450、KYSE790和Eca109細胞中DTX1蛋白表達的影響

*：與0 μmol/L TCP組比較，P<0.05。

表4 不同濃度TCP對KYSE450、KYSE790和Eca109細胞中Hes1蛋白表達的影響

*：與0 μmol/L TCP組比較，P<0.05。

2.3LSD1siRNA對Eca109細胞中Notch信號通路相關蛋白表達的影響結果(圖4、表5)顯示，與陰性對照組相比，LSD1 siRNA組細胞中LSD1表達降低，而Notch信號通路相關蛋白Notch3、Notch1、DTX1、Hes1表達也降低。

1：陰性對照組；2：LSD1 siRNA組。圖4 LSD1 siRNA對Eca109細胞中LSD1與Notch信號通路相關蛋白表達的影響

組別nLSD1Notch3Notch1DTX1Hes1陰性對照組30．792±0．0151．128±0．0290．672±0．0190．838±0．0120．494±0．017LSD1siRNA組30．061±0．0630．418±0．0880．517±0．0830．551±0．0730．427±0．037t39．45124．0207．0519．6057．001P0．0030．0080．0310．0360．042

2.4LSD1蛋白在Notch靶基因Hes1基因啟動子區域結合情況引物序列擴增片段在Hes1基因的位置見圖5。Eca109細胞中Hes1基因不同結合區域擴增片段的富集效率見表6。從表6可以看出，與未處理細胞相比，TCP處理后細胞中LSD1蛋白在Hes1基因1和4區域擴增片段的富集效率明顯降低。

TSS：轉錄起始位點。圖5 引物序列擴增片段在Hes1基因的位置

c(TCP)/(μmol·L-1)nHes1基因結合區域1區2區3區4區030．011±0．0010．007±0．0010．006±0．0010．014±0．00110030．004±0．0010．008±0．0010．007±0．0130．011±0．001t593．2512．4191．61521．208P<0．0010．1950．2730．010

3 討論

腫瘤的發生發展不僅取決于遺傳因素，同時也受到表觀遺傳修飾如DNA甲基化的影響[6]。現代研究[7]認為，組蛋白的甲基化失衡和腫瘤發生存在著密切聯系。LSD1是第一個被確定的組蛋白去甲基化酶，它催化H3K4me1/2和H3K9me1/2的去甲基化[8-9]。LSD1定位于細胞核內，調控基因轉錄的激活和抑制，被譽為細胞深處的基因“開關”，在胚胎發育和腫瘤發生的過程中起著重要的作用。Notch信號通路在細胞的分化發育、腫瘤的發生發展中有著重要作用[10-11]。

LSD1與Notch信號通路在腫瘤發生中均起到非常重要的作用，二者是否互相影響、共同調控腫瘤的發生發展，目前此方面的研究報道甚少。有報道[6]顯示：在果蠅發育中SIRT1和LSD1直接相互作用，并在H4K16脫乙酰化和H3K4脫甲基化中發揮保守和協同作用，以抑制由Notch信號通路調節的基因。在T細胞急性淋巴細胞白血病中證實，組蛋白修飾即LSD1對組蛋白的去甲基化在Notch1信號通路中起重要作用[12]。并且LSD1能和其他蛋白形成復合體，調節Notch1信號通路，從而調節細胞的增殖、侵襲和轉移。另外，與LSD1形成復合體的蛋白不同，LSD1發揮的功能也不同，即LSD1在Notch1信號通路中可能發揮雙重作用。由于食管鱗癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，尤其是河南省食管鱗癌的發生率和病死率均很高[13-14]，因此，探討食管鱗癌中LSD1是否對Notch通路具有調控作用具有重要意義。該研究結果顯示：在食管鱗癌細胞中，用LSD1抑制劑TCP或LSD1 siRNA干預均能抑制LSD1的表達，并影響其功能；而LSD1功能受抑制后，Notch信號通路也受到抑制，表明LSD1可能調控Notch信號通路。ChIP結果顯示，LSD1能與Notch通路靶基因Hes1的啟動子區域結合。

綜上所述，在食管鱗癌細胞中LSD1可能通過與Notch通路靶基因Hes1的啟動子區域結合，從而調控Notch通路。

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(2016-12-08收稿 責任編輯姜春霞)

LSD1 regulates expression of related proteins of Notch pathway through combining promotor of target gene of Notch in esophageal squamous cell carcinoma cells

ZHANGXingli,HOUGuiqin,FANCheng,LIUXiangyan,GAOPan,TIANFei,BAIYiru,ZHAOQi,LUZhaoming

CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

esophageal squamous cell carcinoma;LSD1;Notch;Hes1

Aim: To explore the regulation effects and mechanism of LSD1 on Notch signaling pathway in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) cells.MethodsThe expressions of LSD1 and Notch signaling pathway-related proteins in five ESCC cell lines KYSE450, KYSE790, Eca109, EC9706 and TE-1 were investigated by Western blot. After ESCC cells were treated with TCP or LSD1 siRNA, respectively, the expressions of LSD1, histone H3K4me2 and the related proteins of Notch signaling pathway were detected by Western blot.ResultsThere were different expression levels of LSD1 and Notch signaling pathway-related proteins in five ESCC cell lines. After KYSE450, KYSE790 and Eca109 cells were treated with TCP, the expression of LSD1 was down-regulated while H3K4me2 was up-regulated, and those of Notch signaling pathway-related proteins were decreased(P<0.05). Similarly, LSD1 siRNA also down-regulated the expressions of LSD1 and Notch signaling pathway-related proteins(P<0.05).ConclusionLSD1 could regulate the Notch signaling pathway in ESCC by binding with the Hes1 promoter of Notch target gene.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.003

鄭州大學藥學院 鄭州 450001

#通信作者，男，1966 年11月生，博士，副教授，研究方向：腫瘤細胞分子生物學，E-mail:lzm310@zzu.edu.cn

R735.1

*國家自然科學基金資助重點項目 81430085；河南省基礎與前沿技術研究計劃項目 162300410122