M2型巨噬細胞對食管癌移植瘤脈管生成的影響*

蘭 青，賀璐璐，韋 娜，孫淼淼，陳金艷，楊建萍，王正洋，鄭湘予，陳奎生

M2型巨噬細胞對食管癌移植瘤脈管生成的影響*

蘭 青1,2)，賀璐璐1,2)，韋 娜1,2)，孫淼淼2，3)，陳金艷1,2)，楊建萍1,2)，王正洋1,2)，鄭湘予1,2)，陳奎生1，2)#

腫瘤相關巨噬細胞；食管癌；移植瘤；VEGF；VEGF-C

目的：探討M2型巨噬細胞對食管癌移植瘤脈管生成的影響及其可能機制。方法應用PMA及IL-4將人淋巴瘤U937單核細胞誘導為M2型巨噬細胞。16只裸鼠分為2組，每組8只，注射與M2型巨噬細胞共培養的EC9706細胞或單獨注射EC9706細胞；觀察2組荷瘤裸鼠成瘤情況，采用原位雜交法檢測移植瘤中VEGF和 VEGF-C mRNA的表達，采用免疫組化方法檢測2組移植瘤中VEGF和VEGF-C蛋白的表達，分別用CD31、D2-40標記2組移植瘤中血管和淋巴管，計算MVD與LMVD值。結果M2型巨噬細胞與EC9706細胞共培養組裸鼠移植瘤中VEGF、VEGF-C mRNA及蛋白表達水平高于單獨注射EC9706細胞的對照組(P<0.05)， MVD及LMVD值亦高于對照組(P<0.05)。結論M2型巨噬細胞可通過分泌VEGF、VEGF-C促進裸鼠食管癌移植瘤中血管、淋巴管的生成。

食管癌是我國常見的腫瘤之一，具有預后差，復發率和死亡率高等特點，嚴重威脅人類健康[1]。研究[2-5]表明腫瘤相關巨噬細胞(tumor associated macrophage，TAM)會活化成為兩種不同的類型：經典活化的巨噬細胞(M1型TAM)與替代性活化的巨噬細胞(M2型TAM)，其中M2型TAM常見的標志物有CD206、CD163等，且M2型TAM與腫瘤發展以及腫瘤脈管生成有關[6]。作者探討M2型TAM對食管癌移植瘤脈管生成的影響及其可能機制，為尋找抑制食管癌脈管轉移的新靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料人淋巴瘤U937單核細胞購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；人食管鱗癌EC9706細胞由中國醫學科學院腫瘤研究所分子腫瘤學國家重點實驗室饋贈。SPF級BALB/c裸鼠均來源于上海斯萊克實驗動物有限公司，均為雌性，體重18～22 g，動物質量合格證：SXCK滬2014-0006。兔抗人CD206、CD163多克隆抗體(美國Abcam公司)，鼠抗人CD31、D2-40單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)，佛波酯(PMA，美國Sigma公司)，重組人IL-4(美國Peprotech公司)，原位雜交試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2M2型巨噬細胞的誘導及鑒定將PMA加入含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培養基，調終質量濃度為200 μg/L。使用該濃度培養基重懸U937單核細胞，調整細胞密度為106mL-1，接種至6孔板并誘導18 h，加入20 μg/L的IL-4，顯微鏡下見U937細胞增殖速度減慢，貼壁生長，即為M2型巨噬細胞。鑒定：采用細胞免疫化學SP法染色。取細胞懸液滴至載玻片上制作成細胞涂片，40 g/L多聚甲醛溶液固定，室溫20 min；山羊血清工作液封閉；滴加PBS稀釋的CD206或CD163，4 ℃冰箱內孵育14～16 h；次日，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。0.01 mol/L PBS溶液代替一抗作陰性對照。

1.3細胞共培養將EC9706細胞制成密度為2×105mL-1細胞懸液，與6×105mL-1的M2型巨噬細胞的細胞懸液按11的體積比混合，接種于6孔板中，置于37 ℃、體積分數5% CO2細胞培養箱進行共培養，24 h后換液。取對數生長期的細胞進行實驗。

1.4動物分組16只裸鼠按隨機數字表分為2組，每組8只，分別注射共培養細胞(共培養組)和EC9706細胞(對照組)。裸鼠體內腫瘤最大徑≥2 mm時，視為移植瘤模型建立成功。每隔3 d用游標卡尺測量并記錄瘤體的縱、橫徑。4周時，麻醉下脫頸椎處死全部裸鼠，解剖后剝除腫瘤，測量并計算腫瘤體積。

1.5免疫組化方法檢測2組移植瘤中VEGF、VEGF-C蛋白及CD31和D2-40的表達移植瘤組織經石蠟包埋、4 μm切片，常規脫蠟至水。免疫組化用SP法染色：按試劑盒步驟操作，一抗工作濃度130。最終DAB顯色，蘇木精復染，脫水透明封片后，置于顯微鏡下觀察結果。以VEGF、VEGF-C、CD31和D2-40蛋白陽性表達的食管癌組織作陽性對照；以PBS代替一抗作陰性對照。挑選6個400倍視野進行觀察并計數。陽性細胞百分比<10%計0分，10%～計1分，49%～75%計2分，>75%計3分；按染色深淺評分：細胞無染色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深棕色為3分。染色強度與陽性細胞百分比所得評分相乘。

1.6原位雜交檢測2組移植瘤中VEGF、VEGF-CmRNA的表達移植瘤組織經石蠟包埋、切片，附著在APES處理過的載玻片上。經預雜交及雜交后，42 ℃SSC洗滌切片；滴加10 g/L乙酰化BSA孵育10 min，滴加鏈霉親和素堿性磷酸酶，經顯色，核固紅復染，脫水，透明，封片，觀察。以VEGF、VEGF-C mRNA陽性表達的食管癌組織作陽性對照；以不含探針的雜交液進行雜交作陰性對照。參照相關文獻[7]，在顯微鏡下選擇5個高倍視野進行觀察，陽性細胞百分比≤5%計0分， 5%～計1分， 25%～計2分，50%～計3分，≥76%計4分；胞質不著色計0分，淺藍色計1分，藍紫色計2分，深紫藍色計3分。染色強度與陽性細胞百分比所得評分相乘。

1.7血管、淋巴管密度值的測定根據Weidner計數法，在40倍光鏡視野下確定血管的高密度區域，然后在5個200倍視野下對CD31標記的血管內皮細胞以及D2-40標記的淋巴管內皮細胞進行觀察。CD31將血管內皮細胞染成棕黃色，單獨或多個成簇狀排列。D2-40一般只針對淋巴管內皮染色，細胞胞漿為棕黃色。只要與周圍腫瘤細胞或間質細胞分界清楚，即可計為1個微血管或微淋巴管，計算微血管密度(MVD)、微淋巴管密度(LMVD)。采用雙盲法進行計數。

1.8統計學處理應用SPSS 17.0處理數據，采用兩獨立樣本t檢驗比較2組裸鼠移植瘤中VEGF、VEGF-C蛋白和mRNA的表達以及MVD、LMVD，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1M2型巨噬細胞的鑒定人淋巴瘤U937單核巨噬細胞經PMA誘導成為巨噬細胞，再經IL-4誘導分化成M2型TAM，細胞體由圓形逐漸變為多邊形，生長方式由懸浮生長漸變為貼壁生長。 細胞免疫化學染色結果顯示誘導所得細胞中CD206和CD163的陽性率均達到100%，證實誘導所得細胞為M2型巨噬細胞(圖1)。

圖1 人淋巴瘤U937單核細胞中CD206(A)、CD163(B)的表達(SP,×400)

2.2食管癌移植瘤模型的建立2組裸鼠分組注射細胞后，經過7 d成瘤潛伏期后，肉眼可見裸鼠胸段有腫物形成。接種4周后2組裸鼠皮下均形成腫瘤，成瘤率100%，裸鼠無一死亡，成活率100%。此時處死裸鼠，分離腫瘤，測得共培養組腫瘤體積為(1 855.33±101.99) mm3，大于對照組[(1 011.98±111.10) mm3](t=5.283,P=0.036)。

2.3 2組裸鼠移植瘤組織中VEGF、VEGF-C蛋白及mRNA的表達共培養組裸鼠移植瘤組織中VEGF、VEGF-C蛋白及mRNA的表達均高于對照組。結果見圖2、表1。

A：共培養組；B：對照組；1：VEGF蛋白；2：VEGF-C蛋白；3：VEGF mRNA；4：VEGF-C mRNA。圖2 2組裸鼠移植瘤中VEGF、VEGF-C蛋白及mRNA的表達

組別nVEGF蛋白VEGF?C蛋白VEGFmRNAVEGF?CmRNA對照組845．19±18．6340．69±12．7826．37±11．9731．27±3．12共培養組852．41±15．2648．23±15．3236．63±13．2137．51±3．59t5．3506．1286．3305．380P0．0240．0310．0270．036

2.4 2組裸鼠移植瘤中MVD和LMVD比較

共培養組裸鼠移植瘤中CD31標記的MVD和D2-40標記的LMVD高于對照組，見圖3、表2。

A:共培養組；B:對照組;1：MVD(CD31染色，×200);2：LMVD(D2-40染色，×200)。圖3 2組裸鼠移植瘤中MVD和LMVD比較

組別nCD31標記MVDD2?40標記LMVD對照組826．58±6．5310．09±1．21共培養組829．21±5．7812．13±1．37t6．5727．491P0．0310．027

3 討論

腫瘤脈管新生是一個眾多因素參與的極其復雜的過程，其中腫瘤細胞產生的VEGF是最為重要的促進脈管生成的細胞因子, 通過下調或沉默腫瘤細胞中VEGF的表達，進而減少腫瘤脈管生成的研究報道有很多，但抑制腫瘤脈管生成的效應并不理想[8]。

近年來研究[9]發現腫瘤微環境中TAM的浸潤不但與腫瘤侵襲轉移和耐藥有關，而且也參與了腫瘤的脈管生成。TAM主要分兩類，即經典活化的M1型TAM和替代性活化的M2型TAM。M1型TAM標志物主要有CD16、CD32等，M2型TAM標志物主要有CD163、CD206等。該研究表明人淋巴瘤U937單核細胞經PMA誘導成為巨噬細胞，再經IL-4誘導分化成M2型巨噬細胞。

Berggreen等[10]建立了小鼠牙周炎模型，并證實了炎癥環境下巨噬細胞聚集與生成淋巴管有緊密聯系：經VEGFR-3受體信號的刺激，VEGF-C/D分泌，進而促進小鼠牙周微淋巴管的生長。Hagemann等[11]研究發現卵巢癌細胞與單核細胞共培養后，能夠高表達M2巨噬細胞特性的CD163和CD206；卵巢癌組織中MVD與TAM分布呈正相關，提示TAM在卵巢癌血管形成中起著重要作用。

該研究結果顯示，M2型TAM與EC9706細胞共培養組移植瘤中VEGF、VEGF-C蛋白及mRNA表達量高于對照組，且MVD及LMVD值亦高于對照組，提示M2型TAM可能通過分泌VEGF、VEGF-C促進裸鼠食管癌移植瘤中血管、淋巴管的生成。該研究結果為尋找抑制食管癌脈管轉移的新靶點提供了理論依據。

[1] 王立東,宋昕.環境和遺傳因素交互作用對食管癌發生的影響[J].鄭州大學學報(醫學版)，2011,46(1):46

[2] FANTIN A, VIEIRA JM, GESTRI G,et al.Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction[J]. Blood,2010,116(5):829

[3] RAUH MJ,HO V,PEREIRA C,et al.SHIP represses the generation of alternatively activated macrophages[J].Immunity,2005,23(4):361

[4] LEWIS CE,POLLARD JW.Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments[J].Cancer Res,2006,66(2):605

[5] JI RC.Macrophages are important mediators of either tumor- or inflammation-induced lymphangiogenesis[J].Cell Mol Life Sci,2012,69(6):897

[6] BERSANI G,MARCONI D,LIMPIDO L,et al.Pilot study of light therapy and neurocognitive performance of attention and memory in healthy subjects[J].Psychol Rep,2008,102(1): 299

[7] AHLéN J,ENBERG U,LARSSON C,et al.Malignant fibrous histiocytoma, aggressive fibromatosis and benign fibrous tumors express mRNA for the metalloproteinase inducer EMMPRIN and the metalloproteinases MMP-2 and MT1-MMP[J].Sarcoma,2001,5(3):143

[8] GAO P,ZHOU GY,ZHANG QH,et al.Lymphangiogenesis in gastric carcinoma correlates with prognosis[J].J Pathol,2009,218(2):192

[9] CHEN SJ,ZHANG QB,ZENG LJ,et al.Distribution and clinical significance of tumour-associated macrophages in pancreatic ductal adenocarcinoma: a retrospective analysis in China[J].Curr Oncol,2015,22(1):e11

[10]BERGGREEN E,WIIG H. Lymphangiogenesis and lymphatic function in periodontal disease[J].J Dent Res,2013,92(12):1074

[11]HAGEMANN T,WILSON J,BURKE F,et al.Ovarian cancer cells polarize macrophages toward a tumor-associated phenotype[J].J Immunol,2006,176(8):5023

(2017-01-09收稿 責任編輯徐春燕)

Effect of M2 type macrophage on angiogenesis and lymphangiogenesis of human esophageal cancer xenograft

LANQing1,2)，HELulu1,2)，WEINa1,2)，SUNMiaomiao2，3)，CHENJinyan1,2)，YANGJianping1,2)，WANGZhengyang1,2)，ZHENGXiangyu1,2)，CHENKuisheng1,2)

1)DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)HenanKeyLaboratoryforTumorPathology,Zhengzhou450052 3)DepartmentofPathology，theAffiliatedCancerHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

tumor associated macrophage;esophageal carcinoma;xenograft;VEGF;VEGF-C

Aim: To investigate the effect of M2 type macrophage on angiogenesis and lymphangiogenesis of human esophageal cancer xenograft.MethodsHuman lymphoma U937 monocytes were induced into M2 type macrophage by PMA and IL-4. The M2 type macrophage was co-cultured with esophageal cancer EC9706 cells. Sixteen nude mice were allocated into two groups and were injected with co-culture M2 type macrophage with EC9706 cells(co-culture group) or single-culture EC9706 cells(control group). The formation of tumor in the 2 groups was observed. The mRNA expression levels of VEGF and VEGF-C in xenograft of the 2 groups were determined byin-situhybridization method. The levels of VEGF and VEGF-C proteins in xenograft of the 2 groups were detected by immunohistochemical technique. The expression levels of CD31 and D2-40 separately to mark the blood vessel and the lymphatic vessel were detected by immunohistochemistry, and the value of MVD and LMVD was calculated.ResultsThe protein and mRNA expression levels of VEGF and VEGF-C in co-culture group were significantly higher than those in control group(P<0.05). Both the value of MVD and that of LMVD in co-culture group were also higher than those in control group(P<0.05).ConclusionM2 type macrophage may promote angiogenesis and lymphatic vessel generation of esophageal cancer xenograft in nude mice by secreting VEGF and VEGF-C.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.004

*國家自然科學基金資助項目 81272370；河南省基礎與前沿技術研究計劃項目 152300410026,122300413204

1)鄭州大學第一附屬醫院病理科 鄭州 450052 2)河南省腫瘤病理重點實驗室 鄭州 450052 3)鄭州大學附屬腫瘤醫院病理科 鄭州 450052

#通信作者，男，1964年8月生，博士，教授，研究方向：腫瘤病理，E-mail：chenksh2002@163.com

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