長期乙醇暴露對大鼠肺組織中TREM-1/2通路表達的影響*

張偉宏,徐高磊，易詩琪，張譯錚，沈建明，楊靜塵，楊東斌

長期乙醇暴露對大鼠肺組織中TREM-1/2通路表達的影響*

張偉宏1,2),徐高磊3)，易詩琪4)，張譯錚4)，沈建明4)，楊靜塵4)，楊東斌2)#

肺；乙醇；TREM-1；TREM-2

目的：探討長期乙醇暴露對大鼠肺組織中TREM-1/2通路表達的影響。方法將40只SD大鼠隨機分為2組。乙醇組按2.5 mL/(kg·d)的劑量灌胃體積分數20%的乙醇；對照組灌胃等量清水。4周后，運用免疫組化染色及Western blot技術檢測大鼠肺組織中TREM-1、TREM-2及信號銜接蛋白DAP-12的表達。結果4周后，對照組大行動敏捷，食欲良好，無腹瀉，體重增加明顯；與對照組比較，乙醇組大鼠體重無明顯增加，出現腹瀉癥狀，大鼠肺組織中TREM-1表達下調，TREM-2和DAP-12表達上調(P<0.05)。結論長期乙醇暴露可能破壞大鼠肺巨噬細胞TREM-1/2通路的平衡，導致大鼠免疫力低下。

目前我國飲酒人數超過2億。酗酒是一個嚴重的全球問題，每年酗酒致死的人數占全球死亡人數的3.8%[1]。單核巨噬細胞作為肺部抵御外界入侵的防線，在特異性和非特異性免疫中均起著重要作用。機體攝入的乙醇在代謝過程中會造成氧化負荷加重[2]、肺巨噬細胞內鋅離子濃度減少[3]等現象，并通過一系列分子機制導致肺免疫功能受損。髓系細胞觸發受體 (triggering receptor expressed on myeloid cells，TREM)是于2000年被發現的一個免疫球蛋白超家族受體，目前已證實有TREM-1、TREM-2和TREM-3[4]。TREM-1是IgG超家族的細胞膜受體，在肺組織里主要選擇性表達于肺泡巨噬細胞表面。TREM-1活化可促使TNF-α、IL-1β等炎癥因子釋放[5]，促進并擴大炎癥反應[6]。TREM-2與TREM-1作用相反[7-9]。適配器DNAX激活蛋白12(DNAX-activation protein 12，DAP-12)是一種信號銜接蛋白，存在于巨噬細胞表面，通過與TREM-1及TREM-2結合，影響巨噬細胞的功能[10]。該實驗擬采用長期乙醇暴露下的SD大鼠模型，研究乙醇暴露對肺巨噬細胞TREM-1/DAP-12、TREM-2/DAP-12信號通路的影響，從信號傳導途徑揭示乙醇誘導的肺免疫功能改變的分子機制，為進一步研究相關疾病的治療提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1動物模型的建立和實驗分組將健康成年SD大鼠(鄭州大學實驗動物中心)分區分籠飼養。所有動物均排除肺部和全身疾病，實驗過程中維持標準化環境條件，動物飼以標準化顆粒飼料(鄭州大學實驗動物中心)，可以自由進食、飲水，自然晝夜節律。選取成年大鼠40只，隨機分為兩組，每組20只。乙醇組以2.5 mL/(kg·d)的劑量灌胃體積分數20%的乙醇，持續4周；對照組給予清水。

1.2肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12蛋白的Westernblot法檢測山羊抗鼠TREM-1多克隆抗體(E-19)、山羊抗鼠TREM-2多克隆抗體(G-16)和山羊抗鼠DAP-12多克隆抗體(A-20)購自美國Santa Cruz公司。Western blot具體步驟：大鼠頸椎脫臼處死，迅速剝離肺組織，用勻漿器碾碎部分(n=12)組織，提取蛋白并測定蛋白濃度，然后進行電泳、轉膜，封閉2 h后加入E-19(稀釋度1500)、G-16(稀釋度11 000)、A-20(稀釋度1500)4 ℃孵育過夜，TBST振蕩洗滌3×10 min，加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG二抗(稀釋度11 000，碧云天公司)室溫搖床孵育2 h，TBST振蕩洗滌3×10 min，加入ECL試劑反應4 min，最后用X光膠片壓片，顯、定影后拍照并分析。以β-actin作為內參。以目的蛋白與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白的表達水平。

1.3肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12蛋白的免疫組化法檢測另取適量的肺組織(n=20)于多聚甲醛中固定，石蠟包埋后切片，切片厚度 5～8 μm。脫蠟后，0.1 mol/L PBS漂洗3×5 min，體積分數3%過氧化氫封閉內源性過氧化物酶，蒸餾水洗2次，加入10 mmol/L枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)以修復抗原，PBS清洗，血清封閉，滴加E-19(稀釋度1300)、G-16(稀釋度1500)、A-20(稀釋度1300)4 ℃過夜。PBS 沖洗，滴加生物素標記的二抗37 ℃孵育10～30 min，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素(PBS 稀釋)37 ℃孵育10～30 min， DAB顯色，自來水充分沖洗，復染，封片。用Image J軟件分析計算單位面積中的陽性細胞數。

1.4統計學處理采用SPSS 17.0進行數據處理，兩組大鼠肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12表達水平的比較采用兩獨立樣本t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1兩組大鼠行為及外觀的比較乙醇組大鼠體毛發黃、光澤不佳，動作遲緩，嗜睡，實驗期間體重無明顯增加，食量較小，出現腹瀉癥狀。上述表現隨實驗時間越長而更為顯著。對照組大鼠體毛光澤自然，行動敏捷，食欲良好，無腹瀉，體重增加明顯。

2.2兩組大鼠肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12蛋白的Westernblot法檢測結果見圖1、表1。Western blot結果顯示，與對照組比較，乙醇組大鼠肺組織中TREM-1蛋白表達水平降低，TREM-2和DAP-12蛋白表達水平升高。

1：對照組；2：乙醇組。圖1 兩組大鼠肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12蛋白的Western blot法檢測

組別nTREM?1TREM?2DAP?12對照組120．59±0．060．50±0．100．71±0．06乙醇組120．28±0．070．97±0．071．07±0．11t8．0606．4504．590P<0．001<0．001<0．001

2.3兩組大鼠肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12蛋白的免疫組化檢測結果免疫組化結果顯示，TREM-1陽性細胞主要分布于肺泡壁間隙，肺泡腔內也可見少量陽性細胞；TREM-2陽性細胞主要分布于肺間質內；DAP-12蛋白表達呈陽性(圖2)。與對照組比較，乙醇組TREM-1蛋白表達水平降低，TREM-2、DAP-12蛋白表達水平升高(表2)。

1：對照組;2：乙醇組；A:TREM-1；B：TREM-2；C：DAP-12。圖2 兩組大鼠肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12蛋白的免疫組化法檢測

表2 兩組大鼠肺組織中TREM-1、TREM-2和DAP-12蛋白的免疫組化檢測結果的比較個/mm2

3 討論

TREM-1多在單核巨噬細胞表達，雖然其天然配體至今未知，但TREM-1激動性抗體誘導受體交聯后，受體與DAP-12結合，可導致下游信號傳導事件，包括磷脂酶、細胞外信號相關激酶(ERK)1/2磷酸化，以及細胞內鈣離子濃度和促炎癥細胞因子的分泌[11]，放大炎癥反應。與TREM-1相反，TREM-2通過TREM-2/DAP-12介導的信號傳導通路，可活化免疫受體的酪氨酸殘基，傳遞激活信號，從而激活一系列的細胞內酪氨酸蛋白磷酸化以及相關的酶促反應，影響巨噬細胞的活動，抑制TREM-1對炎癥反應的促進作用。兩者之間隨著外界環境的變化，維持著一定的動態平衡，對機體的炎癥反應及免疫能力起著重要的調節作用。

該研究結果顯示，與對照組大鼠比較，乙醇組大鼠肺組織中TREM-1表達水平降低，而TREM-2和DAP-12表達水平顯著升高，提示TREM-1與TREM-2之間的平衡被破壞，而這種失衡可能是大鼠免疫能力下降的關鍵因素。長期乙醇暴露條件下，大鼠肺組織中TREM-2與DAP-12水平升高，高水平的TREM-2通過與TREM-1競爭DAP-12，從而抑制細胞炎癥因子的產生，減少肺部巨噬細胞的募集，致使肺部免疫力下降，一旦病原體等外來入侵物增加，機體就不能通過炎癥反應來抵御外部入侵，導致肺部感染的發生[12]。

綜上所述，長期乙醇暴露可使大鼠肺組織中TREM-1和TREM-2的表達失衡，從而導致大鼠的免疫調節網絡產生缺陷，進而造成免疫功能下降，其具體機制值得進一步研究。

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(2017-03-22收稿 責任編輯王 曼)

Effect of long-term alcohol exposure on TREM-1/2 pathway expression in rat lung tissue

ZHANGWeihong1,2),XUGaolei3),YIShiqi4),ZHANGYizheng4)，SHENJianming4)，YANGJingchen4)，YANGDongbin2)

1)SchoolofNursing,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)ThePeople'sHospitalofHebiCity,Hebi，Henan458030 3)DepartmentofHumanAnatomy,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 4)ClinicalMedicineCollege,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

lung；alcohol；TREM-1；TREM-2

Aim: To investigate the effect of long-term alcohol exposure on the expressions of TREM-1,TREM-2 and DAP-12 in rat lung tissue.MethodsForty SD rats were allocated into 2 groups randomly. The rats in alcohol group were lavagely given alcohol(volume fraction of 20%) at dose of 2.5 mL/(kg·d), and those in control group were given water. After four weeks, immunohistochemical staining and Western blot technique were used to detect the expressions of TREM-1,TREM-2 and DAP-12 in lung tissue.ResultsAfter 4 weeks, the control rats had agile action, good appetite, no diarrhea, and gained weight obviously. Compared with control group, the rats in alcohol group had no significant weight gain, and showed diarrhea symptoms, TREM-1 expression in rat lung tissue decreased, and TREM-2 and DAP-12 expressions increased(P<0.05).ConclusionLong-term alcohol exposure may destroy the balance of TREM-1/2 pathway, thereby cause low immunity.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.008

*國家自然科學基金資助項目 U1404814；河南省高校科技創新人才支持計劃 17HASTIT048

1)鄭州大學護理學院 鄭州 450001 2)鶴壁市人民醫院 河南鶴壁 458030 3)鄭州大學基礎醫學院人體解剖學教研室 鄭州 450001 4)鄭州大學臨床醫學院 鄭州 450052

#通信作者，男，1974年2月生，博士，在站博士后，研究方向：慢性病的基礎與臨床，E-mail：dongbinyang@126.com

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