HDAC1基因沉默的hUC-MSCs移植對創(chuàng)傷性腦損傷小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用*

許 玲，邢 衢，馬珊珊#，程 田，楊 璐，黃團(tuán)結(jié)，程 康，劉雯雯，劉艷霞，李 鵬，關(guān)方霞

HDAC1基因沉默的hUC-MSCs移植對創(chuàng)傷性腦損傷小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用*

許 玲1)，邢 衢1)，馬珊珊1)#，程 田1)，楊 璐1)，黃團(tuán)結(jié)1)，程 康1)，劉雯雯1)，劉艷霞1)，李 鵬1)，關(guān)方霞1,2)#

HDAC1；基因沉默；hUC-MSC；創(chuàng)傷性腦損傷；小鼠；神經(jīng)保護(hù)

目的：觀察組蛋白去乙?；?(HDAC1)基因沉默的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)靜脈移植對創(chuàng)傷性腦損傷小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。方法80只健康成年C57BL/6小鼠，利用立體定位儀和顱腦打擊器制作中度腦損傷模型，分為Sham組、Vehicle組、hUC-MSCs移植組和聯(lián)合組(n=20)。移植后第1、3、7、14、21和28天，采用改良神經(jīng)功能損傷評分系統(tǒng)評價(jià)小鼠神經(jīng)功能恢復(fù)情況；通過Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、掛線實(shí)驗(yàn)、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)評價(jià)小鼠長期運(yùn)動(dòng)及認(rèn)知功能。結(jié)晶紫染色評估小鼠的腦損傷體積和觀察海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變；濕重法檢測腦含水量；伊文斯藍(lán)染色檢測血腦屏障的開放程度。結(jié)果與Vehicle組相比，hUC-MSCs移植組和聯(lián)合組小鼠神經(jīng)功能損傷評分降低，水迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期增加、穿越平臺(tái)次數(shù)及在平臺(tái)象限停留時(shí)間增加，掛線時(shí)間和辨別指數(shù)增加，其中聯(lián)合組各指標(biāo)均有明顯改善(P<0.05)。與hUC-MSCs移植組相比，聯(lián)合組小鼠腦損傷體積減少、腦含水量降低、血腦屏障開放程度減輕(P<0.05)，且海馬CA3區(qū)神經(jīng)元丟失減少。結(jié)論HDAC1基因沉默的hU-MSCs移植對創(chuàng)傷性腦損傷小鼠有較好的神經(jīng)保護(hù)作用。

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是導(dǎo)致死亡和長期殘疾的主要原因[1]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)在體內(nèi)外環(huán)境誘導(dǎo)下，可向神經(jīng)細(xì)胞分化，并已廣泛應(yīng)用于腦損傷、脊髓損傷等中樞神經(jīng)疾病，但是損傷部位的微環(huán)境導(dǎo)致移植后干細(xì)胞的存活率低，成神經(jīng)分化效果不理想[2-3]。表觀遺傳機(jī)制在疾病狀態(tài)中的重要作用日益明顯，在少突膠質(zhì)細(xì)胞的早期分化階段，組蛋白去乙?；?(histone deacetylase 1，HDAC1)表達(dá)增加。另一方面，成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞中HDAC1表達(dá)下降，這提示HDAC1在神經(jīng)分化過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。因此，該實(shí)驗(yàn)通過慢病毒介導(dǎo)的shRNA靶向干擾hUC-MSCs中的HDAC1基因沉默[6]，觀察HDAC1沉默的hUC-MSCs靜脈移植TBI小鼠后能否發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料hUC-MSCs由關(guān)方霞教授課題組前期凍存，DMEM/F12培養(yǎng)基購自寶信生物科技有限公司，胎牛血清購自美國Gemini公司，結(jié)晶紫、伊文斯藍(lán)(EB)購自美國Sigma公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2動(dòng)物模型的建立及分組80只健康成年C57BL/6小鼠，體重20～25 g，雌雄各半，購自北京維通利華實(shí)業(yè)有限公司[許可證號：SYXK(京)2006-0024]。使用100 g/L水合氯醛按5 mL/kg劑量進(jìn)行腹腔注射，小鼠麻醉后利用立體定位儀和顱腦打擊器制作中度腦損傷模型。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為Sham組、Vehicle組、hUC-MSCs移植組和聯(lián)合組(即HDAC1基因沉默的hUC-MSCs移植組)(n=20，每組3只備用)。造模后6 h，hUC-MSCs移植組由尾靜脈移植hUC-MSCs(1×106細(xì)胞/只)；聯(lián)合組由尾靜脈移植HDAC1基因沉默的hUC-MSCs(1×106細(xì)胞/只)。

1.3神經(jīng)功能評分腦損傷后第1、3、7、14、21和28天，每組10只小鼠，采用改良神經(jīng)功能損傷評分(modified neurologic severity score，mNSS)系統(tǒng)進(jìn)行評分并記錄分值[7]。mNSS結(jié)果為0(正常)～18(最嚴(yán)重)分。

1.4Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)?zāi)X損傷后第24天，每組8只小鼠，利用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測小鼠空間學(xué)習(xí)與記憶能力。水迷宮裝置放在一個(gè)相對密閉、光照恒定的房間，由一臺(tái)軌跡跟蹤攝像機(jī)、攝像機(jī)相連的計(jì)算機(jī)和一個(gè)圓形水池(直徑120 cm，深度60 cm，水深50 cm，水溫22 ℃±2 ℃)組成。將圓形水池平均分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限，選取一個(gè)象限的中心，水下1 cm處放置直徑15 cm圓臺(tái)，首先讓小鼠熟悉水迷宮環(huán)境，將小鼠背向平臺(tái)、面向池壁分別從4個(gè)不同象限中間的入水點(diǎn)放入水池中，讓其自由游泳，觀察其90 s內(nèi)能否達(dá)到平臺(tái)，如果不能，則幫助其找到平臺(tái)，讓動(dòng)物熟悉、記憶平臺(tái)位置。然后記錄小鼠從4個(gè)入水點(diǎn)到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)和其在正確平臺(tái)象限停留的時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.5掛線實(shí)驗(yàn)?zāi)X損傷后第27天，每組8只小鼠，具體操作方法如下：將1根金屬線(直徑1 mm，長55 cm)懸空固定于高于桌面50 cm處，將小鼠后肢用膠帶固定(防止小鼠攀爬)，前肢放置于金屬線上，下面放置海綿墊子，防止小鼠摔傷，記錄小鼠掛線時(shí)間。

1.6新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)?zāi)X損傷后第27天，每組8只小鼠，具體操作方法如下：將小鼠放置在一個(gè)50 cm×50 cm×25 cm不透明箱子中，進(jìn)行環(huán)境適應(yīng)10 min。24 h后，將2個(gè)相同體積、相同顏色的物體(4 cm×4 cm×4 cm紅色立方體)放入箱子中，讓小鼠探索10 min后放入原來的籠子。1 h后，將其中1個(gè)紅色立方體用綠色的球形物體(直徑4 cm)代替，再次將小鼠放置到此箱子中，讓其探索5 min，期間應(yīng)用錄像機(jī)記錄小鼠探索情況。此時(shí)紅色立方體為舊物體，而綠色球形物體為新物體，在電腦上分析小鼠探索新舊物體所用時(shí)間，計(jì)算小鼠的辨別指數(shù)：辨別指數(shù)=探索新物體所用時(shí)間/(探索新物體所用時(shí)間+探索舊物體所用時(shí)間)×100%。

1.7腦含水量測定腦損傷后第3天，每組3只小鼠，采用干濕重法測定腦含水量。小鼠麻醉后，斷頭取損傷側(cè)腦組織，快速稱量，得到濕重。將腦組織放入100 ℃烤箱中，48 h后稱量，得到干重。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.8腦損傷體積測定腦損傷后第28天，每組3只小鼠，40 g/L多聚甲醛灌注后取腦組織并切片，厚度30 μm，進(jìn)行結(jié)晶紫染色。使用Image J軟件計(jì)算大腦損傷體積。

1.9損傷側(cè)腦組織EB含量測定腦損傷后3天，每組3只小鼠，于尾靜脈注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% EB 0.1 mL，循環(huán)1 h后麻醉小鼠，灌注并斷頭取腦。取損傷側(cè)腦組織加入1 mL甲酰胺，組織勻漿后60 ℃水浴孵育48 h，再將水浴后的上述溶液以1 000 r/min離心10 min后取上清液。用酶標(biāo)儀在620 nm處檢測其吸光度，計(jì)算小鼠腦組織EB含量，結(jié)果以每g腦組織中EB含量表示。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0進(jìn)行分析。不同組間Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、懸掛實(shí)驗(yàn)、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果及腦損傷體積、腦含水量、EB含量的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；不同組間mNSS的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠神經(jīng)功能評分的比較Sham組小鼠mNSS均為0分，其他各組小鼠均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損，見表1。

表1 各組小鼠mNSS比較

F組間=2 705.490，F(xiàn)時(shí)間=94.570，F(xiàn)交互=18.170，P均<0.05；#：與Vehicle組相比，P<0.05；*：與hUC-MSCs移植組相比，P<0.05。

2.2各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的比較結(jié)果見表2。

2.3各組小鼠掛線時(shí)間和辨別指數(shù)的比較結(jié)果見表3。

2.4各組小鼠腦含水量、損傷體積和EB含量的比較結(jié)果見圖1、表4。Vehicle組海馬CA3區(qū)海馬錐體細(xì)胞稀疏，層次不清晰，神經(jīng)元密度明顯降低；聯(lián)合組的神經(jīng)元密度較Vehicle組明顯增加。Sham組腦損傷體積為0，與hUC-MSCs移植組和Vehicle組相比，TBI后聯(lián)合組小鼠的腦含水量、損傷體積、EB含量減少。

表2 各組小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較

*：與Sham組相比，P<0.05；#：與Vehicle組相比，P<0.05；△：與hUC-MSCs移植組相比，P<0.05。

表3 各組小鼠掛線時(shí)間和辨別指數(shù)的比較

*：與Sham組相比，P<0.05；#：與Vehicle組相比，P<0.05；△：與hUC-MSCs移植組相比，P<0.05。

A：Sham組；B：Vehicle組；C：hUC-MSCs移植組；D：聯(lián)合組。圖1 各組小鼠損傷側(cè)海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變(結(jié)晶紫，×200)

組別n腦含水量/%損傷體積/mm3EB含量/(μg·g-1)Sham組375．31±0．41?4．58±0．22Vehicle組381．72±1．71?15．09±0．988．02±0．17?hUC?MSCs移植組378．75±0．79?#12．46±0．64#6．97±0．36?#聯(lián)合組377．43±0．68?#△10．65±0．59#△6．14±0．39?#△F20．63068．36068．676P<0．001<0．001<0．001

*：與Sham組相比，P<0.05；#：與Vehicle組相比，P<0.05；△：與hUC-MSCs移植組相比，P<0.05。

3 討論

組蛋白乙?；揎椩谏窠?jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，多種疾病的發(fā)生伴隨乙?；降母淖僛8-9]。采用多種組蛋白去乙?；敢种苿┛梢悦黠@改善疾病癥狀，發(fā)揮神經(jīng)修復(fù)作用[10-11]。Tubastatin A通過上調(diào)α-微管蛋白乙?；胶虵GF-21的表達(dá)，減輕腦梗死，減少大鼠神經(jīng)細(xì)胞死亡[10]。VPA可改善大鼠運(yùn)動(dòng)功能，減輕炎癥，減少細(xì)胞凋亡[11]。但是目前國內(nèi)外的組蛋白去乙?；敢种苿┒酁閺V譜性、非特異性制劑，對不同HDAC亞型、不同的疾病作用靶點(diǎn)的認(rèn)識(shí)仍不十分明確[12]。因此，靶向沉默HDAC1，不僅能促進(jìn)干細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中發(fā)揮作用，也可為設(shè)計(jì)特異性組蛋白去乙?；敢种苿┎?yīng)用于TBI治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

腦損傷是一種嚴(yán)重的神經(jīng)損傷疾病，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能減退、運(yùn)動(dòng)功能受損等。因此，損傷后的神經(jīng)功能評價(jià)是神經(jīng)修復(fù)的關(guān)鍵指標(biāo)之一。該實(shí)驗(yàn)采用多種方法觀察腦損傷小鼠的行為學(xué)變化。mNSS評價(jià)動(dòng)物神經(jīng)功能恢復(fù)情況，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、掛線實(shí)驗(yàn)和新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)測試動(dòng)物空間探索能力、運(yùn)動(dòng)及學(xué)習(xí)記憶能力。作者發(fā)現(xiàn)HDAC1基因沉默的hUC-MSCs移植腦損傷小鼠可以顯著提高小鼠的運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)、記憶能力及改善情緒，說明HDAC1基因沉默的hUC-MSCs可以明顯改善腦損傷小鼠的神經(jīng)功能。

血腦屏障由許多細(xì)胞組成，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元代謝中共同發(fā)揮作用[13]。神經(jīng)元、相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血腦屏障中的細(xì)胞共同構(gòu)成“神經(jīng)血管單元”[14]。TBI可能不僅僅損害神經(jīng)元，而且可能損害星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，甚至整個(gè)“神經(jīng)血管單元”[15]。TBI后會(huì)引起原發(fā)性損傷或繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷過程伴隨著腦細(xì)胞代謝障礙、局部腦血流下降、腦水腫、顱內(nèi)壓增高、免疫系統(tǒng)激活和血腦屏障通透性增加等[16]。海馬CA3區(qū)主要參與長期記憶的維持，TBI后CA1、CA3和齒狀回等部位神經(jīng)細(xì)胞丟失，突觸傳遞功能障礙，造成認(rèn)知和記憶功能障礙[17]。與行為學(xué)結(jié)果一致，組織學(xué)觀察顯示聯(lián)合組在修復(fù)損傷、減少海馬CA3區(qū)神經(jīng)元丟失和限制血腦屏障開放程度方面都要優(yōu)于hUC-MSCs移植組。

綜上所述，HDAC1基因沉默的hUC-MSCs對損傷后的行為和認(rèn)知功能具有多方面的改善作用，如改變血腦屏障通透性、減少海馬CA3區(qū)神經(jīng)元丟失，保護(hù)了大腦的完整性和神經(jīng)功能，這可能是其發(fā)揮TBI保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī)制。

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(2017-03-31收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Neural protective effect of transplantation of hUC-MSCs with silenced HDAC1 in traumatic brain injury mice

XULing1),XINGQu1),MAShanshan1),CHENGTian1),YANGLu1),HUANGTuanjie1),CHENGKang1),LIUWenwen1),LIUYanxia1),LIPeng1),GUANFangxia1,2)

1)CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

HDAC1;gene silencing;hUC-MSC;traumatic brain injury;mouse;neuroprotection

Aim: To evaluate whether transplantation of hUC-MSCs with silenced HDAC1 could facilitate recovery of nerve function in the mice model of traumatic brain injury.MethodsModerate traumatic brain injury mice models were made by the stereotaxic apparatus and modified weight-drop model. Eighty C57BL/6 mice were randomly allocated into four groups: Sham group, Vehicle group, hUC-MSCs group and Combination group(n=20). After brain injury, mice neurological function was evaluated by the modified neurological severity score on the 1st, 3rd, 7th, 14th, 21st and 28th day. The indexes of motor function and cognitive function were evaluatedviathe Morris water maze test, the tail suspension test and the novel object recognition, respectively. The size of cortical lesion and the morphological changes of neurons in hippocampal CA3 area were detected by crystal violet staining. Brain water content was measured with wet-dry weight formula. Blood brain barrier permeability was measured by Evans blue staining.ResultsCompared with Vehicle group, the modified neurological severity scores significantly decreased in hUC-MSCs group and Combination group, the escape latency distinctly reduced accompanied with a sharp increase in both the times of crossing the plat and the time in target quadrant, time of wire hanging and discrimination index were increased, especially in Combination group(P<0.05). The evaluating indexes in Combination group such as brain damage volume, brain water content，localized opening blood brain barrier and the loss of neurons in the hippocampal CA3 area were appreciably reduced(P<0.05).ConclusionTransplantation of hUC-MSCs with HDAC1 deficiency could provide a better neuroprotection in traumatic brain injury mice.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.009

*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 U1404313，81471306，81601078；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目 15IRTSTHN022；河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃基金資助項(xiàng)目 154200510008；河南省國際人才合作項(xiàng)目 2016GH03，2016GH15；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目 17A310012

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450052

#通信作者：關(guān)方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)，E-mail：guanfangxia@126.com；馬珊珊，女，1984年5月生，博士，副教授，研究方向：干細(xì)胞與神經(jīng)功能修復(fù)，E-mail：mashanshan84@163.com

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