糞菌移植對(duì)阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響*

楊 璐，李慶華#，許 玲，劉雯雯，劉艷霞，黃團(tuán)結(jié)，邢 衢，李 鵬，張 樂(lè)，關(guān)方霞

糞菌移植對(duì)阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響*

楊 璐1)，李慶華1)#，許 玲1)，劉雯雯1)，劉艷霞1)，黃團(tuán)結(jié)1)，邢 衢1)，李 鵬1)，張 樂(lè)1)，關(guān)方霞1,2)#

小鼠；阿爾茨海默病；糞菌移植；腸道菌群；β淀粉樣蛋白

目的：觀察糞菌移植(FMT)對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠(APP+轉(zhuǎn)基因小鼠)學(xué)習(xí)記憶能力及腦內(nèi)β淀粉樣蛋白(Aβ)沉積的影響。方法將15只小鼠分為APP-組、APP+組、FMT組，每組5只。對(duì)FMT組APP+小鼠進(jìn)行FMT，每天1次，連續(xù)4周，APP+組及APP-組用生理鹽水灌腸處理。4周后，通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察各組小鼠認(rèn)知能力和學(xué)習(xí)記憶能力；采用Western blot法檢測(cè)小鼠腦組織中衰老相關(guān)蛋白(P21、P53、Sirt1、Sirt2、PCNA)的表達(dá)情況；采用剛果紅染色法觀察小鼠腦內(nèi)Aβ沉積的變化情況。結(jié)果與APP-組相比,APP+組小鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，目標(biāo)象限停留時(shí)間減少(P<0.05)。經(jīng)FMT處理后，F(xiàn)MT組小鼠與APP+組小鼠相比，逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增多，目標(biāo)象限停留時(shí)間延長(zhǎng)，Aβ沉積減少，腦組織中衰老相關(guān)蛋白P21、P53表達(dá)減少，而Sirt1、Sirt2、PCNA表達(dá)增多(P<0.05)。結(jié)論FMT 可以改善阿爾茨海默病小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減緩衰老，減少腦組織Aβ沉積。

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的特征表現(xiàn)為神經(jīng)衰退，患病者多為老年人[1]。腦組織內(nèi)的β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)聚集以及神經(jīng)原纖維的纏繞這兩個(gè)特征是AD在病理學(xué)上的主要表現(xiàn)[2]。據(jù)報(bào)道[3]全球有3 500萬(wàn)老年人遭受AD的困擾，預(yù)計(jì)在未來(lái)的40 a里，將會(huì)有1億的人口患AD。腸道菌群和宿主是共同進(jìn)化的，腸道菌群和宿主之間會(huì)建立重要的共生關(guān)系。腸道菌群是和機(jī)體協(xié)同進(jìn)化的微生物，它的改變會(huì)影響宿主健康，宿主菌群與宿主是互利共生的關(guān)系，被稱為“超級(jí)有機(jī)體”[4]。腸道菌群的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)被打亂時(shí)，就可能導(dǎo)致機(jī)體患各種疾病，如急慢性胃腸道疾病等[4]。相關(guān)研究[5]發(fā)現(xiàn)，腸道菌群失調(diào)很可能是導(dǎo)致精神分裂、抑郁癥、AD和帕金森癥等的重要原因，表明腸道菌群在宿主腸道與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的互相應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮作用，據(jù)此提出腦-腸軸理論，即大腦可以調(diào)節(jié)腸道蠕動(dòng)、消化分泌和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和分布，從而使腸道菌群平衡，腸道菌群反過(guò)來(lái)可以影響神經(jīng)信號(hào)的傳遞，從而影響人的情緒和行為。與此同時(shí)相關(guān)研究[5]還發(fā)現(xiàn)，由于無(wú)菌小鼠體內(nèi)缺少腸道菌群，其神經(jīng)系統(tǒng)功能會(huì)有障礙以至于其難以發(fā)育成熟。最近幾年，對(duì)糞菌移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)的研究[6]越來(lái)越多。隨著FMT技術(shù)的出現(xiàn)以及越來(lái)越多的應(yīng)用，可以看出其能用來(lái)調(diào)整腸道微生物的多樣性及組分，調(diào)制腸道微生物，或許可以作為一種用于調(diào)節(jié)大腦和機(jī)體行為的手段[7]。因此該研究以APP+轉(zhuǎn)基因小鼠(一種AD小鼠)為模型，利用FMT對(duì)AD小鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察FMT對(duì)APP+小鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1材料瓊脂糖凝膠粉(美國(guó)Sigma公司)、100 bp DNA Marker(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)、剛果紅染料和蘇木精(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、PCR擴(kuò)增儀和臺(tái)式4 ℃離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)、冰凍切片機(jī)和熒光顯微鏡(德國(guó)Leica公司)、多功能分子成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Azuar Biosystems公司)、Morris水迷宮系統(tǒng)(西班牙 Panlab公司)，APP基因上下游引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，DNA 提取試劑盒(康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司)，P21、P53、Sirt1、Sirt2、PCNA兔源單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，清潔級(jí)APP695V717I轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究所。

1.2APP+轉(zhuǎn)基因模型小鼠的鑒定取0.3 cm長(zhǎng)小鼠尾巴，用試劑盒提取全DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為284 bp的APP基因。引物序列:上游5’-CCCT GAACCTGAAACATAAAAT-3’，下游5’-GCTACGAA AATCCAACCTACAA-3’。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 50 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。PCR結(jié)束后10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，電壓90 V，時(shí)間50 min。經(jīng)PCR擴(kuò)增，鑒定出10只APP+小鼠以及5只APP-小鼠。

1.3新鮮糞菌液的制備在灌腸當(dāng)天收集APP-組小鼠的新鮮糞便，并用電子天平稱重，將其置于密封的小燒杯中，加入生理鹽水，在磁力攪拌器上攪拌，用折疊3層的紗布過(guò)濾，用離心管收集濾液，標(biāo)記濾液的體積，1 200 r/min離心5 min，倒掉上清，再加入生理鹽水至原體積，混勻，重復(fù)此步驟3次，下層沉淀物再用蒸餾水溶解，渦旋混合均勻即為灌腸液體，用于FMT。

1.4小鼠分組及干預(yù)處理把鑒定的10只APP+小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為APP+組和FMT組，每組各5只，另外5只APP-小鼠為APP-組。根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道，采用灌腸法進(jìn)行FMT，APP-組及APP+組行生理鹽水灌腸，F(xiàn)MT組行糞便濾液灌腸(每日劑量為15.197 g/kg)。第1次灌腸前禁食不禁水24 h，腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，先在直徑為2 mm導(dǎo)管表面涂抹甘油，使其潤(rùn)滑，再?gòu)母亻T(mén)緩緩插進(jìn)結(jié)腸，長(zhǎng)度約4 cm，倒立慢慢注入200 μL糞菌液，輕輕拔出軟導(dǎo)管，用醫(yī)用紗布?jí)焊亻T(mén)幾秒，捏住小鼠尾巴，使小鼠倒立，1 min后再放回籠中。每天灌腸1次，持續(xù)4周，給予正常飲食。

1.5Morris水迷宮檢測(cè)各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力

FMT 4周后，各組小鼠開(kāi)始水迷宮的訓(xùn)練，Morris水迷宮是一個(gè)半徑為60 cm的水池，水迷宮有4個(gè)象限，平臺(tái)的半徑是4.5 cm，把平臺(tái)放在第一象限，水池內(nèi)的水溶解奶粉使其為乳白色，不透明，池子里的水溫為19～20 ℃，水平面沒(méi)過(guò)平臺(tái)約1 cm。每只小鼠游泳訓(xùn)練時(shí)間是1 min，待其訓(xùn)練完后，放在平臺(tái)上，記憶觀察10 s，讓其記憶水迷宮的空間位置，擦干后放回籠。定位航行實(shí)驗(yàn)：在FMT 結(jié)束后，開(kāi)始每日上、下午對(duì)小鼠進(jìn)行訓(xùn)練，每只訓(xùn)練4次，訓(xùn)練結(jié)束后第1～5天進(jìn)行測(cè)試，分別從4個(gè)象限依次放入，儀器自動(dòng)計(jì)算1 min內(nèi)到達(dá)平臺(tái)的耗時(shí)，也就是逃避潛伏期。假如60 s時(shí)未到達(dá)平臺(tái)，把它引導(dǎo)到平臺(tái)上，并強(qiáng)制讓其停滯10 s。空間探索實(shí)驗(yàn)：訓(xùn)練第6天，拿走平臺(tái)，從任意一個(gè)象限放入水中，儀器自動(dòng)計(jì)算在1 min內(nèi)小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)以及目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比。

1.6海馬組織Aβ沉積的檢測(cè)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠麻醉，稱重，心臟取血，用生理鹽水灌注，取腦，固定24 h后，浸泡在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的蔗糖溶液中24 h后，切片，片厚8 μm，進(jìn)行剛果紅染色。具體步驟：質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%剛果紅溶液浸染20 min(37 ℃孵育)；蒸餾水沖洗 5～10 s，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%氫氧化鉀溶液分化2 s；蘇木精復(fù)染2 min；用體積分?jǐn)?shù)為100%乙醇脫水，浸入二甲苯中10 s，指甲油封片。400倍鏡下取5個(gè)視野拍照采集圖片并計(jì)數(shù)陽(yáng)性斑塊(橘紅色)的數(shù)目。

1.7小鼠腦組織中衰老相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)在Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取出小鼠腦組織用RIPA裂解液提取全蛋白，用微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度，加2×SDS-PAGE Loading Buffer，調(diào)整蛋白濃度為2.5×104mg/L，煮沸后-80 ℃保存。每組取100 μg總蛋白點(diǎn)樣，SDS-PAGE跑膠2 h,并轉(zhuǎn)膜2 h，封閉2 h，加一抗(Sirt1、Sirt2、PCNA、P21和P53均按11 000稀釋)，置4 ℃冰箱過(guò)夜，洗膜4次，加二抗，孵育2 h，洗膜4次，每次10 min，曝光，采集圖片，用Image J對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。3組小鼠干預(yù)前后體重變化、水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果、腦組織Aβ沉積斑塊數(shù)、衰老相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)或重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1APP+轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。

M：100 bp Marker;1～6：APP+轉(zhuǎn)基因小鼠。圖1 APP+轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定結(jié)果

2.2各組小鼠干預(yù)前后體重的變化結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠干預(yù)前后體重變化情況 g

F=107.158,P<0.001;*：兩兩比較，P均<0.05。

2.3各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的比較結(jié)果見(jiàn)表2。APP+組與APP-組比較，逃避潛伏期延長(zhǎng)；FMT組與APP+組比較，逃避潛伏期縮短。

表2 各組小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期的比較 s

F組間=33.141，F(xiàn)時(shí)間=665.054，F(xiàn)交互=6.437，P均<0.001；*：與APP-組相比，P<0.05；#：與APP+組相比，P<0.05。

2.4各組小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比的比較結(jié)果見(jiàn)圖2、表3。可知，與APP-組相比，APP+組小鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間減少，穿越平臺(tái)次數(shù)減少；與APP+組相比，F(xiàn)MT組小鼠目標(biāo)象限停留時(shí)間更長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)增加。

A～C：分別為APP-組、APP+組和FMT組。圖2 空間探索實(shí)驗(yàn)各組小鼠活動(dòng)軌跡圖

組別n目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比/%穿越平臺(tái)次數(shù)APP-組568．90±1．448．30±1．30APP+組548．66±1．95?3．30±0．70?FMT組561．69±2．66#6．30±1．30#F72．63411．400P<0．001<0．001

*：與APP-組相比，P<0.05；#：與APP+組相比,P<0.05。

2.5各組小鼠腦組織中衰老相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)

結(jié)果見(jiàn)圖3、表4。可以看出，APP+組小鼠腦組織中衰老相關(guān)蛋白P21、P53的表達(dá)量高于APP-組，Sirt1、Sirt2、PCNA的表達(dá)量低于APP-組；與APP+組比較，F(xiàn)MT組小鼠腦組織中P21、P53的表達(dá)量下降，Sirt1、Sirt2、PCNA的表達(dá)量升高。

1～3：分別為APP-組、APP+組和FMT組。圖3 各組小鼠腦組織中衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)

組別nP21P53Sirt1Sirt2PCNAAPP-組51．19±0．060．71±0．021．46±0．111．14±0．111．90±0．48APP+組51．41±0．87?1．40±0．05?0．74±0．13?0．57±0．74?0．93±0．13?FMT組50．72±0．03#0．46±0．15#1．30±0．92#0．92±0．15#1．12±1．07#F110．63676．12644．09541．154161．011P<0．001<0．001<0．001<0．001<0．001

*：與APP-組相比，P<0.05；#：與APP+組相比，P<0.05。

2.6各組小鼠腦組織Aβ沉積的變化結(jié)果見(jiàn)圖4、表5。各組小鼠腦組織中出現(xiàn)大小不一、染色不均的橘紅色斑塊，多為圓形或不規(guī)則形。FMT組斑塊較APP+組變小，染色變淺；APP-組此斑塊較少。

A～C：分別為APP-組、APP+組、FMT組；箭頭所指為Aβ陽(yáng)性斑塊。圖4 各組小鼠腦組織中Aβ剛果紅染色結(jié)果(×400)

組別n陽(yáng)性斑塊數(shù)APP-組57．67±2．08APP+組5109．00±15．72?FMT組576．33±9．61#

F=70.056,P<0.001;*：與APP-組相比，P<0.05；#：與APP+組相比，P<0.05。

3 討論

AD是一種衰老相關(guān)的疾病，衰老的機(jī)體多伴有嚴(yán)重的退行性變,如肌肉萎縮、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性變等,這些年齡相關(guān)疾病在使老年人失去生活質(zhì)量的同時(shí)也給家庭和社會(huì)帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)。目前臨床上主要利用膽堿酶抑制劑類(lèi)藥物來(lái)改善輕度癡呆，但尚無(wú)有效治療AD的方法，所以急需尋找有效的治療方法[9]。FMT是在受體的消化道內(nèi)移植健康狀況良好的供體的腸道內(nèi)功能菌群，從而改變受體腸道菌群進(jìn)而治療疾病[10]。腸道菌群參與AD的機(jī)制已被初步闡述：腸道菌群紊亂導(dǎo)致肥胖和代謝綜合征，血液和腦組織較高的胰島素水平可產(chǎn)生淀粉樣蛋白并形成破壞性的沉積斑，進(jìn)而導(dǎo)致AD[11]。Aβ是老年斑的主要成分，可以被剛果紅染色，Aβ沉積最終可導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和認(rèn)知功能障礙[12]。很多神經(jīng)系統(tǒng)疾病和精神疾病患者的腸道微生物都存在組群的動(dòng)蕩，從這些現(xiàn)象可以看出，對(duì)神經(jīng)退行性疾病進(jìn)行的治療也許可以從改變腸道微生物組成入手[13]。因此，該研究對(duì)APP+小鼠進(jìn)行正常腸道菌群的移植，希望可以通過(guò)這種方法改變APP+小鼠的腸道菌群組成，進(jìn)而通過(guò)腸道微生物的改變影響APP+小鼠認(rèn)知功能。通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠的認(rèn)知功能，發(fā)現(xiàn)FMT組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有所提高；通過(guò)剛果紅染色發(fā)現(xiàn)APP+組小鼠腦組織Aβ的沉積明顯多于APP-組小鼠，而FMT組小鼠Aβ的沉積較APP+組明顯減少；以上結(jié)果說(shuō)明FMT在一定程度上減緩了AD小鼠的衰老。

綜上所述，對(duì)APP+小鼠進(jìn)行正常菌群的移植能改善其學(xué)習(xí)記憶功能，減少腦組織Aβ沉積，緩解衰老進(jìn)程。

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(2017-03-30收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Effects of fecal microbiota transplantation on learning and memory ability of Alzheimer′s disease mice

YANGLu1),LIQinghua1),XULing1),LIUWenwen1),LIUYanxia1),HUANGTuanjie1),XINGQu1),LIPeng1),ZHANGLe1),GUANFangxia1,2)

1)CollegeofLifeSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)StemCellLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

mouse;Alzheimer′s disease;fecal microbiota transplantation;gut microbiota;amyloid β-protein

Aim: To study the effects of fecal microbiota transplantation(FMT) on learning and memory ability and amyloid β-protein(Aβ) deposition in Alzheimer′s disease mice.MethodsA total of 15 mice were randomly allocated into APP-group, APP+group, and FMT group(n=5). The APP+mice in FMT group were treated with FMT for 4 weeks, while the mice in APP+group and APP-group were enemaed with normal saline. The learning and memory ability of mice was tested by Morris water maze.And then Western blot was employed to detect the expression of senescence related proteins(P21, P53, Sirt1, Sirt2, PCNA) in mice brain tissue, and the change of Aβ deposition in the brain was observed by Congo red staining.ResultsCompared with the APP-group, the escaping latency of the APP+group was longer, while the times of crossing the platform quadrant was less and the time of spending in the target quadrant was shorter(P<0.05). After FMT, the escaping latency of the mice was decreased, the times of crossing the platform quadrant and the time of spending in the target quadrant were increased(P<0.05). And the deposition of Aβ in brain tissue of FMT group was reduced compared with the APP+group(P<0.05). Additionally, the expressions of P21 and P53 in brain tissue of FMT group reduced, and the expressions of Sirt1, Sirt2 and PCNA increased significantly(P<0.05).ConclusionFMT could improve the learning and memory ability of Alzheimer′s disease mice by slowing down its aging and reducing the formation of Aβ deposition in brain.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.010

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 81471306;河南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目 15IRTSTHN022；河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃基金資助項(xiàng)目154200510008

1)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞研究室 鄭州 450052

#通信作者：關(guān)方霞，女，1969年2月生，博士，教授，研究方向：干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)，E-mail：guanfangxia@126.com；李慶華，女，1983年6月生，博士，講師，研究方向：微生物學(xué)，E-mail:guozilqh@126.com

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