RUNX2在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及其siRNA對Hela229細(xì)胞RUNX2表達(dá)及細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

張 威，郭文濤，曾憲旭，班振英#

RUNX2在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)及其siRNA對Hela229細(xì)胞RUNX2表達(dá)及細(xì)胞增殖與凋亡的影響*

張 威1)，郭文濤2)，曾憲旭1)，班振英1)#

宮頸癌；Hela 229細(xì)胞；RUNX2；RNA干擾；增殖；凋亡

目的：探討RUNX2蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)情況及RUNX2 siRNA對宮頸鱗癌Hela229細(xì)胞RUNX2基因表達(dá)、細(xì)胞增殖及凋亡的影響。方法應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測50例宮頸鱗癌、30例宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變( HSIL)及30例正常宮頸黏膜組織中RUNX2蛋白的表達(dá)情況，并分析宮頸鱗癌組織中RUNX2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。設(shè)計合成RUNX2 siRNA，通過脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染至Hela229細(xì)胞，同時設(shè)立空白對照(不轉(zhuǎn)染)和陰性對照(轉(zhuǎn)染非特異性siRNA)細(xì)胞組。轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，采用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖，計算增殖抑制率；轉(zhuǎn)染72 h后，采用RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測細(xì)胞中RUNX2 mRNA及蛋白的表達(dá)，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果宮頸鱗癌組織中RUNX2陽性表達(dá)率高于HSIL及正常宮頸組織(P<0.001)；宮頸鱗癌組織中RUNX2蛋白的表達(dá)與腫瘤的臨床分期有關(guān)(P=0.004)。與空白對照組和陰性對照組比較，RUNX2 siRNA組Hela 229細(xì)胞增殖抑制率、RUNX2 mRNA及蛋白的表達(dá)均降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)。結(jié)論RUNX2基因的高表達(dá)與宮頸鱗癌細(xì)胞的增殖關(guān)系密切。

RUNX2又稱核心結(jié)合因子(core banding factor 1，Cbaf1)，是runt結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，定位于人染色體6p12.3-p21.1，其在成骨細(xì)胞的形成和分化、軟骨細(xì)胞的分化和成熟等骨組織形成和重建過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。最近研究[4-7]發(fā)現(xiàn)RUNX2在黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌等組織中異常表達(dá)，且和腫瘤細(xì)胞的增殖關(guān)系密切。作者應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測了RUNX2蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)情況，并觀察了應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默RUNX2基因?qū)θ藢m頸鱗癌細(xì)胞Hela229增殖及凋亡的影響，從而為尋求分子靶向治療宮頸鱗癌的新方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1宮頸鱗癌組織及細(xì)胞來源①收集宮頸鱗癌組織50例，宮頸高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion，HSIL)組織30例及正常宮頸黏膜組織30例，均為鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科2011年1月至2016年11月手術(shù)切除的標(biāo)本。宮頸鱗癌患者年齡32～71歲，術(shù)前均未接受放化療，其中<45歲23例；腫瘤直徑2.5～12.0 cm,其中<4 cm 18例，≥4 cm 32例；臨床Ⅰ～Ⅱ期36例，Ⅲ～Ⅳ期14例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，無轉(zhuǎn)移29例；19例腫瘤浸潤深度≥宮頸全層1/2。②宮頸鱗癌Hela229細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下，用含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化液消化后對細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每隔3～5 d細(xì)胞傳代一次。

1.2宮頸鱗癌組織中RUNX2表達(dá)的檢測標(biāo)本石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片，厚度4 μm，按照常規(guī)方法對切片進(jìn)行脫蠟和水化。按SP免疫組化試劑盒(美國Zymed公司)說明書進(jìn)行染色。兔抗人RUNX2單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司。由兩位病理科醫(yī)生采用雙盲法對染色結(jié)果進(jìn)行判定。RUNX2陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核棕黃色著色。在高倍鏡下選取5個視野，每個視野觀察不少于200個細(xì)胞，按照陽性細(xì)胞百分率計分：<5%為0分，5%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記為4分；依據(jù)細(xì)胞染色程度評分：無染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩項(xiàng)評分的乘積為總分，總分>3分判定為陽性表達(dá)。

1.3Hela229細(xì)胞分組Hela299細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞鋪滿大部分培養(yǎng)瓶底時(約80%～90%)分3組培養(yǎng)。①空白對照組：將細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱中培養(yǎng)，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。②RUNX2 siRNA組：根據(jù)GenBank中RUNX2 cDNA序列，遵循siRNA 設(shè)計原則，參考文獻(xiàn)[8]設(shè)計合成RUNX2 siRNA。反義序列：5’-AATGGCAGCACGC TATTAAATCCTGTCTC-3’；正義序列：5’-AAATTTA ATAGCGTGCTGCCACCTGTCTC-3 ’。RUNX2 siRNA由上海生工生物工程有限公司合成。取對數(shù)生長期的Hela229細(xì)胞，消化后接種于6孔板中，參考轉(zhuǎn)染試劑盒LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)說明書將RUNX2 siRNA(80 nmol/L)轉(zhuǎn)染到Hela229細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，更換含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。③陰性對照組：細(xì)胞按RUNX2 siRNA組處理，但不轉(zhuǎn)染RUNX2 siRNA，而轉(zhuǎn)染非特異性的siRNA。

1.4MTT法檢測Hela299細(xì)胞增殖抑制率收集對數(shù)生長期的Hela229細(xì)胞，消化后制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)細(xì)胞計數(shù)后按5 000個/孔接種在96孔板上，按1.3分組處理，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加20 μL的MTT(5 g/L，美國Sigma公司)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，加入200 μL DMSO，搖床上低速振蕩10 min顯色。用酶標(biāo)儀檢測各孔492 nm處的光密度(OD)值，每組設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對照孔OD值)×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測Hela299細(xì)胞凋亡細(xì)胞分組培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。取1×106個細(xì)胞，離心棄上清，重懸細(xì)胞后按照Annexin V-FITC和PI雙染試劑盒說明書操作檢測細(xì)胞凋亡，以PI、Annexin V-FITC單染細(xì)胞作為基準(zhǔn)參照。用CellQuest軟件進(jìn)行結(jié)果分析，計算細(xì)胞凋亡率。

1.6RT-PCR法檢測Hela299細(xì)胞中RUNX2mRNA的表達(dá)細(xì)胞分組培養(yǎng)72 h后，用Trizol試劑(MRC公司)提取細(xì)胞總RNA，用 M-MLV酶行逆轉(zhuǎn)錄后，進(jìn)行PCR。RUNX2引物序列為5’-GCAGT TCCCAAGCATTTCAT-3’和5’-GAAGGGTCCACTCT GGCTTT-3’，產(chǎn)物長度190 bp。內(nèi)參GAPDH引物序列為5’-CACCATGGAGAAGGCCGGGG-3’和5’-GACG GACACATTGGGGGTAG-3’，產(chǎn)物長度419 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成，RT-PCR試劑盒購于大連寶生物公司。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，用Gel-Doc2000 型凝膠成像分析系統(tǒng)檢測條帶灰度值，以目的條帶和內(nèi)參條帶灰度值的比值表示目的mRNA的相對表達(dá)量。

1.7Westernblot法檢測Hela299細(xì)胞中RUNX2蛋白的表達(dá)分組培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞，用含有PMSF的細(xì)胞裂解液將細(xì)胞裂解，收集蛋白，BAC法定量。用100 g/L分離膠、50 g/L濃縮膠進(jìn)行蛋白電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加一抗(稀釋度1500)4 ℃孵育過夜，加HRP標(biāo)記的二抗室溫雜交1 h，洗轉(zhuǎn)印膜3次后，采用ECL AdvanceTM試劑盒(美國通用公司)顯色，然后顯影、定影、照相，采用Quantity One軟件分析各蛋白條帶灰度值，表示蛋白表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，不同宮頸組織中、不同臨床病理特征宮頸鱗癌組織中RUNX2蛋白陽性表達(dá)率的比較采用χ2檢驗(yàn)或精確概率法，3組細(xì)胞各指標(biāo)的比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1宮頸組織中RUNX2蛋白的表達(dá)見圖1。正常宮頸、HSIL和宮頸鱗癌組織中RUNX2陽性表達(dá)率分別為14%、44%和72%；3組RUNX2陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=34.262，P<0.001)，宮頸鱗癌組織中RUNX2陽性表達(dá)率明顯高于正常宮頸和HSIL組織(P<0.016)。

A：正常宮頸組織；B：HSIL組織；C：宮頸鱗癌組織。圖1 各種宮頸組織中RUNX2蛋白的表達(dá)(SP，×200)

2.2不同臨床病理特征宮頸鱗癌組織中RUNX2表達(dá)的比較見表1。

表1 不同臨床病理特征宮頸鱗癌組織中RUNX2表達(dá)比較

2.3RUNX2siRNA對Hela229細(xì)胞增殖的影響

見表2。RUNX2 siRNA組48、72 h細(xì)胞增殖抑制率均低于空白對照組及陰性對照組(P<0.001)，且細(xì)胞增殖抑制率隨著培養(yǎng)時間的延長而增加。

表2 3組細(xì)胞增殖抑制率的比較(n=3) %

*：與其他兩組比較，P<0.05。

2.4RUNX2siRNA對Hela229細(xì)胞凋亡的影響

RUNX2 siRNA組細(xì)胞凋亡率為(15.96±0.73)%，與空白對照組(6.75±0.70)%和陰性對照組(6.46±0.65)%相比，顯著升高(F=181.770，P<0.001)。

2.5RUNX2siRNA對Hela229細(xì)胞RUNX2mRNA及蛋白表達(dá)的影響見圖2、圖3及表3。RUNX2 siRNA組RUNX2 mRNA相對表達(dá)量和RUNX2蛋白表達(dá)水平較空白對照組及陰性對照組明顯降低。

M:Marker；1：RUNX2 siRNA組；2：空白對照組；3：陰性對照組。圖2 RT-PCR法檢測RUNX2 mRNA的表達(dá)

1：空白對照組；2：陰性對照組；3：RUNX2 siRNA組。圖3 Western blot法檢測RNUX2蛋白的表達(dá)

組別nmRNA蛋白空白對照組30．497±0．0470．238±0．047陰性對照組30．526±0．0630．221±0．040RUNX2siRNA組30．227±0．059?0．125±0．031?F25．3357．004P<0．0010．027

*:與其他組比較，P<0.05。

3 討論

RUNXs家族成員包括RUNX1、RUNX2及RUNX3，研究[9-10]發(fā)現(xiàn)，RUNX1表達(dá)異常與白血病的發(fā)生相關(guān)，而RUNX3 卻具有抑制腫瘤生長的作用。所以，RUNX家族成員在不同組織器官中的功能可能不同。大量的研究證明RUNX2與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。Pratap等[11]研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)RUNX2的轉(zhuǎn)基因小鼠T細(xì)胞正常分化受阻，從而導(dǎo)致淋巴瘤的發(fā)生；Westendorf 等[12]的研究結(jié)果顯示RUNX2可通過抑制p21(CIP1/WAF1)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖，從而促進(jìn)血管的形成；Won等[6]發(fā)現(xiàn)抑制骨肉瘤細(xì)胞RUNX2的表達(dá)，G1/G0期細(xì)胞增加，細(xì)胞體外生存能力顯著降低。

目前，關(guān)于RUNX2與宮頸癌關(guān)系的研究鮮有報道。該研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測了RUNX2蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示RUNX2蛋白在宮頸鱗癌組織中的陽性表達(dá)率高于正常宮頸黏膜組織；且癌組織臨床分期越高，其陽性表達(dá)率越高。另外，RUNX2在宮頸HSIL組織中也高表達(dá)，但低于宮頸鱗癌組織。可見，RUNX2蛋白高表達(dá)與宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有可能成為宮頸鱗癌早期診斷的指標(biāo)。

RNAi技術(shù)是采用特定雙鏈RNA(dsRNA)引起序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，它可以高效、特異性的抑制目的基因的表達(dá)。作者設(shè)計合成了靶向RUNX2 的siRNA，并將其轉(zhuǎn)染宮頸鱗癌Hela229細(xì)胞，檢測細(xì)胞RUNX2表達(dá)、細(xì)胞增殖及凋亡情況，發(fā)現(xiàn)RUNX2 siRNA可抑制Hela229細(xì)胞RUNX2 mRNA 及蛋白的表達(dá)，而且轉(zhuǎn)染RUNX2 siRNA的Hela229細(xì)胞增殖受抑，細(xì)胞凋亡增加。這一結(jié)果進(jìn)一步證明RUNX2與宮頸鱗癌細(xì)胞的增殖關(guān)系密切。

綜上所述，RUNX2有望成為宮頸鱗癌治療的新靶點(diǎn)，而RUNX2 siRNA對于宮頸鱗癌的治療值得進(jìn)一步研究。

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(2017-01-19收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Expression of RUNX2 in human cervical squamous cell carcinoma tissue and effect of RUNX2 siRNA on expression of RUNX2, proliferation and apoptosis of Hela229 cells

ZHANGWei1),GUOWentao2),ZENGXianxu1),BANZhenying1)

1)DepartmentofPathology,theThirdAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)PathogenBiologyLaboratory,BasicMedicalCollege,GuangdongMedicalUniversity,Dongguan，Guangdong523808

cervical carcinoma；Hela229 cell;RUNX2；RNA interference;proliferation；apoptosis

Aim: To explore the expression of RUNX2 protein in cervical squamous cell carcinoma tissue and the effect of RUNX2 siRNA on the expression of RUNX2, cell proliferation and apoptosis in Hela229 cells.MethodsImmunohistochemical technique was used to measure the expression of RUNX2 protein in 50 cases of cervical squamous cell carcinoma, 30 cases of cervical high-grade squamous intraepithelial lesion(HSIL) and 30 normal cervical epitheliums(NCE) tissue, and the relationship between the RUNX2 protein expression and the clinical pathological parameters was analyzed. RUNX2 siRNA was synthesized, and transfected into Hela229 cells by liposome method. MTT method was used to detect the cell proliferation after 24,48 and 72 h culture; the mRNA and protein expressions of RUNX2 were measured respectively by RT-PCR and Western blot, and flow cytometry was used to detect cell apoptosis after 72 h culture.ResultsThe RUNX2 positive expression rate in the cervical squamous cell carcinoma tissue was higher than those in HSIL or NCE tissue(P<0.01), and RUNX2 protein positive expression rate was associated with the clinical stage of tumor (P=0.004). Compared with the two control groups, the proliferation inhibition rate of RUNX2 siRNA group, and the expressions of RUNX2 mRNA and protein at 72 h were lower(P<0.05), while the apoptosis index was higher(P<0.05).ConclusionThere is close correlation between high expression of RUNX2 gene and proliferation of cervical cancer cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.013

*河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研計劃項(xiàng)目 17A310027

1)鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科 鄭州 450052 2)廣東醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物實(shí)驗(yàn)室 廣東東莞 523808

#通信作者，女，1981年6月生，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤病理，E-mail:354085412@qq.com

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