蒲公英萜醇對乳腺癌細胞增殖及發生氧化應激反應的影響

朱 坤，丁米娜，李 月，陳麗艷

（延邊大學醫學院生物化學與分子生物學教研室，吉林 延吉 133000）

蒲公英萜醇對乳腺癌細胞增殖及發生氧化應激反應的影響

朱 坤，丁米娜，李 月，陳麗艷

（延邊大學醫學院生物化學與分子生物學教研室，吉林 延吉 133000）

目的：探究蒲公英萜醇（Taraxerol）對乳腺癌細胞（MCF-7細胞）增殖及發生氧化應激反應的影響。方法：將MCF-7 細胞接種于96孔板中，在其中4孔的MCF-7 細胞中分別加入12.5μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 和200 μmol/L的蒲公英萜醇，對其中一孔的MCF-7 細胞不進行添加蒲公英萜的處理。將未經處理的MCF-7細胞設為對照組(Control組)，將其他的MCF-7細胞設為用藥組。采用細胞計數試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)檢測加入不同濃度的蒲公英萜醇對各用藥組細胞增殖的影響，采用探針DCFH-DA檢測各組細胞中活性氧(ROS)的變化，采用分光光度法測定各組細胞中上清液乳酸脫氫酶(LDH)及細胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。結果：進行CCK-8 檢測的結果顯示，在各用藥組細胞中加入蒲公英萜醇后的第48 h和第72 h其增殖速度均明顯下降，與對照組細胞相比差異有統計學意義,P＜0.05。與對照組細胞相比，各用藥組細胞中ROS、LDH、MDA的水平均明顯上升（P＜0.05），其中SOD的水平均明顯下降（P＜0.05），且在各用藥組細胞中加入蒲公英萜醇的濃度越高，其ROS、LDH、MDA、SOD水平的變化幅度越大。結論：蒲公英萜醇可抑制乳腺癌細胞MCF-7細胞的增殖，其作用機制可能與其能夠誘導該細胞發生氧化應激性損傷有關。

乳腺癌；蒲公英萜醇；氧化應激

乳腺癌是導致女性死亡的主要癌癥之一。近年來，關于乳腺癌的臨床研究雖然取得較大的進展，但其發病率仍逐漸上升[1]。開發治療乳腺癌的新藥已經迫在眉睫。蒲公英萜醇是從中藥蒲公英中提取的五環三萜類化合物[2]。有研究表明，蒲公英萜醇可以抑制腫瘤細胞的增殖并促進腫瘤細胞的凋亡[3]，但其作用機制尚不明確。本研究以人乳腺癌 MCF-7 細胞作為研究對象，通過檢測不同濃度的蒲公英萜醇對 MCF-7 細胞增殖的影響和檢測相關的氧化應激指標來探討其藥理作用中可能的分子機制。

1 材料

1.1 材料與試劑

乳腺癌細胞系 MCF-7 為延邊大學腫瘤研究中心惠贈；蒲公英萜醇購自西安昊軒生物科技有限公司；DMEM 培養基和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自Hyclone公司；乳酸脫氫酶( lactatedehydrogenase，LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、 丙 二 醛 ( malondialdelyde，MDA) 試劑盒購自南京建成科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養

將MCF-7 細胞置于含10%胎牛血清的DMEM 培養液內，于37℃、5%CO2的恒溫培養箱中進行培養。在細胞貼壁生長至70%～80%融合時，以0.25%的胰蛋白酶對其進行消化及傳代處理。

2.2 CCK-8檢測

以每孔1×103個細胞的密度將MCF-7 細胞接種于96孔板中， 100 μL/孔。在將其培養過夜后分別在各孔中加入 12.5μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 和200 μmol/L的蒲公英萜醇，對其中一孔MCF-7 細胞不進行添加蒲公英萜醇的處理。將未經處理的MCF-7細胞設為對照組(Control組)，將其他的MCF-7細胞設為用藥組。經培養24 h、48 h和72 h后，將各組細胞改用終濃度為10% 的細胞計數試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)培養基進行溫育2 h，然后在酶標儀450 nm處讀取吸光度(D)值。

2.3 細胞中MDA、SOD的檢測

將各組細胞按上述方法處理后，用胰酶將其消化，對其進行收集和破碎處理，然后經離心操作取上清液，按試劑盒說明書的步驟測定細胞內 SOD、MDA的水平。

2.4 細胞外液中LDH的檢測

將各組細胞按上述的方法處理后，收集培養液的上清液，按試劑盒說明書的步驟測定細胞培養液中 LDH的活性。

2.5 細胞中活性氧（ROS）的檢測

用熒光探針DCFH-DA檢測各組細胞內ROS的水平。用無血清培養液稀釋DCFH-DA，制備終濃度為10μmol/L的DCFH-DA工作液。將處理后的各組細胞收集后使其懸浮于1 mL的DCFH-DA工作液中，在37℃的培養箱中避光孵育30 min，每隔3～5 min震蕩混勻1次。將各組細胞用PBS洗滌3次，用1 mL的PBS重懸細胞，然后在1h內使用流式細胞儀對其進行檢測。

2.6 統計學處理

采用SPSS 17.0 軟件對本次研究中的數據進行統計學分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 進行CCK-8檢測的結果

進行CCK-8 檢測的結果顯示，在各用藥組細胞中加入蒲公英萜醇后的第48 h和第72 h其增殖速度均明顯下降，與對照組細胞相比,P＜0.05。詳情見圖1。

圖1 蒲公英萜醇對MCF-7細胞增殖的影響

3.2 用蒲公英萜醇進行處理后各組細胞中ROS、SOD、MDA、LDH水平的變化

與對照組細胞相比，各用藥組細胞中ROS、LDH、MDA的水平均明顯上升（P＜0.05），其中SOD的水平均明顯下降（P＜0.05），且在各用藥組細胞中加入蒲公英萜醇的濃度越高，其ROS、LDH、MDA、SOD水平的變化幅度越大。詳情見表2。

表2 蒲公英萜醇對MCF-7細胞中ROS、MDA、SOD、LDH水平的影響（±s，n=6)

表2 蒲公英萜醇對MCF-7細胞中ROS、MDA、SOD、LDH水平的影響（±s，n=6)

注：*與對照組相比，P＜0.05。

0.53±0.04 458.4±15.3* 2.51±0.14* 214.5±7.6*0.65±0.05* 432.9±11.9* 2.75±0.12* 231.2±15.4*0.72±0.03* 372.1±10.2* 3.36±0.10* 259.2±11.7*0.83±0.06* 341.1±11.7* 3.97±0.13* 303.8±19.6*蒲公英萜醇(μmol/L) ROS水平 SOD(U/mg prot) MDA (nmol/mg prot) LDH對照組 0.51±0.01 492.1±21.2 2.03±0.25 186.3±10.2用藥組（25 μmol/L）用藥組（50 μmol/L用藥組（100 μmol/L）用藥組（200 μmol/L）

4 討論

進行中藥治療是我國傳統醫學中重要的治療手段之一。許多中藥成分均被證實具有抗腫瘤的作用。蒲公英萜醇屬于烏蘇烷型五環三萜類化合物，主要存在于蒲公英、杜香、檀香葉、紫菀等中藥中，其分子式是C30H50O[4]。有研究表明，蒲公英萜醇可抑制腫瘤細胞的增殖，并可通過線粒體途徑誘導腫瘤細胞的凋亡，進而可發揮抗腫瘤的作用。本實驗通過檢測氧化應激指標的方法，進一步研究了蒲公英萜醇抗腫瘤作用中的分子機制。

氧化應激反應是正常人體不可避免發生的一種反應。在遭受各種有害刺激時，人體內的活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）等高活性分子會大量生成，從而會介導細胞凋亡和組織損傷。細胞凋亡的3條途徑（線粒體通路、內質網通路和死亡受體通路）均與ROS的大量生成密切相關[5-6]。在本實驗中，蒲公英萜醇高劑量組細胞中的ROS呈高表達且氧化損傷嚴重。當細胞受到損傷后，其中會生成大量的活性自由基，脂質過氧化終產物 MDA也會增多。SOD是普遍存在于動植物體內重要的抗氧化酶，其主要功能是消除自由基[7]。本研究的結果顯示，用藥組細胞中SOD的表達量顯著減少，對細胞內ROS的清除率下降。當乳腺癌細胞受到氧化應激損傷時可釋放LDH，分析其釋放LDH的量可準確分析其受損的程度。

本次研究的結果證實，蒲公英萜醇可抑制乳腺癌細胞MCF-7細胞的增殖，其作用機制可能與其能夠誘導該細胞發生氧化應激性損傷有關。

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Studies on oxidative damage and cytotoxicity of Taraxerol to Human Breast Cancer Cells

Objective: To investigate effect of Taraxerol to proliferation and oxidative stress of MCF-7 cells．Methods: Inoculate MCF-7 cells into 96-well plates,respectively drop concentration of 25 umol/L,50 umol/L,100 umol/L,200 umol/L of Taraxerol for each 4 wells on the plate, but leave one well without Taraxerol. Set the well of MCF-7 cells without Taraxerol to control group, set the wells of MCF-7 cells with Taraxerol to experimental group. Apply cell counting kit-8（CCK-8）to test effect of Taraxerol in different concentration to proliferation of each group of the cells, apply probe DCFH-DA to test ROS variation of each group of the cells, apply spectrophotometry to test LDH, MDA and SOD content of each group of the cells .Results: The result of CCK-8 shows that in 48th hour and 72th hour proliferation speed of MCF-7 cells in experimental significantly slower than control group（P＜0.05）.Compare with control group, ROS,LDH and MDA level of experimental group are significantly increased（P＜0.05）but SOD level significantly decreased. The change range of ROS,LDH,MDA and SOD level of MCF-7 cells will become larger with concentration of Taraxerol increasing. Conclusion: Taraxerol have a inhibition effects of MCF-7 cells，the mode of action of Taraxerol may related with oxidative stress of MCF-7 cells.

breast cancer;Taraxerol;oxidative stress

R737.9

B

2095-7629-（2017）19-0010-03