NRG1轉染對骨髓基質干細胞表達VEGF的影響

王凱　閆磊　劉志新

[摘要]目的 探討神經調節因子1（neuregulin-1，NRG1）轉染是否可以促進骨髓基質干細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）表達血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）。方法 提取與培養3只SD大鼠的BMSCs，采用NRG1質粒轉染BMSCs并提取上清液，采用ELISA法測定轉染組上清液中VEGF的含量，將非轉染BMSCs的樣本作為對照組，采用免疫組化方法檢測細胞VEGF的表達。結果 BMSCs多數細胞處于伸展狀態，呈梭形；經ELISA方法檢測，轉染組上清液VEGF的含量隨時間增加呈增長趨勢，與對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）；經免疫組化檢測，轉染組細胞VEGF陽性率為91.07%，對照組細胞陽性率為70.82 %，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 NRG1轉染可以促進BMSCs表達VEGF。

[關鍵詞]骨髓基質干細胞；細胞培養；血管內皮生長因子；神經調節因子1

[中圖分類號] R329 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）11（b）-0004-04

[Abstract]Objective To explore whether bone marrow stromal stem cells （BMSCs） could been promoted by NRG1 transfection to VEGF expression.Methods The BMSCs of three SD rats were isolated and cultured，BMSCs were transfected with NRG1 plasmids，and the supernates were extracted.The contents of VEGF in the supernates were detected by the method of ELISA，and the samples of BMSCs were regarded as the control group.The expression of VEGF in BMSCs was detected by immunohistochemical method.Results Most of BMSCs were stretched and spindle-shaped.The levels of VEGF in the transfection group were increased with time by ELISA detection，compared with the control group，there was significant difference （P<0.05）.The VEGF positve cell rate of the transfection group was 91.07% by immunohistochemical detection，while the positive cell rate of the control group was 70.82%，there was significant difference compared with the control group （P<0.05）.Conclusion BMSCs can promoted by NRG1 transfection to express VEGF.

[Key words]Bone marrow stromal cells；Cell culture；Vascular endothelial growth factor；Neuregulin-1

骨髓基質干細胞（bone marrow stromal stem cells，BMSCs）因其低免疫源性、穩定的擴增能力和無倫理問題等優勢被應用于治療缺血性疾病的研究[1]，然而移植后BMSCs存活率過低的問題一直未被解決[2]。神經調節因子1可通過激活血管內皮ErbB2、ErbB3和ErbB4受體促進血管新生，從而改善細胞存活的微環境[3]。血管內皮生長因子是血管內皮細胞特異性的肝素結合生長因子，可促進內皮細胞生長及血管新生[4]。有報道顯示，NRG1與VEGF的表達相關聯。而NRG1對BMSCs表達VEGF的影響，未被查見相關報道[5]。本研究將NRG1基因轉染到BMSCs，檢測其VEGF的表達，旨在為提高移植后BMSCs存活率的相關研究奠定理論基礎，現報道如下。

1材料與方法

1.1材料

出生2 d的SD大鼠3只（哈爾濱醫科大學實驗動物中心），胎牛血清、DMEM培養基（Hyclone公司），胰蛋白酶、EDTA（Gibco公司），Lipo2000（INVITROGEN公司），VEGF的ELISA試劑盒（GIBCO公司），VEGF抗體（Sigma公司），培養皿（Costar公司）。

1.2方法

1.2.1 BMSCs的提取與培養 新生2 d的SD大鼠用乙醚麻醉后處死，置于75%乙醇中浸泡殺菌5 min；在超凈工作臺中取出股骨，剪掉兩端，暴露骨髓腔；PBS沖洗骨髓腔，800 r/min離心沖洗3 min后去上清；用含10%胎牛血清的DMEM培養液重懸細胞；將懸液吸至培養皿，于37℃恒溫、5%CO2培養箱中培養，每3天換液1次。當細胞鋪滿培養板底部80%以上時傳代。

1.2.2 NRG1質粒的轉染 取第3代融合至70%～80%細胞，向EP管內加入1 ml的DMEM培養液，再加入40 μl Lipo2000，混合液室溫下靜置5 min；向另一只EP管內加入1 ml的DMEM培養液，再加40 μl NRG1質粒，混合液室溫下靜置5 min；將兩個EP管中溶液混勻后室溫下靜置20 min，將細胞培養皿中的原培養液吸出，加入6 ml的DMEM培養液，再加入DMEM/Lipo 2000/NRG1質粒；繼續培養6 h后，吸出上清液，加常規培養液繼續培養3 d。endprint

1.2.3 ELISA法檢測VEGF表達 NRG1轉染的BMSCs培養3 d后，接種于6孔板，作為轉染組，每孔含培養液3 ml（每孔底部鋪有的蓋玻片用于免疫組化檢測）。分別從繼續培養2、3、4、5 d的培養板各孔中分別吸取1 ml培養液至各EP管中（各孔吸取1 ml后，補充新鮮培養液1 ml），1000 r/min離心15～20 min，取出上清裝入新EP管中，標記編號后將樣本放入-80℃超低溫冰箱保存備用；將未轉染NRG1的BMSCs的培養液作為空白對照組。按照ELISA試劑盒說明檢測每個標本中VEGF的含量。

1.2.4免疫熒光方法檢測VEGF 取出6孔板中的蓋玻片，D-Hank液漂洗3次；4%甲醛/PBS液固定15 min后，D-Hank液漂洗3次；1%牛血清白蛋白封閉30 min，加入100倍稀釋的一抗VEGF抗體孵育100 min，D-Hank液漂洗3次；1%牛血清白蛋白封閉30 min；加二抗孵育40 min，D-Hank液漂洗3次；DAB顯色1 min，D-Hank液漂洗3次；蘇木精復染胞核，樹膠封片。在熒光顯微鏡下隨機選取8個視野（n=6），取圖，計數。陽性細胞（棕色細胞）純度=陽性細胞/細胞總數（藍核細胞）×100%。

1.3統計學處理

采用SPSS 13.0統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1 BMSCs原代培養的光鏡形態分析

BMSCs原代培養第3天，在倒置顯微鏡下，多數細胞處于伸展狀態，呈梭形，折光率較低，貼于培養皿底壁；少數細胞處于未伸展狀態，呈圓形，折光率較高，附于培養皿底壁或處于懸浮狀態，散在分布（圖1）。

2.2 NRG1轉染BMSCs結果分析

NRG1轉染BMSCs 3 d，熒光倒置顯微鏡下，如圖2所示，主要由細胞的胞體均發出綠色熒光（質粒含綠色熒光蛋白eGFP基因）。由于細胞周期等因素影響，不同細胞發出的熒光強度呈現不統一狀態。

2.3 ELISA法檢測VEGF表達情況分析

NRG1轉染BMSCs上清液中VEGF的檢測結果如表1所示，NRG1轉染組VEGF表達隨時間增加呈增長趨勢，培養2、3、4、5 d組樣本與相應培養天數的對照組樣本對比較，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.4 VEGF的免疫組化檢測結果分析

免疫組化檢測結果顯示，呈棕色的細胞為VEGF表達陽性的細胞，細胞核經蘇木精非特異性染色呈藍色，可以計數細胞總數；轉染組DAB顯色深于對照組的顏色。轉染組陽性率為91.07%，對照組陽性率為70.82%，兩者比較差異有統計學意義（P<0.05）（圖3）。

3討論

為解決移植后BMSCs存活率過低的問題，科研工作者從不同角度進行了大量相關研究。有學者發現，低糖培養基、相對低的傳代接種密度和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）的使用更有利于BMSCs的增殖[6]。洛伐他汀[7]和糖皮質激素氫化可的松[8]被證實能夠有效地抑制缺氧無血清情況下引起的BMSCs凋亡。利用轉基因技術，帶有抗凋亡基因Bcl-2的BMSCs具有較高的移植存活能力并能促進病變邊緣區的毛細血管新生[9]。其他公認的抗凋亡基因如Akt轉染BMSCs也可減少移植后BMSCs的凋亡數量[10]，具有保護細胞生存功能的熱休克蛋白家族也被應用于促進BMSCs存活的研究中，并被證實可促進移植BMSCs的存活、增殖和分化能力[11]。攜帶VEGF基因的BMSCs可以促進缺血腦組織新生血管的形成[12]。本實驗結果顯示，多數BMSCs可表達VEGF，而少數BMSCs則不表達VEGF。這可能與BMSCs存在多種亞群有關。

NRG1又稱乙酰膽堿受體誘導激動劑、神經分化因子、神經膠質生長因子、感覺和運動神經元衍生因子，含表皮生長因子樣活性域，屬于生長和分化因子家族，主要表達在神經組織、呼吸系統和心臟，通過激活其受體ErbB發揮作用[13-14]。

有關NRG1與血管生成的關系，相關報道較少。NRG1敲除的小鼠缺血部位，毛細血管和動脈的發生減少，血流的恢復減慢；而外源性NRG1可加速血流的恢復[15]。在心臟中，NRG1主要由微血管內皮細胞和心內膜表達，能促進血管生成、減少細胞凋亡和減少氧化應激等作用[16]。心肌梗死中高表達NRG1能增加缺血心肌的微血管數量[17]。在體外，NRG1可以促進胚胎源性內皮祖細胞增殖，并經PI3K/Akt途徑，增強抗凋亡的能力，促進細胞存活[18]。還有研究顯示，NRG1處理的小鼠心臟中，血管新生的血管生成素1（angiopoietin-1，Ang-1）的表達明顯增加[19]。本實驗結果顯示，NRG1還可以通過調節使VEGF過表達，促進BMSCs的存活。

NRG1與多種細胞的VEGF表達相關聯。有研究顯示，NRG1可顯著提高糖尿病大鼠心肌組織VEGF的表達；在糖尿病和不穩定型心絞痛患者中，血清中NRG1濃度與VEGF濃度呈正相關[20]。人冠狀動脈平滑肌細胞能表達ErbB2、ErbB3和ErbB4，但不能表達NRG1；NRG1處理能增強VEGF的表達[21]。在心臟發育和成熟心臟研究中發現，NRG1可通過激活受體酪氨酸激酶的磷酸化進行系列的信號轉導發揮其生物學效應，使得VEGF表達增強[5，22]。還有研究顯示，在結腸癌的活檢標本中，NRGmRNA的表達與VEGF表達成正相關[23]。這些數據顯示，NRG1可能通過調節VEGF分泌，經自分泌、旁分泌和促血管新生等多種機制促進細胞的存活。

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（收稿日期：2017-07-21 本文編輯：祁海文）endprint