Slit2在肺腺癌中的表達及臨床意義

王會恩 張華 趙慶濤 谷建琦 閆繼東 呂錚 張志勇

·論著·

Slit2在肺腺癌中的表達及臨床意義

王會恩 張華 趙慶濤 谷建琦 閆繼東 呂錚 張志勇

目的探討肺腺癌組織和癌旁肺組織中的Slit2的表達及其臨床病理意義，進一步探討Slit2與肺腺癌發生、發展的關系，為肺腺癌的發生和防治機制提供進一步的臨床依據。方法收集2011年1月至2012年1月行肺腺癌手術的標本，共收集肺腺癌組織54例，癌旁正常組織20例，采用免疫組化方法檢測Slit2在肺腺癌組織和癌旁肺組織中的表達水平，分析Slit2的表達差異及與臨床病理特征的關系及其內在關聯。結果Slit2在癌旁肺組織中的表達高于肺腺癌組織中的表達(Plt;0.05)，Slit2與肺腺癌的分化程度、淋巴結轉移和臨床分期相關(Plt;0.05)。結論Slit2在肺腺癌中低表達，提示Slit2可能在腫瘤的發生發展過程中起到抑制腫瘤發展的作用；肺腺癌中Slit2的表達與肺腺癌組織的分化程度、有無淋巴結轉移和臨床分期相關，說明Slit2與肺腺癌的惡性生物學行為密切相關，檢測Slit2在腫瘤組織中的表達可為腫瘤患者的預后和監測腫瘤的生物學行為提供依據。

肺腺癌；Slit2；臨床病理特征；免疫組織化學染色法

目前，我國惡性腫瘤的發病率呈逐年上升的趨勢，其中以肺癌的發病率位居榜首，病死率也位居前列，并且5年生存率僅有15%左右[1]。雖然醫生一直致力于提高手術技術和改善化療方案，但是肺癌患者尤其是一些晚期不能耐受手術的患者的生存率仍不是很理想[2,3]。因此，我們需要尋找新的靶點以對肺癌的治療進行徹底的改善。Slit是體內的一種細胞外基質蛋白，并且由神經膠質細胞分泌，在體內的主要功能是起導向和遷移神經元的軸突的作用[4]，在體外的功能主要是參與感覺軸突的再生長和側枝發芽[5,6]。哺乳動物體內的Slit包括Slit1、Slit2和Slit3三種亞型，Slit1一般表達于神經系統，后二者則一般存在于肺、腎等多種組織中[7-9]。Slit基因是一種細胞外分泌蛋白，其主要是由4p15.2編碼的，其中Slit2的分子量為170～190 kD，結構域包括N端短的信號肽、四個富含亮氨酸的重復序列、九個表皮生長因子樣功能區，一個ALPS區域和一個C端富含半胱氨酸的區域。近幾年來，Slit2與腫瘤的關系備受關注，Slit2是一種新型的抑癌基因，在多種腫瘤中存在因啟動子超甲基化表達降低或缺失現象，同時還存在促進腫瘤血管生成的作用，有較大的研究空間，很有可能成為腫瘤輔助診斷和治療的一個新的靶點。本研究主要探討Slit2在肺腺癌發生發展過程中的作用及其可能的抑癌通路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年1月至2012年1月在唐山市工人醫院行肺腺癌根治術患者的癌組織標本，病例納入標準為：(1)所有收集的病例診斷結果都必須符合WHO中肺癌的診斷標準，并且所有病例均經過兩位副高及以上的醫師進行確診及分型。(2)患者手術前后均未經過任何系統化的治療，比如放化療，所有病例均排除應用免疫抑制劑治療和伴有風濕性免疫系統相關疾病的患者，排除合并其他系統惡性疾病。(3)患者臨床病理資料完善，隨訪資料齊全。本試驗共收集肺腺癌組織54例，其中男34例，女20例；年齡36～80歲，平均年齡(54±92)歲；有淋巴結轉移的病例25例，無淋巴結轉移的病例29例；有胸膜侵犯的病例20例，無胸膜侵犯的病例34例；中高分化組病例22例，低分化組的病例32例；臨床分期為Ⅰ和Ⅱ期的病例20例，Ⅲ和Ⅳ期34例。選取20例癌旁肺組織作為對照，其中男12例，女8例；年齡34～78歲，平均年齡(56±8)歲。2組患者在性別比、年齡等相關因素比較差異無統計學意義(Pgt;0.05)，具有可比性。

1.2 試劑 Slit2為兔抗單克隆抗體，購自中杉金橋公司，二抗等免疫組化相關試劑均購自中杉金橋公司。

1.3 方法 選取合適大小的肺腺癌組織塊和癌旁肺組織塊HE染色后，由經驗豐富的病理醫師在普通光學顯微鏡下找出肺腺癌區域和相應的正常組織區域，用記號筆在HE切片上做上標記，劃出范圍，找到對應病理號的石蠟組織塊，和HE切片標記的區域進行比對，找出標記部位的石蠟組織進行免疫組化染色。免疫組化染色所有步驟均依照各個抗體的說明書進行操作，用PBS作為陰性對照(代替一抗)。

1.4 免疫組化法判斷標準 Slit2蛋白表達部位主要位于細胞質，以細胞質出現棕黃色顆粒為陽性表達，每張切片均按照染色強度和染色的百分比進行分級，依據染色強度主要分為4級；無著色與背景顏色一致，為0分，弱染色呈淺黃色，顏色略高于背景著色時，為1分，中度染色呈黃色，顏色較明顯高于背景著色時，為2分，強染色呈棕褐色，顏色明顯高于背景著色，為3分。依據陽性百分比主要劃分為4級：染色面積為0時記為0分，染色面積為1%～25%時記為1分，染色面積為26%～50%時記為2分，染色面積gt;50%時記為3分。然后兩項分數相加在0～2分為陰性表達，≥3分為陽性表達。

1.5 統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件，計數資料采用χ2檢驗或Fisher精確概率法，Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HE染色觀察癌旁肺組織和肺腺癌組織中的形態學差異 癌旁肺組織肺泡大小一致，細胞排列整齊，肺泡上皮扁平、無異型性。間質無炎細胞及纖維組織增生。實性生長型及貼壁為主型等腺癌，可見肺泡管及肺泡的異常擴張，內含單層或多層的癌細胞，肺泡間隔完整，增寬，呈腺樣生長；腺泡型腺癌，細胞異型性明顯，結構排列不一，有的呈團塊狀或條索狀排列，有的可見腺腔形成，排列成腺樣結構或管狀。見圖1～4。

圖1 癌旁肺組織(HE×100)

圖2 腺泡型肺腺癌組織(HE×100)

圖3 肺附壁生長為主型腺癌組織(HE×100)

圖4 實性生長型肺腺癌組織(HE×100)

2.2 Slit2蛋白在癌旁肺組織和肺腺癌組織中的表達比較 Slit2蛋白主要表達于細胞質，在癌旁肺組織中的細胞質可見深染的棕黃色顆粒，肺腺癌組織中也可見淡染的淺黃色顆粒。Slit2在癌旁肺組織和肺腺癌組織中的陽性表達率分別為60.00%和18.51%，與癌旁肺組織相比，Slit2蛋白在肺腺癌組織中的表達明顯降低，2組差異有統計學意義(χ2=12.021，P=0.001)。見圖5、6，表1。

2.3 Slit2蛋白的表達與臨床病理特征之間的關系 Slit2蛋白在高+中分化的肺腺癌組織中的陽性表達率為36.36%，在低分化的肺腺癌組織中的陽性表達率為6.25%，即Slit2蛋白的表達與肺腺癌的分化程度有關，差異有統計學意義(χ2=5.966,P=0.015)；Slit2蛋白在無淋巴結轉移的肺腺癌組織中的陽性表達率為31.03%，在有淋巴結轉移的肺腺癌組織中的陽性表達率為4.00%，即Slit2蛋白的表達與肺腺癌淋巴結是否轉移相關，差異有統計學意義(χ2=4.835,P=0.028)；Slit2蛋白在Ⅰ～Ⅱ期的肺腺癌組織中的陽性表達率為45.00%，而處在Ⅲ～Ⅳ期的肺腺癌組織中的陽性表達率為2.94%，即Slit2蛋白的表達與肺腺癌的臨床分期相關，差異有統計學意義(χ2=12.107,P=0.001)；而Slit2蛋白的表達與肺腺癌患者的年齡、性別、是否侵及胸膜無關，差異無統計學意義(Pgt;0.05)。見表2。

圖5 Slit2蛋白在癌旁肺組織中的表達(IHC×100)

圖6 Slit2蛋白在肺腺癌組織的表達(IHC×100)

表1 Slit2蛋白在癌旁正常肺組織和肺腺癌中的表達 例

3 討論

原發性支氣管肺癌(primary baonchogenic carcinoma)簡稱為肺癌，是一種起源于支氣管腺體或黏膜上皮，常常伴有血性播散和淋巴結轉移，肺組織內的細胞生長不受控制的疾病。肺癌的早期臨床表現相對較復雜，癥狀的有無多數主要是由腫瘤的部位，具體病理類型、有無淋巴結及遠處器官的轉移和患者自身的耐受情況決定的。本文主要通過Slit2在肺腺癌中的表達以及與臨床病理特征之間的關系，探討Slit2在肺腺癌等惡性腫瘤發展過程中的具體作用及機制，以期為肺腺癌的治療和預防提供有力的理論支持。

本實驗結果顯示Slit2蛋白在癌旁肺組織和肺腺癌組織中的陽性表達率分別為60.00%和18.51%，Slit2蛋白的表達在肺腺癌組織中的表達低于癌旁肺組織中的表達，經過統計學分析顯示，2組之間的差異有統計學意義(χ2=12.021，P=0.001)。從結果中可以看出，Slit2蛋白在肺腺癌中的表達相對于癌旁肺組織呈低表達，表明Slit2可能在肺腺癌的發生過程中起到抑制作用。我們實驗所得的結果與Grieshammer 等[10-13]的研究結果一致。Dallol等[14]發現在肺腺癌等缺失等位基因的腫瘤中同樣存在Slit2基因超甲基化的現象，提示該基因在腫瘤體內可能已經失活。Ruo-chia Tseng 等[15]也對Slit2蛋白在肺腺癌和正常組織的表達進行了研究，發現Slit2蛋白在正常組織中的表達遠高于肺癌中的表達，在肺癌組織中幾乎不表達。多項研究發現，Slit2蛋白可以在乳腺癌患者體內通過調節PI3K/AKT等途徑來抑制乳腺癌細胞的生長，還可能Slit2基因在乳腺癌患者體內發生超甲基化，導致Slit2的表達下調甚至缺失，進一步提示Slit2蛋白的下調可能在乳腺癌的發展過程起到了重要的作用[16-18]。此外，Dallol等[19]還發現，研究的7個神經膠質瘤細胞中會有至少5個細胞存在超甲基化現象；在多數的結直腸癌、神經母細胞瘤、Wilms瘤、成神經管細胞瘤和腎母細胞瘤中也會因為啟動子區域的甲基化、等位基因的缺失等導致Slit2蛋白的表達量減低[20]。Prasad等[21]進行了體外實驗，實驗人員發現外源性導入Slit2或加入去甲基化藥物5-氮雜胞苷時，腫瘤細胞的遷移和侵襲能力就會減弱，Sonja等[22]在膠質瘤中也發現了此現象。研究人員在膠質瘤中進行了Slit/Robo1抑制實驗，首先加入外源性Slit2，然后運用細胞遷移實驗來觀測Slit對膠質瘤細胞的運動能力的作用及影響，結果發現加入外源性的Slit2后，膠質瘤細胞會發生排斥效應，即膠質瘤細胞會向低濃度的Slit2方向運動。所以該研究人員猜測膠質瘤旁的正常組織內該蛋白的表達可能會高于膠質瘤組織中的表達，這種差值就有可能導致多數膠質瘤的發病由灰質侵襲至白質。當研究人員在膠質瘤細胞內加入Slit2后，就會抑制膠質瘤的惡性細胞向白質浸潤遷移，推測可能是因為膠質瘤細胞內加入Slit2后，膠質瘤細胞中Slit2的濃度與周圍正常組織中的差值就減少，使得細胞對周圍組織的排斥作用減弱，導致上述所說的Slit2會抑制腫瘤細胞的遷移和浸潤的作用。同時還發現Slit2導致上述現象的原因主要是因為Robo1受體的介導。

表2 Slit2蛋白的表達與肺腺癌臨床病理特征之間的關系 例

本實驗結果顯示Slit2蛋白在高+中分化的肺腺癌組織中的陽性表達率為36.36%，在低分化的肺腺癌組織中的陽性表達率為6.25%，即Sllit2蛋白在高+中分化肺腺癌組織中的表達高于低分化組中的表達，差異有統計學意義(χ2=5.966,P=0.015)；Slit2蛋白在無淋巴結轉移的肺腺癌組織中的陽性表達率為31.03%，在有淋巴結轉移的肺腺癌組織中的陽性表達率為4.00%，即Slit2蛋白的表達與肺腺癌淋巴結呈負相關，即在有淋巴結組中的表達低于無淋巴結轉移組中的表達，其間差異有統計學意義(χ2=4.835,P=0.028)；Slit2蛋白在Ⅰ+Ⅱ期的肺腺癌組織中的陽性表達率為45.00%，而處在Ⅲ+Ⅳ期的肺腺癌組織中的陽性表達率為2.94%，即Slit2蛋白在Ⅰ+Ⅱ期中的表達高于Ⅲ+Ⅳ期中的表達，差異有統計學意義(χ2=12.107,P=0.001)；進一步說明Slit2可以在肺腺癌患者體內起到抑制腫瘤轉移和侵襲的作用。對于評定肺腺癌患者的預后有重要意義。而Slit2蛋白的表達與肺腺癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、組織分型以及是否侵及胸膜無關，其間的差異無統計學意義(Pgt;0.05)。我們的實驗結果與孫麗梅等[18]對Slit2蛋白的表達與乳腺癌的臨床病理特征關系的研究結果基本一致，即Slit2蛋白在乳腺癌中會起到抑制腫瘤的發展的作用，并且與淋巴結轉移等臨床病理特征呈負相關，她們同樣發現Slit2蛋白能夠對乳腺癌的預后進行評估。以上結果均說明Slit2蛋白的表達可能在腫瘤的發展中起到抑制作用，并且很有可能是通過促進腫瘤細胞的凋亡而抑制腫瘤的生長。但其具體機制通路還不是很明確。

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ExpressionandclinicalsignificanceofSlit2inlungadenocarcinoma

WANGHui’en*,ZHANGHua,ZHAOQingtao,etal.

HebeiGeneralHospital,Hebei,Shijiazhuang050051,China

ObjectivesTo investigate the expression and clinical significance of Slit2 in lung adenocarcinoma tissues and peritumoral normal lung tissues,and to explore the correlation between Slit2 expression and pathogenesis and development of lung adenocarcinoma in order to provide more evidences for the prevention and treatment of lung adenocarcinoma.MethodsFifty-four cases of lung adenocarcinoma tissues and 20 cases of peritumoral normal lung tissues were collected from the patients who underwent lung adenocarcinoma operation in Tangshan Gongren Hospital from January 2011 to January 2012. The expression levels of Slit2 were detected by immunohistochemisty,and the correlation between Slit2 expression and clinicopathological charateristics of lung adenocarcinoma was analyzed.ResultsThe expression levels of Slit2 in peritumoral normal lung tissues were significantly higher than those in lung adenocarcinoma tisues (Plt;0.05). Moreover the expression levels of Slit2 were closely correlated to the differentiation degree, lymph node metastasis and clinical staging of lung adenocarcinoma (Plt;0.05).ConclusionThe low expression of Slit2 in lung adenocarcinoma suggests that Slit2 may play an important role in inhibiting growh of tumor during pathogenesis and development of lung adenocarcinoma. Moreover the expression levels of Slit2 are closely correlated to the differentiation degree, lymph node metastasis and clinical staging of lung adenocarcinoma,which indicates that Slit2 expression is related with malignant biological behavior of lung adenocarcinoma,thus, the detection of Slit2 expression in tumor tissues can provide basis for evaluating patient’s prognosis and monitoring biological behavior of tumor.

lung adenocarcinoma; Slit2; clinicopathological charateristics; immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.24.004

050051 石家莊市，河北省人民醫院(王會恩、張華、趙慶濤、谷建琦);河北省唐山市工人醫院(閆繼東、呂錚、張志勇)

張志勇，063000 河北省唐山市工人醫院；E-mail:wanghe_829@163.com

R 734.2

A

1002-7386(2017)24-3697-04

2017-05-22)