Siewert Ⅱ型食管胃結合部腺癌組織中PDZK1和PDGFR-β的表達及相互作用

蒲昌盛 鄭 智 蔡 軍 唐華臻 張 軍 張忠濤

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院普外科，北京 100050)

·消化外科專題·

SiewertⅡ型食管胃結合部腺癌組織中PDZK1和PDGFR-β的表達及相互作用

蒲昌盛 鄭 智 蔡 軍 唐華臻 張 軍*張忠濤

(首都醫科大學附屬北京友誼醫院普外科，北京 100050)

目的探究Siewert Ⅱ型食管胃結合部腺癌組織中PDZ蛋白激酶1(PDZ kinase 1，PDZK1)和血小板源性生長因子受體-β(platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β)的表達以及相互之間的作用，對比PDZK1和PDGFR-β在Siewert Ⅱ型食管胃結合部腺癌與遠端胃癌的表達差異，探尋PDZK1是否能成為食管胃結合部腺癌靶向治療的新靶點和分子分型的依據。方法從患者組織蠟塊中采集標本，制作成石蠟切片，進行免疫組織化學染色。采用半定量評分系統評定免疫組織化學染色結果并做統計分析。結果PDZK1在食管胃結合部腺癌組織中陽性表達率為30%(12/40)，在食管胃結合部正常組織中陽性表達率為95%(38/40)，差異無統計學意義(P=0.268)。PDGFR-β在食管胃結合部腺癌組織中陽性表達率為80%(32/40)，食管胃結合部正常組織中陽性表達率為28%(11/40)，差異無統計學意義(P=0.648)。PDZK1和PDGFR-β在食管胃結合部正常組織無明顯相關性(r=0.026，P=0.874)，PDZK1和PDGFR-β在食管胃結合部腺癌組織無明顯相關性(r=0.111，P=0.497)。對比本課題組前期研究的遠端胃癌，結果顯示PDZK1在胃食管結合部正常組織中表達要高于遠端胃正常組織(Z=-1.997，P=0.046)，同樣PDGFR-β在胃食管結合部腺癌組織中表達要高于遠端胃癌組織(Z=-3.811，P=0.000)，差異具有統計學意義。結論PDGFR-β在Siewert Ⅱ食管胃結合部腺癌組織中呈現高表達，PDZK1在Siewert Ⅱ食管胃結合部正常組織中呈現高表達。PDZK1與PDGFR-β在Siewert Ⅱ食管胃結合部腺癌組織和正常組織中的表達均未表現出相關性。Siewert Ⅱ型食管胃結合部腺癌中PDZK1與PDGFR-β的表達要高于遠端胃癌，結合其不同于胃癌的臨床特點，食管胃結合部腺癌有可能是不同于遠端胃癌的一類特殊腫瘤，而且PDZK1有可能在食管胃結合部腺癌的分子分型和靶向治療方面提供一定的參考價值，為后續的研究提供了新的思路。

食管胃結合部腺癌；PDZ蛋白激酶l；血小板源性生長因子受體-β；胃癌

本研究采用免疫組織化學的方法檢測PDZ蛋白激酶1(PDZ kinase 1，PDZK1)及血小板源性生長因子受體-β(platelet-derived growth factor receptor-β，PDGFR-β)在Siewert Ⅱ 型食管胃結合部腺癌及食管胃結合部正常組織中的表達情況，探討PDZK1和PDGFR-β在Siewert Ⅱ 型食管胃結合部腺癌中發生、發展的關系，隨后分析兩種蛋白之間的相互關系和作用,對比PDZK1和PDGFR-β在Siewert Ⅱ 型食管胃結合部腺癌與遠端胃癌的表達差異，探尋PDZK1是否能成為食管胃結合部腺癌靶向治療的新靶點和分子分型的依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

Siewert Ⅱ型食管胃結合部腺癌組織及食管胃結合部正常組織(癌旁組織)的石蠟標本來源于2014年8月至2016年8月間首都醫科大學附屬北京友誼醫院胃腸外科進行手術患者的組織標本，其中男性38例，年齡40～76歲，中位年齡58歲；女性3例，年齡53～74歲，中位年齡63歲。所有患者均是初診為Siewert Ⅱ型食管胃結合部腺癌(adenocarcinoma of the esophagogastric junction,AEG)，即腫瘤中心位置距離食管胃結合部(esophagogastric junction，EGJ)上1 cm和下2 cm 之間者，術后病理組織學診斷為食管胃結合部腺癌，術前未進行新輔助放化療。手術切除標本的使用已得到患者和家屬的同意。

1.2 實驗方法

將患者組織蠟塊制成石蠟切片。免疫組織化學步驟：脫蠟水化、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、血清封閉、加抗體、DAB顯色、復染胞核、脫水封片。采用組織化學評分標準(histochemistry score，H-score)，由病理學家采取盲法獨立評定免疫組織化學結果。判斷標準：陽性細胞為細胞膜、胞質顯示棕黃色顆粒；隨機觀察10個高倍視野(400倍)，每個視野下計數100個細胞，把切片內陽性的細胞染色強度和數目轉變成相對應的數值，二者數值相乘得出評分。染色強度的分數被定為：陰性0分；弱陽性1分；中陽性2分；強陽性3分。陽性細胞的百分數定義為：少于5%，0分；在5%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；75%，4分。H-score得分，0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～7分為中陽型，8～12分被認為是強陽性。

1.3 本課題組前期研究結果

本課題組的前期研究[1]，對92名遠端胃癌患者的組織標本(腫瘤位于距EGJ 5 cm以下的胃體和胃竇)進行相同的免疫組織化學染色，結果顯示PDZK1在遠端胃癌(distal gastric cancer，DGC)組織中陽性表達率為13%(12/92)，在正常胃組織中陽性表達率為68%(63/92)，差異無統計學意義(P=0.181)。PDGFR-β在遠端胃癌組織中陽性表達率為78%(72/92)，正常胃組織中陽性表達率為64%(59/92)，差異有統計學意義(P=0.000)。

1.4 統計學方法

用SPSS 22．0進行統計分析。計數資料采用頻數和百分數表示，配對數據組間比較采用配對χ2檢驗，獨立樣本數據組間比較采用χ2檢驗。等級資料采用頻數和百分數表示，配對數據組間比較采用配對秩和檢驗，獨立樣本數據組間比較采用秩和檢驗。采用Spearman等級相關系數描述相關性。以P<0．05為差異有統計學意義。

2 結果

全部入組的食管胃結合部腺癌患者均有完整的臨床資料。實驗過程中脫片1例，最后有效標本數為40例。

2.1 PDZK1在食管胃結合部腺癌組織中的表達

PDZK1主要分布在細胞膜和細胞質，陽性表現為棕黃色，強陽性表現為棕褐色(圖1A，B)，陰性者細胞膜和細胞質未見染色(圖1C，D)。PDZK1在食管胃結合部腺癌組織中陽性表達率為30%(12/40)，在食管胃結合部正常組織中陽性表達率為95%(38/40)，差異無統計學意義(P=0.268)。

圖1 PDZK1的表達Fig.1 Expression of PDZK1

A:expression of PDZK1 in normal tissue of the esophagogastric junction (200×);B:expression of PDZK1 in normal tissue of the esophagogastric junction (400×);C:expression of PDZK1 in adenocarcinoma of the esophagogastric unction (200×);D:expression of PDZK1 in adenocarcinoma of the esophagogastric unction (200×);PDZK1:PDZ kinase 1.

2.2 PDGFR-β在食管胃結合部腺癌組織中的表達

PDGFR-β主要分布在細胞膜，染色陰性未見顯色(圖2A，B)陽性呈現為網格狀棕黃色，強陽性表現為棕褐色(圖2C，D)。PDGFR-β在食管胃結合部腺癌組織中陽性表達率為80%(32/40)，在食管胃結合部正常組織中陽性表達率為28%(11/40)，差異無統計學意義(P=0.648)。

2.3 在AEG中PDZK1和PDGFR-β與臨床病理特征的關系

在不同分化AEG中，高、中分化(7/23)與低分化(5/17)相比，PDZK1的表達差異無統計學意義(χ2=0.005，P=0.944)。在不同浸潤深度AEG中，T1～T2(4/6)與T3～T4相比 (8/34)，PDZK1的表達差異無統計學意義(χ2=2.698，P=0.100)。在是否出現淋巴結轉移AEG中，轉移(8/28)與未轉移 (4/12)，PDZK1的表達差異無統計學意義(χ2=0.000，P=1.000)。在不同分期AEG中，Ⅰ期+Ⅱ期(5/13)與Ⅲ期+Ⅳ期(7/27)相比，PDZK1的表達差異無統計學意義(χ2=0.195，P=0.658)。

在不同分化AEG中，高、中分化(2/3)與低分化(31/37)相比，PDGFR-β表達差異無統計學意義(χ2=0.000，P=1.000)。在不同浸潤深度AEG中，T1～T2(6/6)與T3～T4 (27/34)相比，PDGFR-β的表達差異無統計學意義(χ2=0.411，P=0.522)。在是否出現淋巴結轉移AEG中，轉移(21/28)與未轉移 (11/12)相比，PDGFR-β的表達差異無統計學意義(χ2=0.603，P=0.438)。在不同分期AEG中，Ⅰ期+Ⅱ期(11/13)與Ⅲ期+Ⅳ期(22/27)相比，PDGFR-β的表達差異無統計學意義(χ2=0.000，P=1.000)。

圖2 PDGFR-β的表達Fig.2 Expression of PDGFR-β

A:expression of PDGFR-β in normal tissue of the esophagogastric junction (200×);B:expression of PDGFR-β in normal tissue of the esophagogastric junction (400×);C:expression of PDGFR-β in adenocarcinoma of the esophagogastric unction (200×);D:expression of PDGFR-β in adenocarcinoma of the esophagogastric unction (200×);PDGFR-β:platelet-derived growth factor receptor-β.

2.4 PDZK1和PDGFR-β在食管胃結合部腺癌和遠端胃癌表達的比較

本次研究中，為了探究Siewert Ⅱ AEG和DGC中表達差異性，根據H-score評分方法將其陽性表達按照強弱分為：陰性、弱陽性、中陽性、強陽性。進行秩和檢驗和統計分析(表1)，結果顯示PDZK1在胃食管結合部正常組織中表達要高于遠端胃正常組織(Z=-1.997，P=0.046)，同樣PDGFR-β在胃食管結合部腺癌組織中表達要高于遠端胃癌組織(Z=-3.811，P=0.000)，差異具有統計學意義。

表1 PDZK1和PDGFR-β在Siewert Ⅱ胃食管結合部腺癌和遠端胃癌中的表達差異Tab.1 Expression of PDZK1 and PDGFR-β of Siewert Ⅱ AEG and DGC

PDZK1:PDZ kinase 1;PDGFR-β:platelet-derived growth factor receptor-β；AEG:adenocarcinoma of the esophagogastric junction;DGC:distal gastric cancer.

2.5 PDZK1和PDGFR-β在食管胃結合部腺癌組織和正常組織中的相關性

對比研究PDZK1和PDGFR-β在食管胃結合部正常組織和食管胃結合部腺癌組織中表達的相關性，采用Spearman等級相關檢驗方法，結果顯示：PDZK1和PDGFR-β在食管胃結合部正常組織無明顯相關性(r=0.026，P=0.874)，PDZK1和PDGFR-β在食管胃結合部腺癌組織無明顯相關性(r=0.111，P=0.497)。

3 討論

3.1 PDGFR-β在AEG組織中的表達及其臨床意義

本研究證實，PDGFR-β在食管胃結合部腺癌組織中呈現高表達，主要分布于細胞膜，對比其在食管胃結合部正常組織中陽性表達，差異無統計學意義。Chen等[2]研究顯示PDGF和血小板源性生長因子受體PDGFR在發育的早期階段，特別是在血管和器官的形成中發揮關鍵作用。并且當PDGFR-β過度激活和異常表達時，能夠誘導腫瘤新生血管的生成、直接或間接參與了腫瘤的侵襲與轉移[3]，PDGFR-β可能是食管胃結合部腺癌發生發展的重要因素之一。Cao[4]研究發現PDGF及PDGFR表達水平與腫瘤生長、侵襲性有關，而且PDGF/PDGFR通過對促進血管細胞和基質細胞在腫瘤中的生長，對腫瘤轉移和腫瘤微環境的調節產生影響。Appiah-kubia等[5]相關研究表明PDGFR-β在腫瘤的診斷和治療方面前景讓人振奮。一些學者[6-8]也在其他部位的腫瘤中，例如肺癌、腎癌、結直腸癌等發現PDGF/PDGFR對于腫瘤發生發展的影響，對促進血管細胞生成有一定作用。

3.2 PDZK1在AEG組織中的表達及其臨床意義

本研究顯示，PDZK1在食管胃結合部正常組織中陽性表達呈現高表達，主要分布于細胞質和細胞膜，對比其在食管胃結合部腺癌組織中的陽性表達，差異無統計學意義。Turner等[9]證明PDZK1在血管內皮細胞增生和血管形成中的重要作用，Lee等[10]也證實PDZK1通過抑制斷點簇區域的激酶而阻止血管平滑肌新內膜形成。而且，Walther等[11]發現PDZK1通過調節G蛋白偶聯受體來發揮作用。PDZK1在腫瘤發生發展過程中起到關鍵作用，研究[12]表明低水平的PDZK1表達預示著患者預后較差。因此，從理論上講，PDZK1和PDGFR-β對血管的形成和生長方面呈現出相互拮抗的作用。

3.3 PDGFR-β和PDZK1之間的關系

本課題組的前期研究[1，13]顯示，通過PI3K/Akt途徑和MAPK途徑，PDGFR信號轉導途徑可以對胃癌的生長、分化、遷移及凋亡進行調節；并且在胃癌和正常胃組織中，PDGFR-β、PI3K/Akt、MAPK的表達差異有統計學意義，即相比胃正常組織中，三者在胃癌組織均呈現高表達，研究表明胃癌細胞高分裂和高轉移的特性可能與這種高表達有關。在胃癌與正常胃組織中，PDZK1的表達差異有統計學意義，即在胃癌中PDZK1呈現低表達或陰性表達，在胃癌中PDZK1與PDGFR-β的表達呈現負相關。這表明PDZK1可能通過PDGFR-β的D-S-F-L典型第1類PDZ蛋白結合基序與之結合，抑制胃癌的發生、發展。那么在不同于胃癌的Siewert Ⅱ型AEG中，PDGFR-β和PDZK1之間的相互關系及作用是否有差異，有待進一步研究。

3.4 PDZK1和PDGFR-β在食管胃結合部腺癌和遠端胃癌表達的比較

和DGC比較，AEG是一種特殊類型的腫瘤，筆者在臨床上發現，無論在腫瘤的病因、臨床病理特征、淋巴轉移、治療方式、靶向治療和預后等多方面有其顯著的特殊性，尤其Siewert Ⅱ型AEG(腫瘤中心位于食管胃結合部1 cm至下2 cm范圍)起源于交界上皮細胞，腫瘤生物學特性兼有食管和胃癌的特性。這些都表現出AEG的獨特性。目前對于AEG的發生、發展的具體機制還不清楚，尚未存在AEG的分子分型，本研究顯示，PDZK1在胃食管結合部正常組織中表達要高于遠端胃正常組織，同樣PDGFR-β在胃食管結合部腺癌組織中表達要高于遠端胃癌組織。根據組織中蛋白表達強度的差異性，結合其獨特的臨床病理特性，說明Siewert Ⅱ型AEG有可能是不同遠端胃癌的一類特殊腫瘤，而且PDZK1有可能在AEG的分子分型和靶向治療方面提供一定的參考價值。

3.5 PDZK1和PDGFR-β在食管胃結合部腺癌組織和正常組織中的相關性

通過本研究，筆者并未發現PDZK1和PDGFR-β在食管胃結合部正常組織和食管胃結合部腺癌組織中的表達存在相關性，這可能與病例數較少有關，通過后期病例的收集，可進行進一步的驗證；這也有可能與AEG不同于遠端胃癌的生物學特性有關，在分子作用機制方面存在差別。

3.6 結論

本研究結果表明，PDGFR-β在食管胃結合部腺癌組織中呈現高表達，主要分布于細胞膜，對比其在食管胃結合部正常組織中陽性表達，差異無統計學意義。PDZK1在食管胃結合部正常組織中陽性表達呈現高表達，主要分布于細胞質和細胞膜，對比其在食管胃結合部腺癌組織中的陽性表達，差異無統計學意義。在食管胃結合部正常組織和食管胃結合部腺癌組織中，PDZK1與PDGFR-β的表達均未表現出相關性。

PDZK1和PDGFR-β在食管胃結合部腺癌和遠端胃癌表達的比較研究表明，Siewert Ⅱ型食管胃結合部腺癌兩種蛋白的表達要高于遠端胃癌，結合二者臨床特點，食管胃結合部腺癌可能是不同于遠端胃癌的一類特殊腫瘤，而且PDZK1有可能在AEG的分子分型和靶向治療方面提供一定的參考價值，為后續的研究提供了新的思路。

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ExpressionandinteractionofPDZK1andPDGFR-βinadenocarcinomaoftheesophagogastricjunctionofSiewertⅡ

Pu Changsheng,Zheng Zhi,Cai Jun,Tang Huazhen,Zhang Jun*,Zhang Zhongtao

(DepartmentofGeneralSurgery,BeijingFriendshipHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China)

ObjectiveTo study the expression and interaction of PDZ kinase 1 (PDZK1) and platelet-derived growth factor receptor-β (PDGFR-β) in Siewert Ⅱ adenocarcinoma of the esophagogastric junction.To compare the expression of PDZK1 and PDGFR-β in Siewert Ⅱ adenocarcinoma of the esophagogastric junction and distal gastric cancer.To investigate whether PDZK1 is a new target of adenocarcinoma of the esophagogastric junction (AEG) targeted therapy and the basis of molecular typing.MethodsParaffin sections were prepared for immunohistochemical staining.Semi-quantitative scoring system was used to evaluate the results of immunohistochemical staining and then statistical analysis was performed.ResultsThere was 30% (12/40) positive rate of PDZK1 in the adenocarcinoma of the esophagogastric junction.There was 95% (38/40) positive rate of PDZK1 in the normal tissues of esophagogastric junction.There was no significant difference between two tissues (P=0.268).There was 80% (32/40) positive rate of PDGFR-β in the adenocarcinoma of the esophagogastric junction.There was 28% (11/40) positive rate of PDGFR-β in the normal tissue of esophagogastric junction.There was no significant difference between two tissues (P=0.648).There was no significant correlation between PDZK1 and PDGFR-β in the normal tissue of the esophagogastric junction (r=0.026,P=0.874) and the adenocarcinoma of the esophagogastric junction (r=0.111,P=0.497).Compared with distal gastric cancer,the expression of PDZK1 in the normal tissue of the esophagogastric junction was higher than that in the distal gastric tissues (Z=-1.997，P=0.046).the expression of PDGFR-β in the adenocarcinoma tissues of the gastroesophageal junction was higher than that in the distal gastric tissues (Z=-3.811，P=0.000),there was significant difference.ConclusionThere was highly expression of PDGFR-β in adenocarcinoma of the esophagogastric junction.There was highly expression of PDZK1 in normal tissues of the esophagogastric junction.There was no significant correlation between PDZK1 and PDGFR-β in the normal tissues of the esophagogastric junction and the adenocarcinoma of the esophagogastric junction.Combined with the clinical characteristics,the adenocarcinoma of esophagogastric junction may be different from the distal gastric cancer.With the determination of expression of PDZK1,it is possible to provide some reference value in AEG molecular classification and targeted therapy.

adenocarcinoma of the esophagogastric junction；PDZ kinase 1 (PDZK1)；platelet-derived growth factor receptor-β(PDGFR-β)；gastric cancer

首都特色臨床研究資助項目(Z131107002213046)，北京市衛生系統高層次衛生技術人才培養計劃資助項目(2013-3-067)。This study was supported by Capital Characteristic Clinical Research Project (Z131107002213046),Beijing Municipal Health System High-level Health Technician Training Program (2013-3-067).

*Corresponding author，E-mail：zhangjundoctor@163.com

時間：2017-12-13 21∶09

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20171213.2109.038.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.06.005]

R656

2017-10-16)

編輯 孫超淵