Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化重樓總皂苷的提取工藝研究*

范少敏，史亞軍，張小飛，王 瑜，梁玉琳

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng) 712046)

·方藥縱橫·

Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化重樓總皂苷的提取工藝研究*

范少敏，史亞軍，張小飛△，王 瑜，梁玉琳

陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽(yáng) 712046)

目的：應(yīng)用Box-Behnken效應(yīng)面對(duì)重樓中重樓總皂苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究。方法：將提取工藝中乙醇的濃度、重樓總皂苷提取時(shí)間及液藥比作為自變量，重樓總皂苷提取率為因變量，用效應(yīng)面法選擇最佳提取工藝，并將預(yù)測(cè)值與觀測(cè)值進(jìn)行比較。結(jié)果：重樓中重樓總皂苷的最佳提取工藝參數(shù)采用62.5%濃度乙醇、液藥比例為16.5∶1，提取時(shí)間為3.0 h。經(jīng)3批工藝驗(yàn)證驗(yàn)證重樓總皂苷的實(shí)際提取量與預(yù)測(cè)提取量二者的相對(duì)誤差為2.61%。結(jié)論：使用Box-Behnken效應(yīng)面法優(yōu)化重樓中重樓總皂苷的提取工藝，方法簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠，預(yù)測(cè)性良好。

重樓屬百合科植物云南重樓或七葉一枝花的干燥根莖，主要產(chǎn)地為云南、陜西，經(jīng)研究表明其具有清熱解毒、抗腫瘤、消腫止痛等功效[1]。重樓的根莖類圓柱形，多較平直，少數(shù)彎曲，直徑l～6 cm，長(zhǎng)4.5～12 cm。重樓屬植物為多年生草木。根莖匍匐狀，莖單生，直立。葉4至多枚輪生，極少3，具葉柄，披針形到卵形，基部具3條主脈，為網(wǎng)狀脈。花單生于葉輪之上，花被和雄蕊4數(shù)或更多。花藥基部著生，子房近球形，1室側(cè)膜胎座或4-10室具中軸胎座，有胚珠多數(shù)。果為漿果或蒴果，不裂或室背開裂，數(shù)枚到多數(shù)種子。表面黃棕色，少數(shù)灰褐色，較平滑;環(huán)節(jié)較稀疏，突起不明顯;莖痕半圓形或扁圓形，不規(guī)則排列，表面較平或稍突起。質(zhì)堅(jiān)硬，不易折斷，斷面粉質(zhì)或角質(zhì)化。氣微，味苦。常用于治療療瘡癰腫、毒蛇咬傷、跌打傷痛、扭傷癖腫、各種關(guān)節(jié)炎、帶狀疤疹、流行性腮腺炎、靜脈炎、毛蟲皮炎、隱翅蟲皮炎、蜂蟄、枕部多發(fā)性疥腫等[2],因此在臨床上應(yīng)用廣泛。重樓總皂苷是重樓的有效活性成分，現(xiàn)代藥理及臨床研究表明，重樓總皂苷具有抗菌消炎、止血、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[3-4]。現(xiàn)在隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)、化學(xué)研究的不斷深入，重樓有效成分逐步被分離、鑒定并證實(shí)，現(xiàn)己從重樓中分離并鑒定了50多種化合物，主要有甾體皂普、植物甾醇、黃酮苷、蛻皮激素及多糖等,還含有19種氨基酸和30多種微量元素，以甾體皂苷為其主要成分，其中甾體皂苷44種，占總化合物的86%。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，重樓具有較好的抗腫瘤作用，從重樓中分離出來(lái)的皂苷類成分表明其具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、干擾細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤的作用[5]等。甾體皂苷作為重樓屬植物中最重要的成分，其中2015 版藥典已將甾體皂苷作為其質(zhì)量控制指標(biāo)，并規(guī)定滇重樓和七葉一枝花中重樓皂苷Ⅰ，Ⅱ，Ⅵ，Ⅶ的總含量不低于0.6%[6]。重樓皂苷的提取方法較多，近年來(lái)，文獻(xiàn)報(bào)道了幾種重樓總皂苷提取工藝研究，如微波法提取重樓總皂苷的工藝研究[7-8]。正交設(shè)計(jì)-超聲提取重樓總皂苷[9-10]等，其中經(jīng)典提取方法主要采用乙醇作為溶劑，采用加熱回流或超聲提取，亦有新方法如泡沫分離法、超高壓技術(shù)等，能在一定程度增加重樓皂苷的浸出率，以達(dá)到有效成分的充分利用，如何高效的提取重樓總皂苷使其廣泛應(yīng)用成為研究重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以重樓總皂苷的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken效應(yīng)面法對(duì)重樓總皂苷提取工藝進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化研究，為其進(jìn)一步研究及應(yīng)用提供理論依據(jù)。然而，如何高效的提取重樓總皂苷使其廣泛應(yīng)用成為研究重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)重樓總皂苷的提取率為研究對(duì)象，應(yīng)用采用Design Expert 8.05軟件對(duì)重樓總皂苷進(jìn)行提取工藝優(yōu)化研究，為其進(jìn)一步研究及應(yīng)用提供理論依據(jù)。

資料與方法

1 儀器與試藥 RE-5003旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；BSA323S電子天平；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵；安捷倫1200高效液相色譜系統(tǒng)。

重樓皂苷I對(duì)照品(批號(hào)：111591-200402，純度>98%)，重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌?批號(hào)：111590-200402，純度>98%)；乙腈為分析純。

2 方 法

2.1 色譜條件：采用Hypersil ODS C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色譜柱；以乙腈-水(40:60)為流動(dòng)相；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)采用210 nm；進(jìn)樣量：20 μl。

2.2 提取工藝：重樓中重樓總皂苷的提取采用乙醇回流法。將重樓的干燥的根莖粉碎后過80目篩備用，精密稱取5.0 g放入到乙醇中浸泡一段時(shí)間后進(jìn)行回流提取，提取物經(jīng)抽濾、減壓濃縮，即得重樓的總皂苷浸膏。準(zhǔn)確稱取5.0 g已粉碎重樓干燥根及根莖粉末進(jìn)行提取操作，參照“2.1”項(xiàng)下色譜方法及條件測(cè)定重樓總皂苷含量，根據(jù)公式計(jì)算重樓中重樓總皂苷的提取量。重樓總皂苷提取量(mg/g)= 總皂苷含量(mg)/原料重量(g)

2.3 Box-Behnken 響應(yīng)面法提取重樓總皂苷工藝優(yōu)化研究：在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取乙醇濃度為40%(低)、60%(中)、80%(高)；提取液的液料比為10∶1(低)、15∶1(中)、20∶1(高)；重樓總皂苷提取時(shí)間為1 h(低)、2.5 h(中)、4 h(高)，以重樓總皂苷提取量(Y, mg/g)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，應(yīng)用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)重樓中的重樓總皂苷進(jìn)行提取工藝優(yōu)化研究。

結(jié) 果

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)分析 采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)重樓中的重樓總皂苷進(jìn)行提取工藝優(yōu)化研究實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)表及結(jié)果，見表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表與效應(yīng)值

2 數(shù)據(jù)處理及模型擬合 采用“Design Expert 8.05”軟件，對(duì)各工藝參數(shù)下所得提取率進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)各提取工藝參數(shù)對(duì)提取率進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合，結(jié)果見表2。從表2可知，回歸方程中，X1(Pr=0.0481)、X2(Pr=0.0258)、X3(Pr=0.0361)、X12(Pr=0.0026)項(xiàng)顯著，說明乙醇濃度的增加，重樓總皂苷提取量先增加后降低；隨著液料比的增加，重樓總皂苷提取量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，重樓總皂苷提取量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。

表2 回歸方程中系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

3 提取工藝參數(shù)驗(yàn)證 以重樓總皂苷提取量最大值為目標(biāo)，最終優(yōu)化后所得重樓總皂苷提取工藝為：提取乙醇濃度為62.5%、液料比為16.5、提取時(shí)間為3.0 h，模型預(yù)測(cè)值重樓總皂苷的提取量為5.74 mg/g。應(yīng)用最終優(yōu)化所得的工藝參數(shù)對(duì)3批重樓藥材進(jìn)行提取，并測(cè)定重樓總皂苷含量。結(jié)果表明，3批重樓總皂苷的平均提取量為(5.89±0.74)mg/g(n=3)，所優(yōu)化模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的偏差為2.61%，結(jié)果表明優(yōu)化結(jié)果及預(yù)測(cè)模型良好。

討 論

星點(diǎn)設(shè)計(jì)作為一種藥學(xué)研究中常用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)建立的數(shù)學(xué)模型描繪效應(yīng)面，從其較優(yōu)區(qū)域可以直接讀取較佳工藝條件，適應(yīng)于具有連續(xù)特征變量因素水平的優(yōu)化[11-12]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是研究多因素多水平的又一種設(shè)計(jì)方法，它是根據(jù)正交性從全面試驗(yàn)中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行試驗(yàn)，這些有代表性的點(diǎn)具備了"均勻分散，齊整可比"的特點(diǎn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是分式析因設(shè)計(jì)的主要方法。是一種高效率、快速、經(jīng)濟(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。日本著名的統(tǒng)計(jì)學(xué)家田口玄一將正交試驗(yàn)選擇的水平組合列成表格，稱為正交表。與傳統(tǒng)正交工藝優(yōu)化相比，星點(diǎn)設(shè)計(jì)具有實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、實(shí)驗(yàn)精度高、預(yù)測(cè)性較好的優(yōu)勢(shì)，并且能夠靈敏地考察各個(gè)自變量之間的交互作用，進(jìn)行各自變量的最優(yōu)化，做出相應(yīng)的三維因變量曲面圖，并能從圖形分析尋求最優(yōu)實(shí)驗(yàn)考察因素，對(duì)自變量與因變量的關(guān)系進(jìn)行直觀的量化分析[13-14]。星點(diǎn)設(shè)計(jì)是國(guó)內(nèi)外常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化方法，其結(jié)果可以集數(shù)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體，利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過實(shí)驗(yàn)得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次方程來(lái)擬合因素和效應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)處方，解決多變量問題。與正交實(shí)驗(yàn)方法比較，可以評(píng)價(jià)指標(biāo)和因素間的非線性關(guān)系，使用方便，條件預(yù)測(cè)性較好。本實(shí)驗(yàn)通過采用Box-Behnken效應(yīng)面對(duì)重樓中重樓總皂苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，得到了最佳提取工藝參數(shù)：濃度乙醇為62.5%、液藥比例為16.5∶1、提取時(shí)間為3.0 h，經(jīng)3批工藝驗(yàn)證，本研究重樓總皂苷的實(shí)際提取量與預(yù)測(cè)提取量二者的相對(duì)誤差為2.61%，表明該篩選方法具有較高的可靠性。重樓皂苷極性較小，水溶性差，62.5%的醇較90%醇的穿透能力好，同時(shí)又具有一定的溶解性，因此可獲得較高的提取效率，同時(shí)提取過程中需要對(duì)其進(jìn)行粉碎處理，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)提示，重樓總皂苷的提取率與其粉碎程度具有一定的相關(guān)性，由于藥材經(jīng)粉碎后可以加速皂苷的溶出，但過高的粉碎度反而不利于醇對(duì)其潤(rùn)濕，從而降低其提取效率，最終選用重樓粉碎后過80目篩為粉碎規(guī)格。皂苷類成分作為重樓主要有效成分，其含量直接決定了提取工藝的科學(xué)性，本研究在采用高效液相色譜法測(cè)定各皂苷含量基礎(chǔ)上計(jì)算總皂苷含量，研究結(jié)果與以往文獻(xiàn)的提取率相比，本研究確定的提取工藝參數(shù)所獲得的重樓總皂苷提取率高于文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]。同時(shí)，確定采用的乙醇濃度有一定程度降低，在保證提取率基礎(chǔ)上可節(jié)約提取成本。因此，響應(yīng)面法優(yōu)化重樓總皂苷提取工藝，所得結(jié)果可較好的擬合重樓總皂苷的提取，所得重樓總皂苷提取工藝參數(shù)具有提取效率高的優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步開發(fā)和利用重樓資源及重樓相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供了理論及現(xiàn)實(shí)依據(jù)。

[1] 何明生，李 秀.重樓藥理作用的研究進(jìn)展[J].世界中醫(yī)藥，2012，7(6): 279-282.

[2] 楊遠(yuǎn)貴，張 霽，張金渝，等.重樓屬植物化學(xué)成分及藥理活性研究進(jìn)展[J]. 中草藥，2016，47(18): 3301-3323.

[3] 趙保勝，朱寅荻，馬 勇.中藥重樓研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(11): 267-270.

[4] 宋延平，楊 潔，王 偉，等.陜重樓提取物對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞bc1-2和Bax基因表達(dá)的影響[J].陜西中醫(yī)，2013，34(4): 502-503.

[5] 王躍虎，牛紅梅，張兆云，等.重樓屬植物的藥用價(jià)值及其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)[J].中國(guó)中藥雜志，2015，40(5): 833-839.

[6] 中國(guó)藥典.一部[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005.

[7] 喻祖文，劉穎新，李 輝，等.微波法提取重樓總皂苷的工藝研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2013, 24(4): 833-834.

[8] 羅泳林，劉勝利，黃鎖義.正交設(shè)計(jì)-超聲提取重樓總皂苷[J].實(shí)用藥物與臨床, 2010, 13(3): 185-187.

[9] 孫治國(guó)，張 琳，李凌軍，等.重樓總皂苷提取工藝研究[J].中藥材, 2007, 30(6): 727-729.

[10] 鞠建峰，朱宗敏，杜忠科.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化重樓皂苷類成分的提取工藝[J].中國(guó)藥房, 2015, 26(28): 3967-3969.

[11] 王宏麗，別海燕，司傳平，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化鹽酸氮斯汀溫敏型原位凝膠滴鼻劑處方[J].中國(guó)藥房, 2016, 27(1): 72-76.

[12] 屈云萍，蔡向杰，王 嬌，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化血塞通滴丸成型工藝及冷凝液指紋圖譜研究[J].中國(guó)藥房, 2016, 27(34): 5017-5020.

[13] 包明蘭，烏云嘎，巴根那，等.多指標(biāo)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化蒙藥泡囊草制膏、牛奶浸泡法炮制工藝[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志, 2017, 23(4): 547-550.

[14] 王彥多，劉春雨，呂世潔，等.正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮提取工藝[J].食品工業(yè)科技, 2017, 38(7): 687-690.

[15] 何秋敏，許彪，王衛(wèi)紅，等.滇重樓總皂苷對(duì)涎腺腺樣囊性癌ACC-83細(xì)胞增殖抑制及其機(jī)制的研究[J].華西口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 35(3): 357-360.

[16] 張 靜，丁 博，張 華.不同干燥方法對(duì)滇重樓總皂苷含量和抗氧化活性的影響[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志, 2016, 23(7): 803-806.

OptimizationoftheextractionofrhizomaparidistotalsaponinbyBox-Behnkeneffectsurfacemethod

Fan Shaomin，Shi Yajun，Zhang Xiaofei，et al.

Shaanxi University of Chinese Medicine(Xianyang 712046)

Objective：To optimize the extraction process of total saponins by Box-Behnken effect surface. Methods：The extraction rate of total saponins was determined by the regression method of ethanol concentration, extraction time and ratio of material to liquid, and the extraction rate of the tota saponin. And compared the predicted value with the observed value. Results：The optimum extraction parameters were as follows: the concentration of ethanol was 62.5%, the ratio of liquid to material was 16.5∶1, the extraction time was 3.0 h, the extraction parameters were obtained by three batches, and the extraction amount of total saponins The relative error between the predicted value and the regression model is 2.61%. Conclusions：The Box-Behnken effect surface method is used to optimize the extraction process of the total saponins in the re-building. The method is simple, the result is reliable and the prediction is good.

Rhizoma paridis Saponins Extraction Box-Behnken

*陜西省科技廳科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(2015SF203)

△通訊作者

重樓 皂苷類 提取法 Box-Behnken

R282

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.12.061

(收稿：2017-08-21)