HIF-1α基因多態性與CO中毒患者急性期中樞神經損傷的相關性研究

李晟 劉偉 池學鋒 謝雪蓓 陳潛妙 屠巍 吳賽華 張媛媛

HIF-1α基因多態性與CO中毒患者急性期中樞神經損傷的相關性研究

李晟 劉偉 池學鋒 謝雪蓓 陳潛妙 屠巍 吳賽華 張媛媛

目的探討低氧誘導因子-1α（HIF-1α）基因多態性與一氧化碳（CO）中毒患者急性期中樞神經損傷的相關性。方法選擇191例CO中毒患者，根據急性期頭顱MRI結果（是否發生中樞神經脫髓鞘損傷）分為正常組105例與異常組86例。采用DNA直接測序HIF-1α基因中rs3783752、rs4899056、rs1957757、rs10873142等4個單核苷酸多態性位點。結果MRI異常組與正常組rs4899056基因型分布頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中異常組TT基因型分布頻率較正常組低；兩組患者rs10873142基因型分布頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中異常組CC基因型分布頻率較正常組低。經連鎖不平衡分析發現正常組單倍體基因型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度連鎖（D'＞0.9，r2＞0.8），而異常組未發現連鎖不平衡。MRI異常組與正常組患者定義為單倍體基因型塊（rs3783752-rs4899056-rs1957757-rs10873142）的分布頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中CTTG單倍體基因型差異明顯（P＜0.05），TCCA存在差異趨勢（P=0.057）。結論HIF-1α基因多態性與CO中毒患者急性期中樞神經損傷具有相關性。

一氧化碳中毒低氧誘導因子-1α基因多態性中樞神經損傷

一氧化碳（CO）中毒會造成以中樞神經系統功能損害為主的多臟器病變，尤其是下丘腦、海馬、大腦皮質神經元對缺血、缺氧十分敏感。MRI對早期腦組織細胞水腫、脫髓鞘改變較為靈敏，可以早期判斷是否出現腦組織損傷。中樞神經損傷機制與許多因素有關，如中毒環境、治療方案及遺傳因素。哺乳動物體內的低氧誘導因子-1α（HIF-1α）是一種重要的氧調節因子，可以調節低氧相關因子表達。在缺血、缺氧過程中，HIF-1α的羥基化作用被擾亂，穩定性增強，發揮缺氧、缺血后的神經保護作用。故本文就HIF-1α基因多態性與CO中毒患者急性期中樞神經損傷的相關性作一探討，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象選擇2013年1月至2016年4月本院收治的191例CO中毒患者為研究對象。入選標準：（1）診斷標準參照國家頒布的《職業性急性CO中毒診斷標準及處理原則》；（2）既往無腦腫瘤及其他腦部合并癥；（3）既往無其他昏迷病史及其他臟器功能衰竭。排除標準：（1）合并各種病因的腦卒中、嚴重心肺腦疾病及惡性腫瘤的患者；（2）治療過程中發生CO中毒后遲發性腦病。根據急性期頭顱MRI結果（是否發生中樞神經脫髓鞘損傷）分成正常組105例與異常組86例，兩組患者年齡、性別以及碳氧血紅蛋白、血常規、血清C反應蛋白、各項血生化指標等比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經醫院倫理委員會批準，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法記錄所有患者一般特征（性別、年齡等）、中毒時間、家族情況。入院當天急診查碳氧血紅蛋白；第2天常規檢測肝腎功能、心功能、血常規，采集清晨空腹靜脈血以提取DNA；第2～7天行頭顱MRI檢查。

1.2.1 MRI檢查所有患者行頭顱MRI檢查，并由2位高級職稱的影像科醫師記錄并分析影像學資料。結果異常者在入院第8～10周復查MRI，2個月內若癥狀加重則立即復查。

1.2.2 HIF-1α基因SNP的選擇基因多態性的檢測5ml靜脈血EDTA抗凝，使用上海祥音生物科技有限公司提供試劑盒提取DNA。從Hap Map數據庫漢族人群群體中選擇SNPs（http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/；public datarelease 24/phaseⅡ；Ⅱ），基于Tagger程序選擇標簽SNPs，定義參數為r2≥0.80和少見等位基因頻率（MAF）≥5%。最終選取代表性的SNPs位點共4個（rs3783752、rs4899056、rs1957757、rs10873142）。使用Primer 5.0設計引物，見表1；采用直接測序方法讀取個體的基因型。1.4統計學處理應用SPSS 20.0統計軟件，采用χ2檢驗比較兩組患者HIF-1α基因4個多態性位點（rs3783752、rs4899056、rs1957757、rs10873142）基因型分布頻率的差異。HIF-1α基因各位點單核苷酸多態性連鎖不平衡分析和單倍體基因型分析采用SHEsis在線自動分析系統，取D′值和r2值作為連鎖不平衡指標。block根據D′＞0.9、r2＞0.8進行定義，再根據可信區間算法定義單倍體基因型塊，使用期望最大算法估算各單倍體基因型頻率，基因型頻率＜3%的被排除，不再進行統計學檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 HIF基因SNPs位點分型所用引物及測序引物

2 結果

2.1 頭顱MRI表現191例CO中毒患者急性期頭顱MRI檢查結果異常86例，主要表現為：（1）雙側皮質下白質和（或）側腦室周同白質損害；（2）雙側基底節（主要為雙側蒼白球）損害；（3）皮質下白質和（或）側腦室周圍白質與基底節同時受損害。MRI改變多為雙側對稱性，點狀、斑片狀或融合病灶，T1WI呈低信號，T2WI、T2WFLAIR、DWI呈高信號。入院第8～10周復查MRI，白質病灶范圍明顯縮小，異常信號強度減弱，未發現其他病灶。

2.2 HIF-1α基因4個多態性位點的基因型分布頻率HIF-1α基因多態性見圖1-4。MRI異常組與正常組rs4899056基因型分布頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中異常組TT基因型分布頻率較正常組低。兩組患者rs10873142基因型分布頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中異常組CC基因型分布頻率較正常組低，見表2。

2.3 連鎖不平衡分析經連鎖不平衡分析發現正常組單倍體基因型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度連鎖（D′＞0.9，r2＞0.8），見圖5a；異常組未發現連鎖不平衡，見圖5b。

2.4 單倍體分析根據SHEsis在線分析系統得出基因單倍體總數（患者例數×2-單倍體基因型頻率＜3%的患者例數），即MRI異常組、正常組分別為172、210例。MRI異常組與正常組患者定義為單倍體基因型塊（rs3783752-rs4899056-rs1957757-rs10873142）的分布頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中CTTG單倍體基因型差異明顯（P＜0.05），TCCA存在差異趨勢，見表3。

3 討論

圖1 HIF-1α（rs3783752）C/T基因多態性

圖2 HIF-1α（rs4899056）C/T基因多態性

圖3 HIF-1α（rs10873142）A/G基因多態性

圖4 HIF-1α（rs1957757）C/T基因多態性

圖5 連鎖不平衡分析結果（a：正常組；b：異常組）

表2 MRI異常組與正常組HIF-1α基因4個多態性位點的基因型分布頻率比較[例（%）]

表3 MRI異常組與正常組HIF-1α基因多態性單倍體分析結果[例（%）]

CO中毒性腦病通常有明確的CO中毒史，臨床表現主要有意識不清或意識模糊、頭暈頭痛、胡言亂語、行走困難、反應遲鈍及四肢抽搐等。急性中毒遲發性腦病是其常見的并發癥[1-2]，而高壓氧是其首選治療方法。CO中毒性腦病患者中樞脫髓鞘損傷的病理過程較為復雜，常規MRI、DWI能夠從病變范圍對腦損傷程度進行評估[3]。目前認為CO中毒性腦病是由于缺血、缺氧導致腦組織壞死和血－腦脊液屏障開放，從而激發嚴重免疫反應性髓鞘受損。本文對溫州地區191例患者的發病情況進行分析，CO中毒后急性期中樞神經系統脫髓鞘改變情況與性別、年齡、碳氧血紅蛋白、CO中毒嚴重程度等因素均無關；這提示不同個體在CO中毒后的解毒、免疫損傷、神經細胞凋亡及損傷后保護能力、細胞缺氧耐受能力均存在個體差異，推測個體遺傳因素可能起到關鍵作用。HIF-1α是一類介導低氧適應性反應的轉錄因子，能激活許多低氧反應基因表達，是低氧條件下維持體內氧穩態的關鍵性物質。研究表明在常氧條件下，HIF-1α通過降解結構域脯氨酸殘基羥基化，激活細胞內氧依賴的泛素，并通過蛋白水解酶降解通路使低氧反應相關性蛋白迅速降解[1，4]。在缺血、缺氧過程中，HIF-1α的羥基化作用被擾亂，穩定性增強，通過調控血管內皮生長因子、促紅細胞生成素、促凋亡蛋白半胱天冬酰胺酶3等靶基因表達，促進腦血流動力學的恢復、改善細胞能量代謝、抑制細胞凋亡，發揮缺氧、缺血后的神經保護作用。

HIF-1α亞基編碼基因位于人類染色體14q21-24，含15個外顯子和14個內含子。國內研究發現海拔高度不同引起的低氧環境差異可能對HIF1-α基因有選擇作用，且與多種疾病如糖尿病合并視網膜病變、腦梗死等相關[4-6]。根據中國漢族人群HIF-1α基因多態性特點，本研究最終選取4個有代表性的SNP位點（rs3783752、rs4899056、rs1957757、rs10873142），結果顯示在rs4899056位點，頭顱MRI異常組TT基因型分布頻率明顯低于正常組；在rs10873142位點，頭顱MRI異常組GG基因型分布頻率低于正常組。提示HIF-1α基因rs4899056、rs10873142兩個位點的變異與CO中毒后中樞神經脫髓鞘損傷有關，基因變異引起相關編碼蛋白的氨基酸序列改變，從而影響相關HIF蛋白功能表達的穩定性和功能。此外，本研究作連鎖不平衡分析發現，正常組單倍體基因型（rs3783752-rs4899056-rs1957757）高度連鎖，異常組未發現連鎖不平衡；作單倍體分析發現，單倍體基因型塊（rs3783752-rs4899056-rs1957757-rs10873142）CTTG單倍體基因型兩組差異明顯，即正常組高于異常組，而TCCA單倍體基因型存在差異趨勢。故筆者初步考慮溫州地區人群CTTG單倍體基因型對CO中毒后中樞神經脫髓鞘損傷有一系列保護機制。

綜上所述，HIF-1α基因多態性與CO中毒患者中樞神經損傷具有相關性。但本文尚存在一些不足：（1）難以獲得準確的昏迷時間、中毒時間等，僅以碳氧血紅蛋白含量為客觀依據；（2）缺少可能影響HIF-1基因下游相關因子的研究，系統闡述CO中毒后中樞神經脫髓鞘機制；（3）研究樣本量相對較小。建議今后作更大樣本的研究，以進一步驗證。

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[3] 郭軍,孟郊,韓彤.一氧化碳中毒與中毒后遲發性腦病的大腦磁共振成像比較[J].中華勞動衛生職業病雜志,2014,32(7):533-536.

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Association of HIF-1α gene polymorphism with central nervous injury in patients with acute carbon monoxide poisoning

LI Sheng,LIU Wei,CHI Xuefeng,et al.
Department of Neurology,the 118th Chinese People's Liberation Army Hospital,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the association between HIF-1α gene polymorphism and central nervous injury in patients with acute carbon monoxide poisoning.MethodsOne hundred and ninety one patients with carbon monoxide poisoning in acute stage were enrolled in the study,including 86 cases with central nervous injury according to MRI examination.The single nucleotide polymorphisms of HIF-1α gene rs3783752,rs4899056,rs1957757 and rs10873142 loci were detected with DNA direct sequencing.Results The frequencies of TT genotype in rs4899056 and GG genotype of rs10873142 in MRI abnormal group were significantly lower than those in MRI normal group(both P＜0.05).The linkage disequilibrium analysis found that haploid type(rs3783752-rs4899056-rs1957757)in normal group had high linkage(D'＞0.9,r2＞0.8),while not in abnormal group.There were significant differences in haploid type(rs3783752-rs4899056-rs1957757-rs10873142)between patients with abnormal MRI and normal MRI(P＜0.05),the significant difference was found in CTTG haploid type(P＜0.05),while the difference trend was found in TCCA haploid type(P=0.057).Conclusion HIF-1α gene polymorphism is related to central nerve damage in patients with carbon monoxide poisoning.

Carbon monoxide poisoning Hypoxia inducible factor-1aGene polymorphism Central nerve injury

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.23.2017-533

溫州市公益性科技計劃項目（Y20150168）

325000溫州，中國人民解放軍第一一八醫院神經內科（李晟、劉偉、池學鋒），檢驗科（謝雪蓓），影像科（陳潛妙、張媛媛），神經康復科（屠巍），急診科（吳賽華）

李晟，E-mail：lisheng_216@163.com

2017-03-13）

（本文編輯：陳丹）