蟬翼藤單體提取化合物對乙醇誘導小鼠肝臟氧化損傷保護作用研究

李 辰,黎 瑩,李 麗,楊成芳,鐘毓娟,吳 丹,石 琳,陳 莉,李勇文

·論著·

蟬翼藤單體提取化合物對乙醇誘導小鼠肝臟氧化損傷保護作用研究

李 辰,黎 瑩,李 麗,楊成芳,鐘毓娟,吳 丹,石 琳,陳 莉,李勇文*

目的探討蟬翼藤單體提取化合物——甲基阿魏酸對乙醇誘導小鼠肝臟氧化損傷及B淋巴細胞瘤2相關X蛋白(Bax)、B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)表達的影響,研究甲基阿魏酸的保護作用。方法2017年3—6月，選取SPF級雄性成年C57BL/6小鼠60只,采用隨機數字表法分為正常組、模型組和甲基阿魏酸低劑量組(5 mg/kg)、甲基阿魏酸中劑量組(10 mg/kg)、甲基阿魏酸高劑量組(20 mg/kg)，每組12只。除正常組以外,其余各組每天早上50%乙醇溶液按照0.1 ml/10 g體質量灌胃。每天下午,甲基阿魏酸給藥組分別給予相應劑量的甲基阿魏酸灌胃,連續4周。取肝組織蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察其病理改變。計算肝臟指數、脾臟指數，生化分析法測定血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)及肝組織過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平，反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和Western blotting法分別檢測肝組織中Bax、Bcl-2 mRNA及蛋白的表達。結果與正常組比較,模型組、甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝臟指數、脾臟指數增加，血清ALT、AST、TC、TG水平升高，肝組織CAT、GSH-Px、SOD水平降低，MDA水平升高，肝組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2升高(P<0.05)；與模型組比較,甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝臟指數、脾臟指數和血清ALT、AST、TC、TG及MDA水平降低，肝組織CAT、GSH-Px、SOD水平升高，肝組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2降低(P<0.05)。甲基阿魏酸高劑量組小鼠以上指標改善最明顯，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論甲基阿魏酸對乙醇誘導的小鼠肝損傷具有保護作用,可有效改善肝功能,減輕肝損傷程度,維持Bax、Bcl-2的平衡,其機制可能與抵抗肝臟氧化損傷以及抑制細胞凋亡有關。

蟬翼藤屬；甲基阿魏酸；乙醇；氧化性應激

本研究背景：

隨著經濟的發展和生活水平的提升，我國飲酒人群也日益增多，酒精性肝病(ALD)發病率逐年上升，對人類健康和社會發展構成了嚴重威脅。ALD的發病因素單一，即大量乙醇攝入所致，但其發病機制較為復雜，目前尚不十分清楚。近年來，自由基過量產生導致的氧化應激在ALD中的重要作用已成為共識。本研究從抵抗氧化應激角度入手研究蟬翼藤單體提取物——甲基阿魏酸對乙醇誘導的小鼠肝臟氧化損傷保護作用，為將其開發成一種新的解酒保肝藥物提供必要的理論依據。

乙醇濫用是世界范圍內致病率和死亡率居高不下的主要原因之一,肝臟是人體最大的代謝器官,也是乙醇損傷的主要靶器官之一。酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是一個涵蓋廣泛的醫學術語,范圍包括從簡單脂肪變性到脂肪性肝炎、進行性肝纖維化、肝硬化及肝癌等一系列表型[1]。這些酒精性疾病發生、發展機制尚未完全了解。目前研究發現,除乙醇過量攝入外,遺傳因素、營養條件、能量代謝、氧化應激、免疫異常等條件在ALD的發生、發展中發揮關鍵作用[2]。目前,ALD的治療措施主要包括戒酒、營養支持和給予皮質類固醇藥物,但效果不佳。由于長期過量乙醇攝入導致的ALD已經是一個全球性健康問題,中草藥由于可調控多個靶點及不良反應小等特點,在預防和治療ALD領域引起了廣泛關注[3]。甲基阿魏酸是從廣西特色中草藥蟬翼藤中提取的單體化合物[4],蟬翼藤具有抗炎、增強免疫功能、抗乙型肝炎病毒等活性[5]。本實驗采用乙醇誘導小鼠肝臟亞急性損傷模型,著眼于觀察甲基阿魏酸對乙醇攝入引起肝損傷的保護作用,為開發解酒保肝產品乃至治療ALD尋找思路,為進一步深入研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 甲基阿魏酸(美國Sigma公司)，無水乙醇(AR級,汕頭市西隴化工有限公司)，丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕，兔抗B淋巴細胞瘤2相關X蛋白(Bax)、B淋巴細胞瘤2(Bcl-2)、β-actin抗體、山羊抗兔二抗〔生工生物工程(上海)股份有限公司〕，DYY-6C型雙穩定時電泳儀(北京六一生物科技有限公司)，Model 680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)，Chemi Doc型凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)，752型紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)，TGL-16B型高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，5424R臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 實驗動物 2017年3—6月，SPF級雄性成年C57BL/6小鼠60只,體質量18～22 g,由桂林醫學院實驗動物中心提供〔實驗動物使用許可證號：SCXK(桂)2017-0050〕。小鼠飼養于桂林醫學院實驗動物中心內,房間室溫18～24 ℃,濕度60%,12 h照明,12 h黑暗,清潔籠子隔日1次。使用標準維持飼料和蒸餾水,動物自由飲水和進食。

1.3 動物分組和造模方法 將60只小鼠適應性飼養1周后,稱體質量。采用隨機數字表法分為正常組、模型組和甲基阿魏酸低劑量組(5 mg/kg)、甲基阿魏酸中劑量組(10 mg/kg)、甲基阿魏酸高劑量組(20 mg/kg)，每組12只。除正常組以外,其他各組先給予30%乙醇溶液,按照0.1 ml/10 g體質量適應性灌胃,正常組給予相同體積的0.9%氯化鈉溶液灌胃，連續3 d。第4天開始,除正常組以外,其余各組每天早上50%乙醇溶液按照0.1 ml/10 g體質量灌胃。每天下午,甲基阿魏酸給藥組分別給予相應劑量的甲基阿魏酸灌胃,連續4周。實驗期間各組小鼠均給予相同標準的飼料和蒸餾水,并觀察記錄其一般狀況、體質量變化等情況。

1.4 樣本收集 末次給藥后,禁食不禁水12 h。脫臼法處死前稱體質量,取肝臟和脾臟,在濾紙上輕輕拭干后立即稱質量,記錄肝臟質量和脾臟質量。各組均取肝葉中部用甲醛溶液固定,蘇木素-伊紅(HE)染色,觀察其病理變化。摘眼球采血1～2 ml待檢測。

1.5 肝臟指數、脾臟指數及病理變化的檢測 肝臟指數(%)=肝臟質量(g)/體質量(g)×100%,脾臟指數(%)=脾臟質量(g)/體質量(g)×100%。電鏡下觀察各組切片HE染色情況,比較其差異情況。

1.6 生化分析法檢測小鼠血清ALT、AST、TC、TG及肝組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA水平 將全血靜置2 h后,以4 000 r/min離心10 min(離心半徑4.8 cm),分離血清。按照試劑盒方法測定血清中ALT、AST、TC和TG水平；取小鼠肝臟相同部位組織制備肝組織勻漿,按照試劑盒方法測定小鼠肝組織中CAT、GSH-Px、SOD及MDA水平。

1.7 反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)法檢測肝組織Bax、Bcl-2 mRNA的表達 取各組小鼠肝組織約100 mg,按照總RNA提取試劑盒說明書,采用Trizol法抽提肝組織總RNA。用核酸蛋白測定儀測定RNA含量及純度,OD260/OD280在1.8～2.0。依據試劑盒說明書,將總RNA反轉錄成cDNA。查找基因序列并設計引物,以β-actin為內參。Bax引物序列:上游引物:5′-AGACAGGGGCCTTTTTGCTAC-3′，下游引物:5′-AATTCGCCGGAGACACTCG-3′；Bcl-2引物序列：上游引物:5′-TCAGAGCGAGAAGGTAGGGA-3′，下游引物:5′-CTGTGGGGTAACAAGAAGGTC-3′；β-actin引物序列：上游引物:5′-GGACTCCTATGTGGGTGACGA-3′，下游引物:5′-ACGGTTGGCCTTAGGGTTCA-3′。反應條件:94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s,45～68 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環；最終產物72 ℃,10 min。反應結束后分別取10 μl產物及5 μl DNA marker進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。凝膠成像系統檢測灰度值,Image Lab軟件進行分析。

1.8 Western blotting法檢測肝組織Bax、Bcl-2的表達 取各組小鼠肝組織約100 mg,剪碎,置于EP管中。加入配好的1 ml RIPA蛋白裂解液〔含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)〕，用玻璃勻質器勻漿,充分裂解后,冰上靜置5 min。冷凍離心，以13 000 r/min離心10 min(離心半徑5.6 cm)。取上清液,采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白含量。10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳,將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,用Bax(1∶500)、Bcl-2(1∶500)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育,4 ℃搖床過夜,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶10 000),常溫孵育1 h,ECL化學發光法顯影,并測定灰度值。

2 結果

2.1 各組小鼠的一般狀況及肝臟指數、脾臟指數測定結果 正常組小鼠狀況良好、反應敏銳,無死亡。模型組小鼠經乙醇灌胃先產生興奮后產生醉意、反應遲鈍,部分小鼠腹瀉,死亡1只。甲基阿魏酸給藥組小鼠精神狀態比模型組有所改善,無腹瀉，無死亡。

5組小鼠肝臟指數、脾臟指數比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中，與正常組比較,模型組、甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝臟指數、脾臟指數增加，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較,甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝臟指數、脾臟指數降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織肝臟指數、脾臟指數兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表1)。

Table1 Comparison of values of liver index and splenic index among 5 groups of mice with ethanol-induced oxidative damage of liver

組別只數肝臟指數脾臟指數正常組123.36±0.350.28±0.04模型組117.85±0.26a0.71±0.03a甲基阿魏酸低劑量組126.47±0.15ab0.61±0.03ab甲基阿魏酸中劑量組125.27±0.21abc0.59±0.05abc甲基阿魏酸高劑量組124.33±0.15abcd0.49±0.05abcdF值45.62341.742P值<0.001<0.001

注：與正常組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與甲基阿魏酸低劑量組比較,cP<0.05；與甲基阿魏酸中劑量組比較,dP<0.05

2.2 5組小鼠肝臟病理學觀察 HE染色結果顯示,正常組小鼠肝臟匯管區及肝小葉架構清晰完整,肝索整齊排列,肝細胞無炎癥壞死。模型組小鼠肝臟匯管區周圍肝細胞腫脹且肝索混亂排列,肝小葉附近肝細胞呈氣球樣病變,部分肝實質細胞壞死。甲基阿魏酸給藥組小鼠肝臟損傷程度有所改善,細胞壞死情況減輕(見圖1)。

2.3 5組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平比較 5組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中，與正常組比較,模型組、甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較,甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠血清ALT、AST、TC、TG水平兩兩比較(除甲基阿魏酸低劑量組與甲基阿魏酸中劑量組小鼠血清TC水平)，差異均有統計學意義(P<0.05，見表2)。

2.4 5組小鼠肝組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA水平比較 5組小鼠肝組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中，與正常組比較,模型組、甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織CAT、GSH-Px、SOD水平降低，MDA水平升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較,甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織CAT、GSH-Px、SOD水平升高，MDA水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織CAT、GSH-Px、SOD、MDA水平兩兩比較(除甲基阿魏酸低劑量組與甲基阿魏酸中劑量組小鼠肝組織GSH-Px、MDA水平)，差異均有統計學意義(P<0.05，見表3)。

2.5 5組小鼠肝組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2比較 5組小鼠肝組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；其中，與正常組比較,模型組、甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較,甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織Bax mRNA/Bcl-2 mRNA、Bax/Bcl-2兩兩比較，差異均有統計學意義(P<0.05，見表4、圖2、3)。

圖1 甲基阿魏酸對肝損傷小鼠肝組織形態學的影響(HE染色,×200)

組別只數ALT(U/L)AST(U/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)正常組1235±546±52.94±0.331.53±0.18模型組11251±7a234±6a4.63±0.29a3.22±0.55a甲基阿魏酸低劑量組12151±6ab132±5ab3.54±0.31ab2.51±0.18ab甲基阿魏酸中劑量組12131±5abc123±5abc3.50±0.46ab2.20±0.36abc甲基阿魏酸高劑量組12100±7abcd103±7abcd3.21±0.34abcd1.95±0.37abcdF值523.565492.17310.4339.543P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：ALT=丙氨酸氨基轉移酶，AST=天冬氨酸氨基轉移酶，TC=總膽固醇，TG=三酰甘油；與正常組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與甲基阿魏酸低劑量組比較,cP<0.05；與甲基阿魏酸中劑量組比較,dP<0.05

Table3 Comparison of values of CAT,GSH-Px,SOD and MDA in the liver tissues among 5 groups of mice with ethanol-induced oxidative damage of liver

組別只數CAT(kU/gprotein)GSH-Px(kU/gprotein)SOD(kU/gprotein)MDA(nmol/mgprotein)正常組12249.48±7.4482.29±4.88115.10±7.992.08±0.72模型組11160.89±6.00a49.12±4.43a59.96±3.23a6.40±0.60a甲基阿魏酸低劑量組12201.65±6.12ab61.04±4.14ab69.89±3.71ab4.98±0.23ab甲基阿魏酸中劑量組12211.19±4.52abc64.92±5.22ab75.22±3.83abc4.47±0.55ab甲基阿魏酸高劑量組12228.96±6.32abcd71.04±4.63abcd84.42±3.46abcd3.39±0.52abcdF值87.09620.62257.97826.570P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：CAT=過氧化氫酶，GSH-Px=谷胱甘肽過氧化物酶，SOD=超氧化物歧化酶，MDA=丙二醛；與正常組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與甲基阿魏酸低劑量組比較,cP<0.05；與甲基阿魏酸中劑量組比較,dP<0.05

Table4 Comparison of expressions of Bax/Bcl-2 mRNA and protein among 5 groups of mice with ethanol-induced oxidative damage of liver

組別只數BaxmRNA/Bcl-2mRNABax/Bcl-2正常組120.34±0.110.59±0.04模型組113.03±0.22a2.56±0.21a甲基阿魏酸低劑量組122.09±0.24ab1.35±0.33ab甲基阿魏酸中劑量組120.83±0.16abc0.91±0.24abc甲基阿魏酸高劑量組120.64±0.14abcd0.75±0.22abcdF值118.42336.711P值<0.001<0.001

注：Bax=B淋巴細胞瘤2相關X蛋白，Bcl-2=B淋巴細胞瘤2；與正常組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05；與甲基阿魏酸低劑量組比較,cP<0.05；與甲基阿魏酸中劑量組比較,dP<0.05

注：Bax=B淋巴細胞瘤2相關X蛋白，Bcl-2=B淋巴細胞瘤2

圖2 甲基阿魏酸對肝損傷小鼠肝組織Bax、Bcl-2 mRNA表達的影響

Figure2 Effects of methyl ferulic acid on the expressions of Bax,Bcl-2 mRNA in liver tissues in 5 groups of mice with ethanol-induced oxidative damage of liver

圖3 甲基阿魏酸對肝損傷小鼠肝組織Bax、Bcl-2表達的影響

Figure3 Effects of methyl ferulic acid on the expressions of Bax,Bcl-2 protein in liver tissues in 5 groups of mice with ethanol-induced oxidative damage of liver

3 討論

ALD是由于乙醇在體內代謝異常導致的肝臟代謝紊亂性疾病,乙醇可以作為毒物直接作用于肝臟導致損傷。本研究采用乙醇灌胃法建立肝損傷模型,不僅符合人類飲酒習慣,而且死亡率低于乙醇腹腔注射法。大量攝入的乙醇經乙醇脫氫酶和乙醛脫氫酶氧化后,最終催化產物是乙醛,乙醛對機體有直接損傷作用。乙醇誘導微粒體乙醇氧化系統,增加了肝臟能量的消耗,造成肝內能量耗竭,引起肝細胞損傷[6]。

乙醇對機體造成的損傷作用涉及多種病理機制,越來越多的研究認為ALD作為復雜的病理過程,涉及氧化應激、炎癥和過多脂肪酸合成[7]。氧化應激是ALD發生、發展的重要機制之一,其可被定義為體內氧自由基穩態水平的量度生物系統。長期乙醇攝入會消耗抗氧化防御系統的一些重要酶系,比如CAT、GSH-Px、SOD,還會促進活性氧(ROS)和活性氮物質(RNS)的形成,這些物質會損傷DNA、蛋白質和脂質。乙醇及其代謝物使氧化應激處于持續狀態,這是ALD的重要生化表現之一[8]。本研究結果顯示,甲基阿魏酸可顯著提高CAT、GSH-Px及SOD水平,維持體內氧化還原平衡狀態。MDA是脂質過氧化的終產物,有細胞毒性,是客觀反映機體自由基水平的可靠指標[9],本研究結果顯示,甲基阿魏酸可顯著降低MDA水平,可抵抗組織脂質過氧化損傷。

乙醇可導致脂肪代謝紊亂,從而損害肝臟[10]。脂肪代謝紊亂是ALD最早出現的病理狀況。本研究發現,模型組大鼠肝臟指數增大，血清TC、TG水平升高,表明肝臟中脂肪集聚。而給予甲基阿魏酸灌胃能顯著抑制肝臟指數增大，降低血清TC、TG水平，表明甲基阿魏酸能夠有效調節肝臟中脂肪代謝紊亂。

前期研究發現甲基阿魏酸對四氯化碳(CCl4)誘導的小鼠急性肝損傷具有保護作用[11]。本研究發現,甲基阿魏酸可降低血清中ALT、AST水平,具有保肝作用。與模型組相比,甲基阿魏酸還可降低脾臟指數,具有抗炎免疫作用。

Bcl-2是細胞凋亡研究中引人注目的關鍵基因之一，Bax是Bcl-2基因家族中細胞凋亡促進基因,Bax過度表達可拮抗Bcl-2的保護效應而導致細胞凋亡[12]。Bcl-2主要位于細胞核、線粒體以及內質網膜中,但以Bax為代表的促進凋亡的家族主要位于細胞質中,Bax含有BH1、BH2和BH3結構域,并可啟動凋亡信號[13]。作為抑制細胞凋亡蛋白家族的兩種典型蛋白,Bcl-2和Bax在調節線粒體的膜透性方面起著關鍵作用。當凋亡信號刺激時,Bax轉運到線粒體,使線粒體膜電位降低,直接或間接增強線粒體膜的通透性。Bcl-2可以穩定線粒體膜的屏障功能,并抑制細胞凋亡誘導因子向細胞核轉移[14]。本研究結果顯示,與模型組比較,甲基阿魏酸低、中、高劑量組小鼠肝組織Bax/Bcl-2 mRNA及蛋白降低，甲基阿魏酸可上調Bcl-2表達,并抑制Bax表達，具有抑制細胞凋亡的作用。

綜上所述,在本實驗劑量范圍內，甲基阿魏酸對乙醇誘導的小鼠亞急性肝損傷具有保護作用,且藥效與劑量呈梯度依賴關系。這種保護作用機制可能與抵抗肝臟氧化損傷以及抑制細胞凋亡有關。本研究不足之處是沒有對甲基阿魏酸抗ALD靶點蛋白進行研究。鑒于人們長期酗酒的習慣[15],今后將在乙醇誘導的慢性肝損傷模型上進一步驗證甲基阿魏酸的解酒保肝作用。

作者貢獻:李辰、李麗進行文章的構思與設計，對文章整體負責，監督管理；李辰、黎瑩、吳丹、石琳、陳莉進行研究的實施與可行性分析；李辰進行數據收集，統計學處理，撰寫論文；李辰、楊成芳進行數據整理；李辰、鐘毓娟進行結果的分析與解釋；李勇文負責文章的質量控制及審校。

本文無利益沖突。

[1]STICKEL F,MORENO C,HAMPE J,et al.The genetics of alcohol dependence and alcohol-related liver disease[J].J Hepatol，2017,66(1):195-211.DOI:10.1016/j.jhep.2016.08.011.

[2]MAGDALENO F,BLAJSZCZAK C C,NIETO N.Key events participating in the pathogenesis of alcoholic liver disease[J].Biomolecules,2017,7(1)：E9.DOI:10.3390/biom7010009.

[3]DING R B,TIAN K,HUANG L L,et al.Herbal medicines for the prevention of alcoholic liver disease:a review[J].J Ethnopharmacol,2012,144(3):457-465.DOI:10.1016/j.jep.2012.09.044.

[4]秦慶芳,楊新平,李勇軍,等.蟬翼藤莖皮中甲基阿魏酸成分的提取分離鑒定[J].亞太傳統醫藥,2014,10(15):20-21.

QIN Q F,YANG X P,LI Y J,et al.Isolation and identification of extracting methyl ferulic acid in cane peel onion[J].Asia-Pacific Traditional Medicine,2014,10(15):20-21.

[5]楊桂君,李麗,李勇文,等.蟬翼藤有機酸提取物抑制鴨體內乙肝病毒復制及保肝作用[J].中國新藥雜志,2014,23(21):2552-2555.

YANG G J,LI L,LI Y W,et al.Organic extracts from the securidaca inhibit duck hepatitis B virus replication in vivo and the hepatoprotective effect[J].Chinese Journal of New Drugs,2014,23(21):2552-2555.

[6]魏偉,吳希美,李元建.藥理實驗方法學[M].4版.北京：人民衛生出版社,2010.

WEI W,WU X M,LI Y J.Experimental methodology of pharmacology[M].4th ed.Beijing:People ′s Health Publishing House,2010.

[7]STICKEL F,DATZ C,HAMPE J,et al.Pathophysiology and management of alcoholic liver disease:update 2016[J].Gut Liver,2017,11(2):173-188.DOI:10.5009/gnl16477.

[8]DISEASE A L,SPECIES R O N,SPECIES R O N,et al.Oxidative stress and chronic alcohol liver disease:the current perspectives[J].Indo American Journal of Pharmaceutical Research,2014,4(3):1428-1446.

[9]WANG H,ZHANG Y,BAI R,et al.Baicalin attenuates alcoholic liver injury through modulation of hepatic oxidative stress,inflammation and sonic hedgehog pathway in rats[J].Cell Physiol Biochem,2016,39(3):1129-1140.DOI:10.1159/000447820.

[10]ARAUJO JUNIOR R F,GARCIA V B,LEITO R F,et al.Carvedilol improves inflammatory response,oxidative stress and fibrosis in the alcohol-induced liver injury in rats by regulating kuppfer cells and hepatic stellate cells[J].PLoS One,2016,11(2):e0148868.DOI:10.1371/journal.pone.0148868.

[11]龐文簫,李勇軍,李勇文,等.蟬翼藤中甲基阿魏酸對CCl4致急性肝損傷小鼠模型的影響[J].中國藥房,2015,26(1):21-24.DOI:10.6039/j.issn.1001-0408.2015.01.07.

PANG W X,LI Y J,LI Y W,et al.The influence of methyl ferulic acid of securidaca inappendiculata on acute liver injury induced by CCl4 in mice[J].China Pharmacy,2015,26(1):21-24.DOI:10.6039/j.issn.1001-0408.2015.01.07.

[12]ZHOU S,WANG Y,ZHU J J.Simultaneous detection of tumor cell apoptosis regulators Bcl-2 and Bax through a dual-signal-marked electrochemical immunosensor[J].ACS Appl Mater Interfaces,2016,8(12):7674-7682.DOI:10.1021/acsami.6b01010.

[13]ZENG J,CHEN S,LI N,et al.Sasanquasaponin from Camellia oleifera Abel.induces apoptosis via Bcl-2,Bax and caspase-3 activation in HepG2 cells[J].Mol Med Rep,2015,12(2):1997-2002.DOI:10.3892/mmr.2015.3666.

[14]WANG Q,ZHANG L,YUAN X,et al.The relationship between the Bcl-2/Bax proteins and the mitochondria-mediated apoptosis pathway in the differentiation of adipose-derived stromal cells into neurons[J].PLoS One,2016,11(10):e0163327.DOI:10.1371/journal.pone.0163327.

[15]XIAO J,WANG J,XING F,et al.Zeaxanthin dipalmitate therapeutically improves hepatic functions in an alcoholic fatty liver disease model through modulating MAPK pathway[J].PLoS One,2014,9(4):e95214.DOI:10.1371/journal.pone.0095214.

EffectsofMonomericCompoundExtractedfromSecuridacaontheProtectionofLiverAgainstOxidativeDamageInducedbyEthanolinMice

LIChen,LIYing,LILi,YANGCheng-fang,ZHONGYu-juan,WUDan,SHILin,CHENLi,LIYong-wen*

GuilinMedicalUniversity,Guilin541000,China

*Correspondingauthor:LIYong-wen,Professor,Mainlyengagedinanti-inflammatoryimmunopharmacologyresearch；

E-mail：liyongwen99@163.com

ObjectiveTo investigate the protective effect of methyl ferulic acid,a monomeric compound extracted from securidaca based on analyzing its effect on the oxidative damage in liver and the expressions of Bax and Bcl-2 in mice induced by ethanol.MethodsFrom March to June 2017,60 SPF grade male C57BL/6 mice were selected and randomized into normal group,model group and low-dose(5 mg/kg) methyl ferulic acid group,middle-dose (10 mg/kg) methyl ferulic acid group,high-dose(20 mg/kg) methyl ferulic acid group,12 in each group.Except the normal group,the other groups were given intragastric administration of 50% ethanol solution in a volume of 0.1 ml/10 g body weight every morning,the low-dose,middle-dose and high-dose methyl ferulic acid groups additionally

intragastric administration of methyl ferulic acid solution in a volume of 5 mg/kg,10 mg/kg,20 mg/kg body weight,respectively every evening,for 4 weeks.Hepatic tissues of the mice were taken out and stained with HE,and their pathological changes were observed.The liver index and splenic index were calculated.Biochemical analyses of serum ALT,AST,TC,TG,catalase (CAT),glutathione peroxidase (GSH-Px),superoxide dismutase (SOD),malondialdehyde(MDA) levels were performed.The expressions of Bax,Bcl-2 mRNA in liver tissues were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR).The expressions of Bax and Bcl-2 in liver tissues were detected by western blotting.ResultsIncreased values of liver index,splenic index,ALT,AST,TC,TG and MDA,elevated expressions of Bax/Bcl-2 mRNA and Bax/Bcl-2,and decreased values of CAT,GSH-Px,SOD were found in the model group,low-dose,middle-dose and high-dose methyl ferulic acid groups rather than the normal group(P<0.05).The model group had higher values of liver index,splenic index,ALT,AST,TC,TG,MDA,increased expressions of Bax/Bcl-2 mRNA and Bax/Bcl-2 but lower values of CAT,GSH-Px and SOD than the low-dose,middle-dose and high-dose methyl ferulic acid groups(P<0.05).The values of all the above markers differed significantly between the low-dose,middle-dose and high-dose methyl ferulic acid groups(P<0.05).ConclusionMethyl ferulic acid can protect the liver against oxidative damage induced by ethanol in mice manifested as improving liver function and alleviating the degree of hepatic injury,and stable the expressions of Bax and Bcl-2,which may be related to its resistance to oxidative damage of liver and inhibition of cell apoptosis.

Securidaca；Methyl ferulic acid；Ethanol；Oxidative stress

R 965

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.00.098

李辰,黎瑩,李麗,等.蟬翼藤單體提取化合物對乙醇誘導小鼠肝臟氧化損傷保護作用研究[J].中國全科醫學，2017，20(35)：4391-4396.[www.chinagp.net]

LI C,LI Y,LI L,et al.Effects of monomeric compound extracted from securidaca on the protection of liver against oxidative damage induced by ethanol in mice[J].Chinese General Practice，2017，20(35)：4391-4396.

國家自然科學基金資助項目(81360497)；廣西高等學校優秀中青年骨干教師培養工程項目；2016年自治區級大學生創新創業訓練計劃項目(201610601046)

541000廣西桂林市，桂林醫學院

*通信作者：李勇文，教授,主要研究方向：抗炎免疫藥理學；E-mail：liyongwen99@163.com

2017-07-18；

2017-09-07)

陳素芳)