野生番茄LA2157中熱穩定抗根結線蟲基因Mi-9候選基因的分離與過表達載體構建

王銀磊 陳偉男 趙麗萍 周 蓉 宋劉霞 余文貴 趙統敏*

（1江蘇省農業科學院蔬菜研究所，江蘇南京 210014；2江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京 210014；3揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇揚州 225009）

野生番茄LA2157中熱穩定抗根結線蟲基因Mi-9候選基因的分離與過表達載體構建

王銀磊1，2陳偉男3趙麗萍1，2周 蓉1，2宋劉霞1，2余文貴1，2趙統敏1，2*

（1江蘇省農業科學院蔬菜研究所，江蘇南京 210014；2江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京 210014；3揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇揚州 225009）

根結線蟲是番茄上的重要土傳病害，選育抗根結線蟲品種是最有效的防治方法，但是目前轉育到栽培番茄中的抗根結線蟲基因Mi-1在土溫高于28 ℃時就喪失了抗性。本試驗利用熱穩定抗根結線蟲野生番茄材料LA2157，根據Mi-1基因的序列信息，對其中熱穩定抗根結線蟲Mi-9基因進行同源克隆，在LA2157中共獲得2個候選基因片段；通過In-Fusion克隆技術，將候選基因與過表達載體pBI121進行連接，經電泳檢測和測序分析，最終構建Mi-9候選基因的過表達重組載體。

番茄；根結線蟲；Mi-9基因；同源克隆；過表達載體構建

番茄（Solanum lycopersicum L.）是我國主要蔬菜種類之一，根結線蟲（Meloidogyne spp.）是番茄上重要的土傳病害（劉維志，2000），對番茄生產造成嚴重的影響（趙統敏 等，2012）。在番茄育種中，選育抗根結線蟲品種已經成為重要的育種目標之一（Filho & Stevens，1980）。

根結線蟲屬包括90多個種，其中最為常見、對植物危害嚴重的主要是南方根結線蟲（M.incognita）、花生根結線蟲（M. arenaria）、北方根結線蟲（M. hapla）和爪哇根結線蟲（M. javanica）4種。在北方日光溫室，以南方根結線蟲分布最廣、為害最重（Sasser，1980；趙統敏 等，2012）。感病番茄植株從苗期到成株期均可被根結線蟲侵染。根結線蟲從側根根尖侵入、寄生，形成根結，感病初期植株的表型癥狀并不明顯，隨著根系吸水能力的下降，在晴天中午氣溫較高時感病植株會出現類似缺水的萎蔫現象，氣溫下降時又恢復正常，但隨著線蟲群體的擴大，根結不斷著生和變大，葉片衰老加快，植株生長勢減弱，并通常伴隨其他病害的發生，導致產量下降，嚴重的甚至整株枯萎死亡。此外，根結線蟲侵染時造成的傷口，也成為其他土傳病害的侵入通道，加重植株病害的發生（Dorhout et al.，1993）。

防治根結線蟲的方法主要有物理防治、化學防治和生物防治。夏季休棚期，通過深翻耕作層土壤結合高溫悶棚，施用殺線劑、生物菌劑可以在一定程度上降低蟲口數量，但是不能從根本上解決根結線蟲對番茄植株的為害，處理不當還會對人體和環境造成影響（Aboul-Eid et al.，2006）。20世紀40年代，隨著抗根結線蟲基因從野生番茄轉育到栽培番茄中，利用抗病基因已成為防治根結線蟲的重要方法之一。第一個被發現的抗根結線蟲基因Mi-1，是通過遠緣雜交胚挽救的手段從野生番茄轉育到栽培番茄中的（Smith，1944）。時至今日，該基因仍然在番茄抗根結線蟲中發揮著巨大的作用。Mi-1基因被定位在番茄6號染色體的短臂端，在定位區間內多個同源性極高的片段成簇出現，序列分析證實該基因家族在這一區間內存在7個同源片段。通過對這些基因的分析和功能驗證，明確只有Mi-1.2（即Mi-1）對根結線蟲具有抗性，其他基因不具有抗根結線蟲的能力（Milligan et al.，1998）。但Mi-1基因在土壤溫度高于28 ℃時，對根結線蟲的抗性就會喪失，在我國保護地栽培區域，番茄生長季中很長的時間都會存在Mi-1基因抗性喪失的情況（Tzortzakakis et al.，2005）。隨著番茄野生資源中抗病基因的挖掘，已經明確Mi-2、Mi-3、Mi-4、Mi-5和Mi-9基因在高溫條件下仍然具有對根結線蟲穩定的抗性（Cap et al.，1993；Veremis &Roberts，1996；Yaghoobi et al.，2005；Jablonska et al.，2007）。目前這些熱穩定抗根結線蟲基因均未被應用到栽培番茄中，加強對這些基因的利用，可以有效地解決Mi-1基因在生產中遇到的問題。

Mi-9基因是定位于野生番茄材料LA2157中的熱穩定抗根結線蟲基因，以Mi-1基因的部分序列構建TRV病毒誘導的沉默載體，可以將LA2157對根結線蟲的抗性沉默，證明Mi-1與Mi-9基因具有同源性（Jablonska et al.，2007；Wang et al.，2013）。本試驗采用同源克隆的方法對野生番茄LA2157中熱穩定抗根結線蟲基因Mi-9的候選基因進行分離，并構建過表達載體，為闡明Mi-9基因的抗病機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015年在江蘇省農業科學院蔬菜研究所進行。供試材料為熱穩定抗根結線蟲野生番茄LA2157，含有熱穩定抗性基因Mi-9；該材料從美國加州大學番茄種質資源中心引進。試驗用根結線蟲為南方根結線蟲，利用感病番茄moneymaker進行繁殖，之后挑取卵塊進行孵化，將收集得到的二齡幼蟲用于接種試驗（Ammiraju et al.，2003）。

試驗用亞克隆載體為北京全式金生物技術有限公司的T3載體，構建重組載體所用骨架載體為江蘇省農業科學院蔬菜研究所茄果類實驗室保存的pBI121載體；大腸桿菌（Escherichia coli）菌株為Takara公司的DH5α和JM109。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種 2015年10月，采用50孔育苗穴盤在人工氣候室內播種LA2157，苗齡40 d時定植于直徑10 cm的營養缽，置于32 ℃恒溫培養箱中；7 d后隨機選取5株番茄幼苗接種南方根結線蟲二齡幼蟲，每株接種3 000條；接種30 d后，將5株植株的根系在32 ℃溫水中洗凈，用吸水紙吸干后包于錫箔紙中，液氮保存（Wang et al.，2013）。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 采用天根生化科技有限公司的RNA提取試劑盒對番茄根系樣品進行RNA提取；然后利用TAKARA公司的反轉錄試劑盒進行cDNA的制備。

1.2.3 同源基因分離和相關引物設計 由于Mi-1與Mi-9基因具有同源性，在進行Mi-9基因的分離時，可以根據已知Mi-1的全基因組序列設計全長擴增引物，以含有Mi-9基因番茄材料LA2157的cDNA為模板，進行序列擴增。對擴增后的序列進行功能驗證，可以最終獲得Mi-9基因的全長序列信息。根據Mi-1基因的序列信息（序列登錄號AF039682.1），利用Primer 5.0軟件進行全長擴增引物的設計；同時，根據過表達載體pBI121序列信息，設計用于In-Fusion重組載體構建的引物和重組載體檢測的引物（表1）。

1.2.4 In-Fusion重組載體構建 將全長引物Milong-up和Mi-long-low擴增后片段與T3載體進行連接，以此重組載體為模板，采用CTC0414-1 NF和CTC0414-1 NR進行擴增，利用Takara膠回收試劑盒對片段進行回收。將pBI121載體進行雙酶切，所用內切酶為BamHⅠ和SmaⅠ。雙酶切體系為：載體10 μL，buffer 10×T 1 μL，BamHⅠ和SamⅠ各1 μL，H2O 5 μL，BSA 2 μL。酶切4 h后，回收線性化的載體片段。將外源片段和線性化載體的膠回收產物各1 μL、5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2 μL混樣，50 ℃連接15 min，將連接產物1 μL轉化至JM109感受態中，涂板培養，37 ℃過夜（陳菲帆 等，2015）。

1.2.5 重組載體檢測 為了檢測重組載體是否為陽性，在載體和基因的連接部分兩側分別設計正向引物和反向引物，擴增結果為目的片段大小時，可以確定載體為重組載體。利用Primer 5.0軟件設計重組載體的檢測引物nemjz-F和nemjz-R，該引物擴增片段大小為988 bp。PCR反應體系為：單克隆提取質粒DNA 1 μL，DNA聚合酶擴增MIX試劑5 μL，上下游引物各0.1 μL，H2O 4.8 μL。通過對擴增片段進行測序和分析，判斷是否為重組載體。

2 結果與分析

2.1 Mi-9候選基因的分離

以野生番茄LA2157的cDNA為模板，采用Mi-long-up/Mi-long-low引物進行全長基因的分離，通過PCR擴增獲得1條單一的擴增條帶，大小約3 700 bp（圖1）。此前在對Mi-1基因進行克隆的時候，已經明確在該基因的分布區間存在多個序列大小相似的同源片段，因此還需對所獲得的條帶進行分析，確定擴增條帶為單基因還是多個基因組成。

圖1 Mi-1基因及Mi-9候選基因PCR擴增結果

圖2 Mi-1與Mi-9候選基因氨基酸序列比較結果

2.2 分離片段的比較分析

對擴增獲得的條帶進行回收和T3載體連接轉化，對轉菌后長出的大腸桿菌單克隆進行測序分析，確定該條帶中共包含2個基因片段，將這2個基因分別命名為2157-1和2157-3。對這2個序列進行測序分析，之后與Mi-1基因蛋白序列進行比較（圖2）。將基因2157-1和2157-3的翻譯蛋白序列2157-1蛋白與2157-3蛋白進行同源性分析，確定同源性為93.16%，與Mi-1基因氨基酸序列同源性分別為92.36%和97.22%。2157-1蛋白由1 252個氨基酸組成，2157-3蛋白和Mi-1蛋白均由1 257個氨基酸組成。

2.3 過表達重組載體的構建

分別利用2157-1、2157-3基因序列與T3連接的質粒為模板，采用CTC0414-1 NF/CTC0414-1 NR引物進行擴增，對擴增片段進行膠回收。同時回收BamHⅠ和SmaⅠ雙酶切后線性化的載體質粒pBI121（圖3）。之后將載體分別與膠回收后的2157-1和2157-3基因序列片段進行連接。

2.4 重組載體的檢測

用于檢測重組載體的引物nemjz-F/nemjz-R可以在基因5′端檢測外源基因與載體連接點。通過對轉化后菌斑的擴增，2157-1、2157-3基因序列與pBI121重組質粒轉化的大腸桿菌，均可以在900～1 000 bp間擴增出單一的條帶，理論擴增片段大小為988 bp（圖4），結果與預期吻合。為了進一步確定所得菌斑內質粒是否為陽性重組質粒，對上述PCR產物進行測序分析，結果證實為陽性重組質粒，至此完成了對候選基因片段過表達載體的構建。

圖3 In-Fusion重組載體構建過程中外源片段的擴增（a）及載體線性化（b）

圖4 重組載體菌液PCR檢測結果

3 結論與討論

番茄品種選育過程中往往將抗根結線蟲和抗另一種番茄毀滅性病害——番茄黃化曲葉病毒病的品種稱為雙抗品種，可見選育抗根結線蟲的番茄品種在育種中的重要性。根結線蟲一旦在某一地區發生，就很難根除。除了對番茄造成危害以外，黃瓜、甘藍、胡蘿卜等多種蔬菜均是根結線蟲的寄主（唐本安 等，2001；席先梅 等，2017）。選育抗病品種是最為根本、有效、環保的防治方法。但是番茄品種中目前所用的Mi-1基因在土溫高于28 ℃時就喪失了對該病害的抗性，造成番茄的減產。

隨著全球變暖的加劇，保護地連作障礙的加深，以及Mi-1對根結線蟲熱敏感的特性，對熱穩定抗根結線蟲基因在番茄品種中的應用需求日益迫切。通過前期材料篩選，獲得1份熱穩定抗根結線蟲的栽培番茄材料ZN17，通過基因定位將熱穩定抗病基因Mi-HT定位在番茄6號染色體Mi-1基因附近（Wang et al.，2013）。研究發現，熱穩定抗根結線蟲基因Mi-9也位于同一位點附近，通過病毒誘導的基因沉默技術，證實Mi-1、Mi-HT與Mi-9基因具有同源性。因此在對Mi-HT進行進一步研究中，就需要與Mi-9進行比較。本試驗根據Mi-1的序列信息，設計全長擴增引物，對Mi-9基因進行同源克隆，獲得了2個與Mi-1基因同源性很高的基因，為了研究這2個基因在高溫下對根結線蟲的抗性，將這2個基因分別與過表達載體pBI121進行重組載體的構建，為之后基因功能的分析奠定了基礎。Mi-9基因的克隆與功能分析，也將為闡明熱穩定抗根結線蟲機理的深入研究提供依據。

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Isolation of Heat-stable Candidate Gene Mi-9 for Resistance to Root-knot Nematode in Wild Tomato LA2157 and Construction of Over-expressive Vector

WANG Yin-lei1，2，CHEN Wei-nan3，ZHAO Li-ping1，2，ZHOU Rong1，2，SONG Liu-xia1，2，YU Wen-gui1，2，ZHAO Tong-min1，2*
（1Institute of Vegetable Crops，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，Jiangsu，China；2Key Laboratory for High Efficient Horticulture Crops Genetic Improvement of Jiangsu Province，Nanjing 210014，Jiangsu，China；3School of Horticulture and Plant Protection，Yangzhou University，Yangzhou 225009，Jiangsu，China）

Root-knot nematode disease is one of the important tomato soil-borne diseases．Breeding varieties with root-knot nematode resistance is an effective control method to deal with this disease．But at present，Mi-1 the only gene transferred to tomato culture with resistance to root-knot nematode loses its resistance when the soil temperature is over 28 ℃．In this study，wild tomato accession LA2157 with heat-stable resistance to root-knot nematode was used．According to the sequence information of Mi-1，we carried out homologous cloning on Mi-9 gene with heat-stable resistance to root-knot nematode and gained 2 candidate gene segments from LA2157．The candidate gene was ligated with the overexpression vector pBI121 by In-Fusion cloning technique．Electrophoresis and sequencing analysis proved that the recombinant vectors of the candidate gene were constructed．

Tomato；Root-knot nematode；Mi-9 gene；Homologous cloning；Over-experessive vector construction

王銀磊，男，副研究員，專業方向：蔬菜遺傳育種與生物技術，E-mail：yinleiwang@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：趙統敏，男，研究員，專業方向：番茄育種，E-mail：tmzhaomail@163.com

2017-08-25；接受日期：2017-09-30

國家自然科學青年基金項目（31401884），江蘇省自然科學青年基金項目（BK20140739）