豐富環境對血管性癡呆大鼠側腦室室管膜下區神經再生的影響①

賀旭，劉英飛，羅明英，成紹武，葛金文

·基礎研究·

豐富環境對血管性癡呆大鼠側腦室室管膜下區神經再生的影響①

賀旭1,2,3，劉英飛4，羅明英5，成紹武2,3，葛金文2,3

目的探討豐富環境(EE)對血管性癡呆大鼠側腦室室管膜下區(SVZ)神經再生的影響。方法29只大鼠分成假手術組(n=5)、血管性癡呆組(VD組，n=12)和豐富環境組(EE組，n=12)。采用兩血管阻斷法(2-VO)制作血管性癡呆模型。VD組和假手術組常規飼養條件下飼養，EE組給予豐富環境干預。30 d后免疫組織化學染色觀察SVZ微管相關蛋白Doublecortin(DCX)與外源性細胞增殖標記物BrdU的表達，免疫熒光雙標觀察SVZ DCX/Ki67、DCX/p-cAMP反應元件結合蛋白(CREB)的共表達情況。結果與假手術組相比，VD組BrdU+細胞數目(t=2.989,P=0.026)、DCX+細胞平均光密度值(t=3.069,P=0.005)增加；與VD組比較，EE組BrdU+細胞數目(t=3.067,P=0.027)、DCX+細胞平均光密度值(t=2.907,P=0.011)進一步增加。EE組DCX/Ki67(t=2.994,P=0.040)、DCX/p-CREB(t=4.707,P=0.009)共表達細胞高于VD組。結論豐富環境可通過CREB信號通路上調血管性癡呆大鼠SVZ神經再生水平。

血管性癡呆；豐富環境；室管膜下區；神經再生；大鼠

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是指由一系列如腦缺血等血管因素導致腦組織損害引起的神經功能損害，同時伴有認知功能減退為特征的神經退行性疾病[1]。公共流行病學調查資料顯示，VD發病率在所有癡呆類型中高居第二，僅次于阿爾茨海默病[2-4]。VD最顯著的特征是神經元的丟失和伴有認知功能的損害[5]。臨床實驗表明，藥物和免疫干預在降低輕度認知損害和癡呆等方面難以取得滿意臨床效果。側腦室室管膜下區(subventricular zone,SVZ)作為一個神經發生區域之一，貫穿于動物終生。VD后SVZ內源性神經干細胞增殖和分化，出現神經再生，但產生的細胞難以完全替代凋亡的細胞。因此，我們亟需尋找一種新的方法或手段延緩VD的發病進程。

豐富環境(enriched environment,EE)是指動物所生活空間環境變大，成員擴大以及內置新穎物體數量增加，表現為可提供多感官刺激、主動性運動及相互間社會交往機會。研究發現豐富環境干預可增加智力，延緩衰老，有益于腦缺血后小鼠運動功能的恢復，提高其社交功能[6]。Doublecortin(DCX)作為一種微管相關蛋白，表達在遷移的成神經細胞和未成熟神經元中，代表神經再生的水平[7-8]。豐富環境可以通過上調海馬突觸可塑性和促進梨狀皮質DCX的表達而改善癡呆大鼠的學習記憶[9-10]。但是關于豐富環境是否可促進VD大鼠SVZ神經再生鮮有報道。本研究通過二血管阻斷法建立VD模型，觀察豐富環境對VD大鼠SVZ的影響，探究豐富環境在VD大鼠中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

出生2個月左右、體質量(260±15)g的SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK(湘)2013-0004。動物房室溫保持(23±1)℃，相對濕度50%～55%，通風條件好，飼養于光照/黑暗為12 h/12 h的環境，自由飲水，定期更換墊料，給予標準飲食。

1.2 實驗儀器和試劑

冰凍切片機：英國Shan Don公司。Kopf腦立體定位儀：美國David KOPF Instruments公司。BX67熒光顯微鏡：日本OLYMPUS公司。鼠抗BrdU抗體，批號MCA2060：英國SEROTEC公司。羊抗DCX抗體，批號SC-8066：美國SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司。兔抗Ki67，批號：美國VECTOR公司。兔抗p-cAMP反應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)抗體，批號9198：美國CELL SIGNALING公司。生物素化山羊抗大鼠：武漢博士德公司。廣譜生物素化二抗：美國VECTOR公司。二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)：美國SIGMA公司。Alexa Fluor 488與Alexa Fluor 594偶聯驢抗兔及驢抗山羊IgG：美國INVITROGEN公司。

1.3 實驗方法

1.3.1模型建立

采用兩血管結扎法[10-11]永久性結扎大鼠雙側頸總動脈建立VD模型。所有大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，仰臥固定在Kopf腦立體定位儀上。去毛，碘伏消毒，從頸部一側做手術切口，分離頸總動脈和迷走神經，用7號手術線永久性結扎?？紤]到同時結扎雙側頸總動脈后，大鼠死亡率高，因此1周后，從頸部另一側做一切口，分離頸總動脈和迷走神經，永久性結扎。模型制作過程中盡量減少大鼠的痛疼和動物的使用數量。

假手術組(n=5)大鼠分離頸總動脈和迷走神經，但不結扎，術后常規飼養。

1.3.2實驗設計

對參與實驗研究的大鼠進行編號，根據隨機數字表法將大鼠隨機分成假手術組、VD組和EE組。VD組(n=12)每籠4只，常規飼養30 d；EE組(n=12)每天放入1.5×1.5×1.5 m的木質曠場進行豐富環境刺激8 h(8:30 am～16:30 pm)，共30 d。

豐富環境標準：提供標準鼠糧、水；放置各種顏色的管道及小球、塑料房子、小桶、滑輪及乒乓球等；曠場內的物品每天更換，同時用75%酒精擦洗；每天更換曠場內大鼠墊料和擦洗曠場內壁和地板，以消除大鼠留下來的氣味。

三組大鼠處死前7 d腹腔注射BrdU 50 mg/kg(終濃度50 mg/ml)，連續注射3次，每次間隔8 h。造模30 d后免疫組化觀察三組大鼠SVZ DCX+細胞，BrdU+細胞；熒光雙標觀察DCX/Ki67與DCX/p-CREB共表達細胞。

1.3.3腦組織標本的制備

10%水合氯醛3.5 ml/kg麻醉成功后，穿刺針從大鼠心尖部位插入直到主動脈，生理鹽水快速灌注沖洗血液，然后改用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(polyformaldehyde phosphate buffer,PF)灌注；取出鼠腦，4%PF后固定過夜；梯度沉糖(15%和30%各一遍)以防止冰晶出現；包埋。采用冠狀位切片，鄰片法：恒溫冰凍切片出現側腦室解剖結構時，先切1套12張厚30 μm腦片放入組織培養板，然后切取1套12張厚6 μm切片，接著棄取12×30 μm+12×6 μm組織，再收集下一輪腦片。其中免疫組織化學染色選用30 μm腦片，而免疫熒光雙標染色則采用6 μm腦片。

1.3.4ABC法免疫組織化學染色

0.01 mmol/L PBS(pH=7.3)漂洗腦片3次，每次10 min；3%H2O2處理30 min，漂洗3次，每次10 min；5%馬血清+0.1%tritonX-100(0.01 mmol/L)孵育2 h；加入羊抗DCX(1∶1000)4℃孵育過夜；漂洗3次，每次10 min；加入生物素化馬抗山羊IgG(1∶400)室溫孵育2 h；抗生物素蛋白-生物素復合物(ABC Kit)(1∶400)：A液與B液提前30 min混勻，室溫孵育2 h。DAB顯色，酒精脫水，二甲苯脫脂，中性樹脂封片。

鼠抗BrdU的實驗步驟：甲醇∶30%H2O2∶PB=7∶1∶2處理腦片15 min，消除內源性過氧化物酶；在65℃水浴鍋中使用50%甲酰胺∶檸檬酸鈉=1∶1進行抗原修復；2 N HCl處理組織30 min；0.01 mol/L Tris-HCl反應10 min；馬血清孵育后加入大鼠抗BrdU(1∶1000)4℃孵育過夜；加入生物素化馬抗大鼠IgG(1∶400)室溫孵育2 h，其他實驗步驟同前。

1.3.5免疫熒光組織化學染色

0.01 mol/L PBS洗滌3次，每次10 min；5%驢血清+0.1%tritonX-100磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)孵育2 h；加入山羊抗DCX(1∶1000)和兔抗Ki67(1∶1000)以及山羊抗 DCX(1∶1000)和兔抗p-CREB(1∶1000)，4℃過夜；0.01 mmol/L PBS-T溶液漂洗3次，每次10 min；Alexa Fluor 488與Alexa Fluor 594偶聯驢抗兔和驢抗山羊IgG(1∶400)孵育2 h；漂洗3次，每次10 min；雙苯酰亞胺(1∶5000)染核10 min；漂洗；貼片；50%甘油封片。

1.4 圖片分析

拍照時各組免疫組織化學和免疫熒光切片曝光度和像素保持一致。每套組化和熒光切片取相同的部位進行細胞計數?？紤]到SVZ DCX+細胞密集，因此采用NIH Image J計算平均光密度值(average optical density,AOD)。

1.5 統計學分析

采用Prism GraphPad 5.0進行統計分析和處理。實驗數據以(xˉ±s)表示，通過單因素或者配對Studentt檢驗比較組間差異。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 BrdU+

與假手術組相比，VD組BrdU+細胞數目增加(P＜0.05)。與VD組比較，EE組BrdU+細胞數目增加(P＜0.05)。見圖1、表1。

2.2 DCX+

DCX+細胞在大量聚集成團狀。見圖2。與假手術組相比，VD組DCX+細胞平均光密度值明顯增加(P＜0.01)。與VD組比較，EE組DCX+細胞平均光密度值進一步上升(P＜0.05)。見表1。

2.3 DCX/ki67

VD組和EE組的DCX細胞可經過側腦室下角遷移到紋狀體，并與內源性細胞增殖標記物Ki67發生共表達。見圖3。EE組DCX/ki67共表達細胞數高于VD組(P＜0.05)。見表1。

2.4 DCX/p-CREB

VD組和EE組的DCX細胞與核轉錄因子p-CREB有共表達。見圖4。EE組DCX/p-CREB共表達細胞數明顯高于VD組(P＜0.01)。見表1。

圖1 三組SVZ BrdU+細胞表達(免疫組織化學染色，bar=100 μm)

圖2 三組SVZ DCX+細胞表達(免疫組織化學染色，bar=100/50 μm)

圖3 VD組和EE組SVZ DCX/Ki67共表達(免疫熒光染色，bar=100 μm)

圖4 VD組和EE組SVZ DCX/p-CREB共表達的影響(免疫熒光染色，bar=100μm)

表1 三組SVZ BrdU+、DCX+表達及DCX與Ki67、DCX/p-CREB共表達情況

3 討論

豐富環境是指在生存環境和社會交往兩個方面相對于標準環境更加復雜的環境，具體表現為多感官刺激、自愿物理運動、社會性刺激及相互交往機會的增多。遭受物理損傷、化學傷害或者神經系統病變后，豐富環境均能上調嚙齒類動物或其他哺乳動物海馬的神經再生能力[12-15]。

VD發病機制涉及到腦血管因素引起腦組織缺血缺氧，進而造成神經元凋亡或丟失等病理改變[16]。我們之前的研究表明，豐富環境能通過促進梨狀皮質未成熟神經元的表達與分化，從而改善VD大鼠的學習記憶[10]。本次研究我們進一步觀察豐富環境對VD大鼠SVZ神經再生的影響。

DCX作為一種微管相關蛋白，起促進微管聚合的作用，表達在遷移的成熟神經細胞和未成熟神經元中，是成年神經再生的重要標記物，可以標記在有絲分裂后的神經前體細胞和未成熟神經元中，代表神經再生的水平[8,17]，常受外界環境刺激[18]或者正常行為經驗的調控[19]。BrdU作為胸腺嘧啶類似物，是外源性細胞增殖標記物，通常通過腹腔注射標記胚胎期和成年期分裂細胞的S期。

目前研究神經再生常聯合運用這兩種方法。本研究通過免疫組織化學染色觀察三組大鼠SVZ DCX+細胞和BrdU+細胞的表達情況。實驗結果顯示，VD組SVZ DCX+細胞和BrdU+細胞的表達較假手術組增加。這可能是因為正常成年大鼠SVZ的神經前體細胞處于“靜息”狀態，而兩側頸總動脈夾閉產生腦缺血環境，從而刺激和加速SVZ內源性神經前體細胞的增殖。給予VD大鼠豐富環境干預后，DCX+細胞和BrdU+細胞進一步增加。這表明豐富環境使VD大鼠腦內內源性神經前體細胞激活的現象更加明顯。

Ki67是一種核蛋白，是內源性細胞增殖標記物，可以發現于除了G0和早期G1階段外細胞周期的所有時期，在靜止期Ki67不表達[20]。免疫熒光雙標結果顯示，VD組和EE組均有DCX/Ki67細胞，且EE組共表達細胞高于VD組。這說明兩血管阻斷法制備的癡呆大鼠SVZ中有部分未成熟神經元處于細胞增殖階段，并且給予豐富環境干預后可以加速神經前體細胞的增殖。

CREB是一種重要的核轉錄因子，CREB信號通路被激活后可參與神經發育與再生、突觸可塑性及認知功能等多種生物學作用，體內外實驗均表明CREB信號通路參與了嗅球[21]、海馬[22-23]、SVZ[24]及吻側遷移流[25]的神經再生。本研究使用免疫熒光雙標技術觀察SVZ DCX/p-CREB的共表達情況，結果顯示EE組DCX/p-CREB細胞高于VD組。這表明豐富環境可通過CREB信號通路的磷酸化而調控VD大鼠SVZ神經再生。

綜上所述，豐富環境可以促進VD大鼠SVZ神經再生，加速VD大鼠SVZ神經前體細胞的產生及增殖，且豐富環境通過CREB信號通路調控VD大鼠SVZ神經再生。

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Effect of Enriched Environment on Neuroregeneration in Subventricle Zone of Rats with Vascular Dementia

HE Xu1,2,3,LIU Ying-fei4,LUO Ming-ying5,CHENG Shao-wu2,3,GE Jin-wen2,3
1.Department of Anatomy,Yiyang Medical College,Yiyang,Hunan 413000,China;2.Department of Integrated Traditional and Western Medicine,Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;3.Key Laboratory of Hunan Province for Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Prevention and Treatment of Cardio-Cerebral Disease,Changsha,Hunan 410208,China;4.Hospital Affiliated to Yiyang Medical College,Yiyang,Hunan 413000,China;5.Department of Human Anatomy,Kunming Medical College,Kunming,Yunnan 650500,China

GE Jin-wen.E-mail:40831556@qq.com

ObjectiveTo explore the effect of enriched environment on neuroregeneration in subventricle zone(SVZ)of rats with vascular dementia.MethodsAll rats were divided into sham group(n=5),vascular dementia group(VD group,n=12)and enriched environment group(EE group,n=12).Then,2-VO method was applied to make the vascular dementia model.The sham group and VD group

conventional breeding environment for 30 days,while EE group was subjected to enriched environment for 30 days.Immunohistochemistry was applied to detect the BrdU and Doublecortin(DCX)expression in SVZ,and DCX/Ki67,DCX/p-cAMP-response element binding protein(CREB)expression in SVZ was assessed by immunofluorescence double-labeling technique.ResultsCompared with the sham group,the number of DCX+cells(t=2.989,P=0.026)and BrdU+cells(t=3.069,P=0.005)increased in VD group,and increased more in EE group(t=3.067,P=0.027;t=2.907,P=0.011).Besides,the number of the DCX/Ki67(t=2.994,P=0.040)and DCX/p-CREB(t=4.707,P=0.009)cells was significantly higher in EE group than in VD group.ConclusionEnriched environment could up-regulate the neuroregeneration capacity in SVZ of rats with vascular dementia through CREB signal pathway.

vascular dementia;enriched environment;subventricle zone;neuroregeneration;rats

R749.1

A

1006-9771(2017)12-1384-06

[本文著錄格式]賀旭，劉英飛，羅明英，等.豐富環境對血管性癡呆大鼠側腦室室管膜下區神經再生的影響[J].中國康復理論與實踐,2017,23(12):1384-1389.

1.國家自然科學基金項目(No.81500377)；2.湖南省教育廳優秀青年課題(No.16B269)；3.益陽醫學高等專科學校引進高層次人才科研啟動費項目(No.2016-001)。

1.益陽醫學高等?？茖W校解剖教研室，湖南益陽市413000；2.湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南長沙市410208；3.中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南長沙市410208；4.益陽醫學高等?？茖W校附屬醫院內一科，湖南益陽市413000；5.昆明醫科大學人體解剖教研室，云南昆明市650500。作者簡介：賀旭(1984-)，男，漢族，湖南邵陽市人，博士，講師，主要研究方向：中藥在心腦血管疾病神經發生與神經再生的作用。通訊作者：葛金文(1965-)，男，漢族，湖南婁底市人，博士，教授，博士生導師，主要研究方向：腦血管病發病機制及中西醫結合防治研究和中西醫結合方法學研究。E-mail:40831556@qq.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.12.004

CITED AS:He X,Liu YF,Luo MY,et al.Effect of enriched environment on neuroregeneration in subventricle zone of rats with vascular dementia[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(12):1384-1389.

2017-06-30

2017-08-17)