槲皮素對高糖培養海馬神經元凋亡及Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響①

閆斌，王靖博，張宏，田國慶，劉玉琴

槲皮素對高糖培養海馬神經元凋亡及Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響①

閆斌1，王靖博1，張宏2，田國慶1，劉玉琴2

目的探討槲皮素對高糖培養海馬神經元凋亡影響的可能作用機制。方法新生24 h Sprague-Dawley大鼠，取海馬神經元原代培養，分為正常對照組、高糖組、槲皮素組、槲皮素+Akt抑制劑組和Akt激動劑組。各組在不同條件培養基中培養72 h后流式細胞儀檢測細胞凋亡率，Western blotting檢測各組神經元p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax蛋白表達。結果與正常對照組相比，高糖組細胞凋亡率明顯升高(P＜0.01)，p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明顯減少(P＜0.01)；與高糖組比較，槲皮素組、Akt激動劑組細胞凋亡率明顯下降(P＜0.01)，p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明顯升高(P＜0.01)。與槲皮素+Akt抑制劑組比較，槲皮素組細胞凋亡率明顯下降(P＜0.01)，p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明顯升高(P＜0.01)。結論槲皮素能夠減少高糖培養下海馬神經元的凋亡，其作用機制與增加Akt信號通路中Akt蛋白磷酸化的程度，進而增加Bcl-2蛋白的表達、抑制Bax蛋白的表達有關。

槲皮素；蛋白激酶B；高糖；海馬神經元；凋亡；大鼠

隨著世界糖尿病患病率逐年增加，糖尿病慢性并發癥給患者和社會帶來的負擔日益沉重，其中糖尿病認知功能障礙嚴重影響患者的學習記憶能力和執行功能，受到越來越多的重視。關于糖尿病認知功能障礙的發病機制，目前認為與高濃度的血糖水平在大腦神經元中通過滲透壓的改變、氧化應激、慢性高血糖導致晚期糖基化終末產物(advanced glycationend products,AGEs)等多種機制[1]，造成神經元損傷、海馬體結構發生變化有關[2]。這被認為是2型糖尿病患者較非糖尿病患者形成認知障礙、腦萎縮風險更高的原因之一。

菟絲子是臨床常用治療糖尿病認知功能障礙的藥物，槲皮素(quercetin)是菟絲子的有效成分。本實驗以原代培養海馬神經元為靶細胞，觀察槲皮素對高糖環境下海馬神經元凋亡及蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、p-Akt、B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)表達的影響，以期探討槲皮素對高糖培養海馬神經元的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級新生24 h Sprague-Dawley大鼠，體質量4～6 g，購自北京華阜康生物科技有限公司，許可證號SCXK(京)2009-0004。

1.2 主要試劑與設備

槲皮素，分子式C15H10O7，分子量302.24，純度99.1%，批號100081-201610：中國食品藥品檢定研究院。Akt信號通路抑制劑MK-2206 2HCl，分子式C25H21N5O·2HCl，分子量480.39，純度99.91%，貨號S1078：美國SELLECK公司。Akt信號通路激動劑SC79，分子式C17H17ClN2O5，分子量364.78，純度＞97%，貨號S7863：美國SELLECK公司。葡萄糖(Glu)：北京國藥集團化學試劑有限公司。DMEM-高糖、PBS：北京協和細胞資源中心。Neurobasal?-A、B-27?Serum-Free Supplement：美國 GIBCO 公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒：江蘇碧云天生物技術研究所。DAB顯色試劑盒：北京中杉金橋公司。

Fresco冷凍離心機：美國THERMO公司。TD5A-WS臺式低速離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。電泳儀、蛋白濕轉電轉儀：美國BIO-RAD公司。ImageQuant LAS 4000mini凝膠成像系統：美國GE公司。

1.3 方法

1.3.1主要溶液、試劑的配置

DMEM完全培養基：DMEM-高糖培養基180 ml加入胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(終濃度10%)、谷氨酰胺2 mmol/L、丙酮酸鈉1 mmol/L、Hepes 20 mmol/L、雙抗(青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 μg/ml)、神經生長因子(nerve growth factor,NGF)10 ng/ml，置4℃冰箱保存備用。

Neurobasal+B27培養基：Neurobasal?-A培養基100 ml加入B-27添加劑及L-谷氨酞胺(終濃度1 mmol/L)溶液2 ml混合均勻，置4℃冰箱保存備用。

槲皮素儲存液：微量天平稱取槲皮素15.11 mg，溶于DMSO 2.5 ml，充分混勻，0.22 μm濾器過濾，終濃度20 mmol/L，-20℃避光保存。

MK-2206 2HCl儲存液：微量天平稱取MK-2206 2HCl 5 mg，溶于DMSO 2.08 ml，充分混勻，0.22 μm濾器過濾，終濃度5 mmol/L，-20℃避光保存。

SC79儲存液：微量天平稱取SC79 5 mg，溶于DMSO 1.37 ml充分混勻，0.22 μm濾器過濾，終濃度10 mmol/L，-20℃避光保存。使用時用DMEM完全培養基稀釋儲存液至需要濃度。

1.3.2分組

正常對照組：Neurobasal+B27完全培養基(含25 mmol/L葡萄糖)。高糖組：在Neurobasal+B27完全培養基中添加葡萄糖，使培養基中葡萄糖終濃度為50 mmol/L。槲皮素組：高糖組培養基+0.01 μmol/L槲皮素。槲皮素+Akt抑制劑組：高糖組培養基+0.01 μmol/L 槲皮素+0.3 μmol/L MK-2206 2HCl。Akt激動劑組：高糖組培養基+5 μmol/L SC79。

1.3.3海馬神經元的分離、純化與培養

出生24 h新生鼠，75%酒精浸泡5 min，取出后置-20℃約3～5 min，分離腦內兩側海馬組織；用D-Hank氏液沖洗2次后將組織剪碎至0.5～1.0 mm3，加入0.25%胰蛋白酶37℃消化約20 min；觀察液體呈一定懸濁度即加入FBS終止消化，用200目細胞篩過篩，收集細胞懸液；將細胞懸液小心加入15 ml離心管中淋巴細胞分離液(與細胞懸液的比例1∶1.6)的上層，2000 r/min離心20 min，收集細胞層細胞；用D-Hank氏液重懸細胞，1500 r/min再次離心5 min；棄上清，用DMEM完全培養基30 ml重懸細胞，細胞計數后按一定的細胞密度接種于多聚賴氨酸(Poly-D-lysine,PDL)包被的培養瓶或培養板中。

1.3.4海馬神經元的鑒定

將細胞懸液以5×105/孔的濃度接種到預先放置了蓋玻片的6孔培養板中，培養72 h取出蓋玻片進行免疫熒光鑒定，共聚焦激光顯微鏡檢測非特異性酯酶(nonspecial esterase,NSE)的表達。取出蓋玻片，0.01 mmol/L PBS浸洗后加入4℃預冷的4%多聚甲醛常溫固定1 h；0.01 mmol/L PBS漂洗2 min，共3次，加入0.1%Triton-X100浸泡10 min；0.01 mmol/L PBS清洗2 min，共3次，加入山羊血清封閉液與非特異性蛋白結合，室溫孵育20 min；加入兔抗鼠NSE多克隆抗體(1∶10)，濕盒內37℃孵育1 h，陰性對照組以0.01 mmol/L PBS代替一抗；0.01 mmol/L PBS清洗2 min，共3次，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)偶聯山羊抗兔IgG(1∶50)，37℃濕盒避光孵育1 h；0.01 mmol/L PBS振洗5 min，共6次，加入苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)工作液封片；使用共聚焦激光顯微鏡進行檢測，所攝圖像以Leica Confocal圖像分析軟件分析，每組計數15～20個細胞。

1.3.5流式細胞儀檢測海馬神經元凋亡率

將細胞懸液以1.5×106/瓶的密度接種到預先用0.01%PDL包被的T25培養瓶中，每瓶接種6 ml。細胞生長至72 h，根據上述實驗分組，更換不同條件的培養基。72 h時棄掉原培養基，用D-Hank氏液輕輕清洗1次，棄上清。每個培養瓶加入0.05%胰酶-EDTA 3 ml，37℃消化約1 min。倒置相差顯微鏡下觀察，部分細胞突觸連接消失，細胞呈小圓形，浮起，即用吸管輕輕吹打細胞，加入FBS 1 ml終止消化，并將細胞懸液吸入15 ml離心管中。800 r/min離心5 min，棄上清。加入PBS 5 ml，重懸細胞。800 r/min再次離心5 min，棄上清。按照Annexi n-V-FLUOS試劑盒的說明，避光配置反應液。每組加入反應液100 μl，正常對照組另設立3個陰性對照組，即分別加入Hepes、Annexin-V-Fluos、PI各100 μl。各組避光反應15 min。每組加入PBS 1 ml，使用流式細胞儀檢測各組神經元，記錄結果。

1.3.6 Western blotting檢測p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax蛋白的表達

將待檢測的各組細胞樣本加入預冷RIPA裂解液，冰上孵育20 min，離心取上清，按照BCA蛋白濃度測定試劑盒的使用方法計算出各組蛋白濃度；根據目的蛋白的分子量加入等量2×SDS-PAGE加樣緩沖液，100℃加熱5 min使蛋白充分變性；冷卻樣品后，按順序將處理好的樣品加入濃縮膠加樣孔內進行SDS-PAGE電泳，分離蛋白；使用濕轉法將分離膠上的蛋白轉移到PVDF膜上，麗春紅染色觀察轉膜效果，對照marker，剪出膜上的目的蛋白及內參蛋白β-actin的條帶；將膜完全浸泡于3%BSA-TBST中，搖床上室溫封閉30 min，TBST洗膜；按照1∶1000稀釋一抗(p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax 和 β-actin)，將膜的封閉液吸盡后，立即加入稀釋好的一抗，室溫搖床上緩慢搖動孵育40 min，4℃過夜；第二天將膜室溫放置30 min，TBST洗膜3次，5%脫脂奶粉-TBST按1∶1000稀釋HRP山羊抗兔IgG(H+L)，加入二抗稀釋液，室溫輕搖40 min。將ECL發光液加到膜上后反應3～5 min，膠片曝光10～300 s，顯影2 min，定影。所攝圖像以LabWorks 4.6圖像分析軟件分析，記錄各組目的蛋白及內參蛋白的灰度掃描值，每組重復3次。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0統計軟件包分析處理。經One Sample Kolmoglrov-SmimovZ檢驗，數據符合正態分布，采用(xˉ±s)進行描述。多組獨立樣本比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 海馬神經元純度

NSE免疫熒光染色，倒置相差顯微鏡下觀察，所有細胞的胞核均被染成藍色，即該視野下細胞總數，胞漿和突起被染成綠色者為陽性細胞，即神經元(見圖1)。在共聚焦激光掃描顯微鏡下進行觀察并拍照，計算該視野下神經元和細胞總數

隨機取5個視野，經鑒定神經元純度為(96.5±1.2)%。

2.2 海馬神經元凋亡率

與正常對照組比較，各組神經元凋亡率均明顯增加(P＜0.01)；與高糖組比較，各組神經元凋亡率均明顯減少(P＜0.01)；槲皮素+Akt抑制劑組神經元凋亡率高于槲皮素組(P＜0.01)；與Akt激動劑組比較，槲皮素組凋亡率無顯著性差異(P＞0.05)。見表1、圖2。

表1 各組神經元凋亡率

2.3 海馬神經元p-Akt、Akt、Bcl-2和Bax的表達

與正常對照組比較，各組p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax均明顯減少(P＜0.01)；與高糖組比較，槲皮素組、Akt激動劑組p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax比值均明顯升高(P＜0.01)；與槲皮素組比較，槲皮素+Akt抑制劑組p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax的比值均明顯下降(P＜0.01)；與Akt激動劑組比較，槲皮素組Bcl-2/Bax的比值減少(P＜0.05)，p-Akt/Akt的比值無顯著性差異(P＞0.05)。見表2、圖3。

3 討論

Akt又稱PKB，是一種相對分子量為60 kDa的絲/蘇氨酸蛋白激酶，與PKA和PKC均有較高的同源性，故又稱為PKA與PKC的相關激酶(related to the A and C kinase,RAC-PK)。該激酶被證明是v-Akt的編碼產物，故又稱Akt。Akt位于多條信號通路的交叉點，包括絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/Akt信號通路、Jak激酶/信號轉導子和轉錄激活子(just another kinase/signal transducer and activator of transcription,Jak/Stat)信號通路、轉化生長因子-β/Smad蛋白(transforming growth factor-β/drosophila mothers against decapentaplegic protein,TGF-β/Smad)信號通路等，影響著細胞的存活、生長、增殖、凋亡、新陳代謝，提高細胞復制和存活能力，同時減弱生長阻滯和細胞凋亡[3]。Akt信號通路對細胞周期和基因表達起著重要的調控作用；通過與胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)、糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)[4]相互作用，對胰島β細胞的增殖起著重要作用；激活的Akt信號通路通過抑制tau蛋白、Bax、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-9)[5-6]抑制細胞的凋亡級聯反應；磷酸化的Akt還能下調叉頭轉錄因子O1(Forkhead box protein O1，FoxO1)的表達[7]，上調胰腺十二指腸同源盒1(pancreatic and duodenal homeobox 1,PDX-1)的表達，實現胰島β細胞再生。Akt信號通路受神經營養因子家族(neurotrophic factors,NTFs)、張力蛋白同源10號染色體缺失的磷酸酶基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)等影響，對神經細胞的凋亡[8-10]、代謝起著重要的作用。Akt信號通路通過調節叉頭轉錄因子(forkhead transcription factor,FKHR)有助于提高細胞存活率，調節哺乳動物雷帕霉素靶體蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)有助于增加蛋白的合成，影響神經突觸的生長和突觸可塑性的形成，這與學習和記憶密切相關[11]。體外細胞培養實驗證實，在高糖環境下，Akt信號通路受到明顯抑制，因此，Akt信號通路可能是糖尿病認知功能障礙的發生發展過程中的一個關鍵通路。

表2 各組海馬神經元p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax蛋白的灰度值以及p-Akt/Akt和Bcl-2/Bax值(×10-2)

圖1 大鼠海馬神經元(NSE免疫熒光染色，200×)

圖2 流式細胞儀檢測各組神經元凋亡

圖3 各組p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax和β-actin的Western blotting檢測結果

糖尿病認知功能障礙在中醫屬消渴病并發“呆癥”“健忘”的范疇?！妒備洝吩d“消渴日久，健忘怔忡”。消渴病本在腎，歷代醫家在針對消渴病治療時多以補腎填精益髓為法，應用菟絲子、淫羊藿、女貞子、枸杞子、紅景天等藥物。菟絲子味甘，性溫，歸肝、腎、脾經，屬補益藥，具有滋補肝腎，固精縮尿，安胎，明目，止瀉等功效?，F代研究發現，菟絲子含有樹脂甙和糖類，主要有效成分包括槲皮素，紫云(astragalin)，金絲桃甙(hyperin)及槲皮素-3-O-β-D-半乳糖-7-O-β-葡萄糖甙[12]。槲皮素是一種天然黃酮類化合物，研究發現其具有抗氧化[12]、抗腫瘤[13]、抗炎[14]、改善內皮功能、抗血小板聚集、提高人體免疫力等多種生物活性[15-16]。

為了研究槲皮素對高糖導致海馬神經元凋亡的保護機制與Akt信號通路的關系，選取SC79作為陽性對照組，MK-2206 2HCl作為Akt信號通路阻斷劑。SC79是能穿透血腦屏障的Akt磷酸化激活劑，具有降低神經元興奮性毒性、增加神經元存活的功能[17-18]；MK-2206 2HCl是Akt的高度選擇性抑制劑，屬于變構抑制劑，能抑制Akt T308和S473的自身磷酸化，MK-2206 2HCl還防止Akt介導的下游信號分子磷酸化[19]。

根據課題組既往試驗結果、查閱文獻及實驗前期結果[20-23]，設置各分組藥物濃度：槲皮素濃度0.01 μmol/L，Akt抑制劑濃度0.3 μmol/L，Akt激動劑濃度5 μmol/L。流式細胞儀檢測海馬神經元凋亡率，與正常對照組比較，高糖組海馬神經元凋亡率明顯增加；當在高糖培養基中加入槲皮素、Akt激動劑以后，凋亡率明顯下降，提示，槲皮素、Akt激動劑可以抑制高糖導致的海馬神經元凋亡；當槲皮素組中加入Akt抑制劑后，凋亡率明顯增加，槲皮素的抗細胞凋亡作用減弱，說明在該通路受到特異性抑制后槲皮素的作用失去了發揮途徑。同時，槲皮素組、Akt激動劑組的凋亡率差異無統計學意義，提示兩者在改善高糖引起的海馬神經元凋亡上的作用相似。Western blotting結果顯示，與正常對照組比較，高糖組p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax明顯下降；與高糖組比較，槲皮素組、Akt激動劑組p-Akt/Akt的表達均升高，提示槲皮素、Akt激動劑可以逆轉高糖對Akt蛋白磷酸化的抑制作用。進一步檢測Akt信號通路的下游效應分子(Bcl-2、Bax)顯示，槲皮素組、Akt激動劑組的Bcl-2/Bax都較高糖組升高；應用Akt特異性抑制劑后，槲皮素組p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax明顯下降，提示在Akt信號通路被阻斷后，槲皮素提高p-Akt/Akt、Bcl-2/Bax、保護海馬神經元的作用明顯減弱，可以推測，Akt信號通路是槲皮素的海馬神經元保護機制之一。此外，與Akt激動劑組比較，槲皮素組p-Akt/Akt比值無顯著性差異，提示槲皮素逆轉高糖抑制Akt蛋白磷酸化的效果與SC79相似。

綜上所述，我們認為，槲皮素能夠減輕高糖培養下海馬神經元的凋亡，其作用機制與增加Akt信號通路中Akt蛋白磷酸化的程度，進而增加Bcl-2蛋白的表達，抑制Bax蛋白的表達有關。

[1]Yamagishi S,Ueda S,Okuda S.Food-derived advanced glyca

tion end products(AGEs):a novel therapeutic target for various disorders[J].Curr Pharm Des,2007,13(27):2832-2836.

[2]Kerti L,Witte AV,Winkler A,et al.Higher glucose levels associated with lower memory and reduced hippocampal microstructure[J].Neurology,2013,81(20):1746-1752.

[3]Balzano D,Fawal MA,Velázquez JV,et al.Alternative activation mechanisms of protein kinase B trigger distinct downstream signaling responses[J].J Biol Chem,2015,290(41):24975-24985.

[4]Liu Y,Tanabe K,Baronnier D,et al.Conditional ablation of Gsk-3β in islet beta cells results in expanded mass and resistance to fat feeding-induced diabetes in mice[J].Diabetologia,2010,53(12):2600-2610.

[5]Tokutake T,Kasuga K,Yajima R,et al.Hyperphosphorylation of Tau induced by naturally secreted amyloid-β at nanomolar concentrations is modulated by insulin-dependent Akt-GSK3β signaling pathway [J].J BiolChem,2012,287(42):35222-35233.

[6]Calissano P,Malone C,Amadoro G.Apoptosis and in vitro Al-zheimer disease neuronal models[J].Cornmun Integr Biol,2009,2(2):163-169.

[7]Manning BD,Cantley LC.AKT/PKB signaling:navigating down stream[J].Cell,2007,129(129):1261-1274.

[8]Carracedo A,Pandolfi PP.The PTEN-PI3K pathway:of feedbacks and cross-talks[J].Oncogene,2008,27(41):5527-5541.

[9]李明明,李林林,季曉燕.神經生長因子治療周圍神經損傷的療效觀察[J].中國實用神經疾病雜志,2015,18(4):24-26.

[10]Aberg ND,Brywe KG,Isgaard J.Aspects of growth hormone and insulin-like growth factor-1 related to neruoprotection regeneration and functional plasticity in the adult brain[J].Scientific World J,2008,18(6):53-80.

[11]Horwood JM,Dufour F,Laroche S,et al.Signaling mechanisms mediated by the phosphoinositide PI3K/Akt cascade in synaptic plasticity and memory in the rat[J].Eur J Neurosci,2006,23(12):3375-3384.

[12]王敏,劉保林,國旭丹.槲皮素及其代謝物抑制氧化應激與炎癥[J].食品科學,2013,34(15):256-260.

[13]孫怡,顧君.槲皮素抑制乳腺癌細胞遷移侵襲及分子機制研究[J].中國中醫藥雜志,2015,40(6):1144-1150.

[14]李鴻佳.槲皮素通過TLR4/NF-κB信號調節哮喘氣道炎癥機制研究[D].濟南:山東大學,2015:21-24.

[15]孫涓,余世春.槲皮素的研究進展[J].現代中藥研究與實踐,2011,25(3):85-88.

[16]李敏.槲皮素及其糖苷衍生物蘆丁對心肌纖維化的抑制作用及機制研究[D].長春:吉林大學,2014:111-113.

[17]Hakryul J,Subhanjan M,Dewar T,et al.Small molecule-induced cytosolic activation of protein kinase Akt rescues ischemia-elicited neuronal death [J].PNAS,2012,109(26):10581-10586.

[18]So EY,Ouchi T.BRAT1 deficiency causes increased glucose metabolism and mitochondrial malfunction[J].BMC Cancer,2014,14(1):1-13.

[19]Chen X,Dai XX,Zou P,et al.Curcuminoid EF24 enhances the anti-tumour activity of Akt inhibitor MK-2206 through ROS-mediated endoplasmic reticulum stress and mitochondrial dysfunction in gastric cancer[J].Br J Pharmacol,2017.

[20]劉頔.ERK信號通路在高糖誘導的髓鞘化損傷中的作用及槲皮素、桂皮醛、水蛭素和單體組合對其影響的研究[D].北京:北京協和醫學院,2016:36-37.

[21]徐小涵.紅景天苷、葛根素對高糖培養SD大鼠海馬神經元凋亡的影響及其機制研究[D].北京:北京協和醫學院,2014.

[22]郭蕾蕾.筋脈通對高糖培養SD大鼠海馬神經元凋亡的影響[D].北京:北京協和醫學院,2012.

[23]王靖博.淫羊藿苷、槲皮素對高糖培養SD大鼠海馬神經元凋亡的影響及其機制研究[D].北京:北京協和醫院,2017.

Effects of Quercetin on Expression of Akt,p-Akt,Bcl-2 and Bax and Apoptosis of Hippocampal Neurons Cultured in High Glucose

YAN Bin1,WANG Jing-bo1,ZHANG Hong2,TIAN Guo-qing1,LIU Yu-qin2
1.Department of Traditional Chinese Medicine,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100730,China;2.Institute of Basic Medical Sciences,Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100730,China

TIAN Guo-qing.E-mail:gq-tian@163.com

ObjectiveTo explore the possible mechanism of quercetin on apoptosis of hippocampal neurons cultured in high glucose.MethodsHippocampus was obtained from newborn 24 hours Sprague-Dawley rats and then primarily cultured.Then hippocampal neurons were divided into normal control group,high glucose group,quercetin group,quercetin+Akt inhibitor group and Akt agonist group.After each group was cultured in different conditioned medium for 72 hours,they were detected the apoptosis of neurons with flow cytometry,and the expression of Akt,p-Akt,Bcl-2 and Bax with Western blotting.ResultsCompared with the normal control group,the apoptosis rate of hippocampal neurons increased significantly(P＜0.01),and p-Akt/Akt and Bcl-2/Bax decreased significantly(P＜0.01)in the high glucose group.Compared with the high glucose group,the apoptosis rates of hippocampal neurons decreased significantly(P＜0.01),and p-Akt/Akt and Bcl-2/Bax increased significantly(P＜0.01)in the quercetin group and the Akt agonist group.Compared with the quercetin+Akt inhibitor group,the apoptosis rate of hippocampal neurons decreased significantly(P＜0.01),and p-Akt/Akt and Bcl-2/Bax increased significantly(P＜0.01)in the quercetin group.ConclusionQuercetin could reduce the apoptosis of hippocampal neurons cultured in high glucose,which may be achieved by increasing the phosphorylation of Akt protein in Akt signal pathway,and then increasing the expression of Bcl-2 and inhibiting the expression of Bax.

quercetin;protein kinase B;high glucose;hippocampal neurons;apoptosis;rats

R587.1

A

1006-9771(2017)12-1390-07

[本文著錄格式]閆斌，王靖博，張宏，等.槲皮素對高糖培養海馬神經元凋亡及Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2017,23(12):1390-1396.

北京市中醫藥科技發展資金項目(No.JJ2015-68)。

1.中國醫學科學院北京協和醫學院北京協和醫院中醫科，北京市100730；2.中國醫學科學院基礎醫學研究所，北京市100730。作者簡介：閆斌(1991-)，男，漢族，山西新絳縣人，碩士研究生，主要研究方向：糖尿病及其慢性并發癥的中西醫結合防治。王靖博(1989-)，男，漢族，河南內鄉縣人，碩士，主要研究方向：糖尿病及其慢性并發癥的中西醫結合防治。閆斌和王靖博為共同第一作者。通訊作者：田國慶，男，博士，博士生導師，主要研究方向：糖尿病及其慢性并發癥的中西醫結合防治。E-mail:gq-tian@163.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.12.005

CITED AS:Yan B,Wang JB,Zhang H,et al.Effects of quercetin on expression of Akt,p-Akt,Bcl-2 and Bax and apoptosis of hippocampal neurons cultured in high glucose[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(12):1390-1396.

2017-08-21

2017-10-11)