炎癥因子在新生兒缺氧缺血性腦病大鼠腦組織中的表達(dá)及意義

曾志涌 盧順玉 黎云鵬

[摘要] 目的 探討炎癥因子在新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）大鼠腦組織中的表達(dá)及意義。 方法 36只新生SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血缺氧0 h、6 h、1 d、3 d、7 d組，每組6只。觀察各組大鼠腦組織中 TNF-α、CXCL10、CXCL12、 IL-1α、IL-1β、IL-1R mRNA表達(dá)差異。 結(jié)果 TNF-α在HIE發(fā)生后開(kāi)始增高，6～24 h達(dá)到高峰后逐漸下降，72 h仍高于正常，而后下降，但仍高于對(duì)照組，至7 d后呈現(xiàn)低表達(dá)。CXCL10/12在0 h時(shí)表達(dá)與對(duì)照組對(duì)比未見(jiàn)差異，在6 h及12 h達(dá)到高峰，至72 h逐漸下降但仍高于對(duì)照組，至7 d時(shí)基本降至正常。相對(duì)對(duì)照組，IL-1R 在整個(gè)HIE過(guò)程中未見(jiàn)明顯高表達(dá)，而在疾病的初期及恢復(fù)期其發(fā)病早期卻出乎意料的呈現(xiàn)低表達(dá)的特點(diǎn)（0 h、24 h、72 h），至7 d后恢復(fù)正常。IL-1α、IL-1β在0 h時(shí)期呈現(xiàn)低表達(dá)，6 h呈現(xiàn)高表達(dá)，而后在24 h后恢復(fù)正常，至7 d后IL-1α復(fù)又呈現(xiàn)低表達(dá)趨勢(shì)。 結(jié)論 炎癥因子與HIE發(fā)病進(jìn)展密切相關(guān)，并且在疾病的不同進(jìn)程中各種炎癥因子起著不同的作用，可以作為判斷疾病進(jìn)展的客觀指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 新生兒缺血缺氧性腦病；TNF-α；CXCL；白細(xì)胞介素

[中圖分類號(hào)] R722.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）28-0038-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of inflammatory factors in the brain tissues of neonatal rats with hypoxic-ischemic encephalopathy（HIE）. Methods 36 newborn SD rats were randomly divided into control group， and hypoxic-ischemic 0 h， 6 h， 1 d， 3 d， 7 d groups， with 6 rats in each group. The differences in the expressions of TNF-α， CXCL10， CXCL12， IL-1α， IL-1β and IL-1R mRNA were observed in the brain tissues of rats in each group. Results TNF-α was increased after HIE， peaked at 6-24 h and was then decreased， and was still higher than normal at 72 h， and was then decreased. However， it was still higher than the control group and showed low expression after 7 d. There was no difference in CXCL10/12 expression at 0 h compared with the control group， peaked at 6 h and 12 h， and was gradually decreased at 72 h but still higher than the control group. It was basically decreased to normal at 7 d. Compared with the control group， IL-1R did not show significant high expression during the whole HIE process. In the early stage of the disease and in the stage of recovery， it unexpectedly showed low expression （0 h， 24 h， 72 h） at the early stage of onset， and returned to normal after 7 d. IL-1α and IL-1β showed low expression at 0 h but turned to high expression at 6 h， and then returned to normal after 24 h， but IL-1α showed a low expression trend after 7 d. Conclusion Inflammatory factors are closely related to the progression of HIE， and various inflammatory factors play different roles in different processes of the disease， which can be used as an objective indicator to judge disease progression.

[Key words] Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy （HIE）； TNF-α； CXCL； Interleukin

新生兒缺氧缺血性腦病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）指圍產(chǎn)期新生兒因缺氧引起的腦部病變，主要由宮內(nèi)窘迫、新生兒窒息缺氧引起，是造成新生兒死亡和不同程度的智力低下、腦癱等神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙的主要原因[1，2]。HIE發(fā)病機(jī)制及腦損害后神經(jīng)重塑機(jī)制一直未明[3，4]。有研究證明，炎癥因子參與HIE的免疫損傷及神經(jīng)重塑，炎癥因子表達(dá)與疾病發(fā)展程度相關(guān)亦與神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度密切相關(guān)[5，6]。本研究采取更為準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)炎癥因子的表達(dá)及動(dòng)態(tài)觀察不同時(shí)間段的表達(dá)，為以后的臨床檢測(cè)、治療及下一步在分子學(xué)及細(xì)胞學(xué)研究提供研究基礎(chǔ)及可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

36只新生SD大鼠，雌雄不限，體重12～20 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK （粵）2013-002。隨機(jī)分為6組，即對(duì)照組、缺血缺氧0 h組、缺血缺氧6 h組、缺血缺氧1 d組、缺血缺氧3 d組、缺血缺氧7 d組，每組6只。

1.2 儀器和試劑

定量PCR儀、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR試劑盒（美國(guó)ABI公司）、引物合成（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 HIE模型建立 參照改良Rice-Vannuncci法[7]建立模型，在乙醚吸入麻醉狀態(tài)下，消毒切開(kāi)頸部皮膚分離右側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎剪斷，縫合切口，術(shù)后放入37℃恒溫箱中30 min，以1.5 L/min輸入含8% O2和92% N2的低氧氣源2.5 h。對(duì)照組僅給予假手術(shù)處理。

1.3.2 樣本采集 分別于造模后0 h、6 h、1 d、3 d、7 d處死大鼠，剪下頭顱，沿頭顱中線剪開(kāi)皮膚和顱骨，取出腦組織，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR 采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腦組織中炎癥因子mRNA表達(dá)。樣品抽提后，獲得的RNA溶液保存于-70°C。采用紫外吸收法對(duì)提取的RNA樣品進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳以檢測(cè)提取質(zhì)量。合成的互補(bǔ)脫氧核苷酸（complementary DNA，cDNA）用于實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)，進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)步驟：（1）cDNA第一鏈合成：從-80℃冰箱中取出RNA，在4℃下解凍，然后在0.2 mL PCR管中配制反應(yīng)溶液：5%RTBuff 4 μL；Enzyme Mix 1 μL；Prime Mix 1 μL；RNA template（0.5 μg）+H2O 14 μL。將PCR管置于37℃孵育15 min，98℃變性5 min，4℃保溫。（2）SYBR Green qPCR：在1.5 mL離心管中配置反應(yīng)混合液（96孔板）：2×SYBR Green PCR buffer 5 μL；Forward primer（10 μM） 0.5 μL；Reverse primer（10 μM）0.5 μL；template 5 ng；ddH2O約4 μL至總體積10 μL。將PCR管子置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，50℃孵育2 min，然后95℃，10 min；接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)（95℃，15 s；60℃，1 min），最后添加溶解曲線。為了建立PCR產(chǎn)物的溶解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后。引物序列見(jiàn)表1。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用方差分析、配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各樣品的目的mRNA和內(nèi)參（U6）分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)，數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

TNF-α在HIE發(fā)生后半小時(shí)內(nèi)開(kāi)始增高，6～24 h達(dá)到高峰后下降，72 h仍高于正常（P<0.05），但已下降明顯（P<0.05）卻仍高于對(duì)照組，至7 d后已經(jīng)呈現(xiàn)低表達(dá)（P<0.05）。CXCL10/12在0 h時(shí)表達(dá)與對(duì)照組比較未見(jiàn)差異，在6 h及12 h達(dá)到高峰，至72 h逐漸下降但仍高于對(duì)照組（P<0.05），至7 d時(shí)基本降至正常。相較對(duì)照組，IL-1R在整個(gè)HIE過(guò)程中未見(jiàn)明顯高表達(dá)，而在疾病初期及恢復(fù)期其發(fā)病早期卻出乎意料地呈現(xiàn)低表達(dá)的特點(diǎn)（0 h、24 h、72 h，P<0.05），直到后期7 d后才恢復(fù)正常。IL-1α、IL-1β在0 h時(shí)期呈現(xiàn)低表達(dá)（P<0.05），6 h呈現(xiàn)高表達(dá)（P<0.05），而后在24 h后恢復(fù)正常，但是至7 d后IL-1α復(fù)又出現(xiàn)低表達(dá)趨勢(shì)。缺氧初期（0 h）除了TNF-α和CXCL12高表達(dá)外（P<0.01），其他的炎癥因子呈低表達(dá)，而至HIE的高峰期（6 h、24 h）除外IL-1R的炎癥因子一致高表達(dá)（P<0.01）。見(jiàn)表2。

3討論

HIE是圍產(chǎn)期窒息導(dǎo)致的缺氧缺血性腦損害，HIE腦損害后免疫機(jī)制及神經(jīng)重塑機(jī)制一直并不明確，目前大量研究表明免疫損傷在HIE的致病中起著重要作用，免疫因子的表達(dá)也與神經(jīng)系統(tǒng)的損傷程度及疾病進(jìn)展密切相關(guān)。TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)活性的多肽調(diào)節(jié)因子[8，9]。可由單核細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元等分泌。在腦缺血缺氧、腦水腫等刺激下，TNF-α大量分泌并活化星狀細(xì)胞中的核因子κB（nuelear factor κB，NF-κB），后者與其他促炎性因子發(fā)揮協(xié)同作用，加重機(jī)體炎性損傷并進(jìn)一步促進(jìn) TNF-α的釋放，并可通過(guò)caspase途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，直接促進(jìn)神經(jīng)元萎縮和變性[10，11]。本研究結(jié)果顯示，TNF-α在HIE發(fā)生后半小時(shí)內(nèi)開(kāi)始增高，6～24 h達(dá)到高峰后逐漸下降，至7 d后基本恢復(fù)正常，其與HIE的疾病臨床進(jìn)展分期基本一致，可以用來(lái)判斷疾病的進(jìn)展及預(yù)后。CXCL趨化因子的主要作用是趨化細(xì)胞的遷移。CXCL10、CXCL11都屬于CXC家族的趨化因子，是淋巴細(xì)胞的高效趨化劑，能通過(guò)與CD4+T細(xì)胞上的CXCR3等結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞的趨化募集，對(duì)中性粒細(xì)胞則沒(méi)有趨化作用[12-15]。本研究結(jié)果顯示，CXCL10/12則主要在6 h及12 h達(dá)到高峰，說(shuō)明其可以作為判斷疾病的嚴(yán)重程度及炎癥反應(yīng)程度的指標(biāo)。白細(xì)胞介素-1家族（interleukin-1 family，IL-1F）有11個(gè)成員，IL-1α、IL-1β、IL-1R是其經(jīng)典家族成員，其受體、信號(hào)傳導(dǎo)和功能已經(jīng)得到了廣泛而深入的研究，是促炎性細(xì)胞因子，主要通過(guò)刺激炎癥和自身免疫病相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)環(huán)氧化酶2、磷脂酶A2、一氧化氮合酶、干擾素γ、黏附分子等效應(yīng)蛋白的表達(dá)，在免疫調(diào)節(jié)及炎癥進(jìn)程中扮演著重要角色[16-20]。本研究結(jié)果顯示，IL-1R全過(guò)程低表達(dá)，只有IL-1α、IL-1β在6 h時(shí)高表達(dá)，說(shuō)明HIE的炎癥反應(yīng)可能主要是INF及CXCL介導(dǎo)的。值得注意的是，除了TNF-α和CXCL12早期是升高的，其他的炎癥因子均表達(dá)下降，說(shuō)明TNF-α可以作為早期發(fā)病的指標(biāo)。

本研究結(jié)果提示炎癥因子基本表達(dá)規(guī)律為：HIE發(fā)生后除外TNF-α，其他炎癥因子就迅速開(kāi)始表達(dá)下降，而后迅速在6～24 h上升到達(dá)高峰，然后在72 h后逐漸下降，至HIE發(fā)生7 d后基本恢復(fù)正常，這些結(jié)果說(shuō)明炎癥因子參與的炎癥反應(yīng)貫穿著HIE的整個(gè)病程，并且不同的炎癥因子在因子過(guò)程可能扮演了不同的角色來(lái)參與炎癥過(guò)程，為我們下一步研究HIE的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)，可以更好的結(jié)合臨床及其表達(dá)的時(shí)間點(diǎn)來(lái)選擇研究動(dòng)物模型及患者的時(shí)間段，結(jié)合本研究結(jié)果，從炎癥因子的表達(dá)時(shí)間段來(lái)看0 h、6～24 h、72 h比較符合HIE臨床特點(diǎn)的研究切入點(diǎn)。由于大鼠和人的對(duì)應(yīng)時(shí)間不一致性，HIE模型鼠6～24 h大致和人HIE發(fā)生后3～7 d一致，眾所周知，HIE的腦水腫及炎癥疾病嚴(yán)重的最高峰正是3～7 d，我們發(fā)現(xiàn)6個(gè)炎癥因子除外IL-1R外普遍都在6～24 h高度表達(dá)，這與我們臨床觀察HIE患者在3～5 d是腦損害等臨床表現(xiàn)最為嚴(yán)重的臨床過(guò)程非常符合，提示我們應(yīng)重視在這個(gè)臨床階段進(jìn)行相應(yīng)的免疫治療。

綜上所述，炎癥因子與新生兒缺血缺氧性腦病發(fā)病進(jìn)展密切相關(guān)，并且在疾病的不同進(jìn)程中各種炎癥因子起著不同作用，可以作為判斷疾病進(jìn)展的客觀指標(biāo)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Xie B，Ping G，Wang W，et al. Therapeutic effects of human umbilical cord mesenchymal stem cells transplantation on hypoxic ischemic encephalopathy[J]. American Journal of Translational Research，2016，8（7）：3241-3245.

[2] Ahmed R，Temko A，Marnane W，et al. Grading hypoxic-ischemic encephalopathy severity in neonatal EEG using GMM supervectors and the support vector machine[J]. Clinical Neurophysiology，2016，127（1）：297-309.

[3] Hayes BC，Ryan S，Mcgarvey C，et al. Brain magnetic resonance imaging and outcome after hypoxic ischaemic encephalopathy[J]. J Matern Fetal Neonatal Med，2016， 29（5）：777-782.

[4] Reinboth BS，K？觟ster C，Abberger H，et al. Endogenous hypothermic response to hypoxia reduces brain injury：Implications for modeling hypoxic-ischemic encephalopathy and therapeutic hypothermia in neonatal mice[J]. Experimental Neurology，2016，283（2）：264-275.

[5] 耿淑霞，朱君麗， 田婷，等. 選擇性頭部亞低溫療法聯(lián)合鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子治療新生兒缺氧缺血性腦病的療效及其對(duì)氧化應(yīng)激水平和炎癥因子表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)婦幼保健，2017，32（15）：3542-3546.

[6] 果崇慧，楊青. 神經(jīng)節(jié)苷脂治療新生兒缺氧缺血性腦病對(duì)患兒血清炎癥相關(guān)細(xì)胞因子和MMP-9的影響[J]. 河北醫(yī)藥，2018，40（2）：219-223.

[7] 段淼，曹云濤，王旭芹. 促紅細(xì)胞生成素在缺氧缺血性腦病大鼠模型中的神經(jīng)保護(hù)作用[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2018，28（1）：28-32.

[8] 盛紅玲，姜元培，王保剛，等. 新生兒缺氧缺血性腦病血清TNF-α和IL-6動(dòng)態(tài)變化及臨床意義[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，37（10）：1322-1324.

[9] 李霞，程江霞，鮑磊，等. 右美托咪定對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β、NGF、BDNF表達(dá)的影響[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志， 2016， 20（1）：13-15.

[10] 朱娟，沙米村，喬繼冰，等. 高壓氧對(duì)缺血缺氧性腦病新生兒IL-1β、IL-6、TNF-α、Hcy、hs-CRP及其遠(yuǎn)期預(yù)后的影響[J]. 廣東醫(yī)學(xué)，2016，37（20）：3092-3094.

[11] 陳鳳飛. 新生兒缺氧缺血性腦病血清NSE與TNF-α、IL-6指標(biāo)檢測(cè)的臨床意義[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14（14）：1674-1676.

[12] 林秋萍，祝先進(jìn)，林青. CXC趨化因子配體10（CXCL10）在狼瘡腎炎中作用的研究進(jìn)展[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2016，32（1）：140-142.

[13] 郎杉，孫軍平，汪建新. CXCL10與CXCR3在ARDS中的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際呼吸雜志，2016，36（10）：796-800.

[14] 吳興，張海峰，強(qiáng)暉，等. 雷公藤內(nèi)酯醇抑制CXCL11的表達(dá)對(duì)重癥急性胰腺炎的影響[J]. 南通大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2013，33（1）：31-34.

[15] Lind L，Studahl M，Berg L P，et al. CXCL11 production in cerebrospinal fluid distinguishes herpes simplex meningitis from herpes simplex encephalitis[J]. Journal of Neuroinflammation，2017，14（1）：134-137.

[16] 程萬(wàn)芳，呂紅艷，李佳紅. 腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β對(duì)新生兒缺氧缺血性腦病的臨床診斷價(jià)值[J].中國(guó)婦幼保健，2016，31（22）：4750-4753.

[17] 陳秀麗，周朱瑛，李光乾，等. EV71腦炎患兒血清和腦脊液IL-1β、IL-1α的變化及臨床意義[J]. 實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2016，23（2）：154-157.

[18] Yoon DY，Dinarello，Charles A. Differential effects of anti-IL-1R accessory protein antibodies on IL-1α or IL-1β-induced production of PGE and IL-6 from 3T3-L1 cells[J]. J Biochem Mol Biol，2007，40（4）：562-570.

[19] 吳文旭，梁藝耀，黎清虎，等. 神經(jīng)節(jié)苷脂對(duì)缺氧缺血性腦病患兒新生兒腦損傷的治療效果分析[J]. 中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2018，8（14）：62-64.

[20] 王凌嘯，鄭錫銘. 缺血缺氧性腦病新生兒血清 IL-1β、IL-6和 TNF-α水平變化及其臨床意義[J]. 中國(guó)實(shí)用醫(yī)刊，2017，44（2）：72-74.

（收稿日期：2018-07-03）